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的方向转变,并在电脉冲电场方向的应用,提高质粒的基因转移在体外

Medicine

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Summary

基因转染,电是提高约两​​次脉冲的应用过程中改变电场方向时,细胞活力不受影响。基因转染的增加是由主管DNA进入细胞的膜面积增加。

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Pavlin, M., Haberl, S., Reberšek, M., Miklavčič, D., Kandušer, M. Changing the Direction and Orientation of Electric Field During Electric Pulses Application Improves Plasmid Gene Transfer in vitro. J. Vis. Exp. (55), e3309, doi:10.3791/3309 (2011).

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Abstract

基因electrotransfer是一种物理方法,用于提供短期和强烈的电脉冲,从而导致细胞膜不稳定的应用进入细胞的基因,使其渗透到小分子,并允许转让大分子如DNA。它代表了一个病毒载体,由于其安全性,有效性和易于应用。对于基因electrotransfer使用不同的电脉冲协议,以达到最大的基因转染,其中之一是在脉冲传递改变电场的方向和方位。改变电场方向和方向,增加主管DNA进入细胞的膜面积。在这段视频中,我们展示了基因electrotransfer疗效差异时所有的脉冲是在同一个方向,并交付,脉冲时,通过改变或者电场方向和方向交付。对于这个集成了电极和高电压的原型生成器,它允许在电脉冲的应用不同方向的电场变化的目的端,分别使用。基因electrotransfer疗效是确定的脉冲数量除以所有细胞表达绿色荧光蛋白与细胞的数量的应用后的24小时。结果表明,基因转染增加时,在电脉冲传递的电场方向改变。

Protocol

1。细胞培养,质粒和缓冲区,实验的准备

  1. 在这个实验中,使用中国仓鼠卵巢细胞(CHO - K1)。细胞是生长在一种营养混合物的HAM - F12辅以2毫米L -谷氨酰胺,10%胎牛血清,400μL/ L庆大霉素(所有自Sigma - Aldrich化学公司,Deisenhofen,德国),和1(PAA)的毫升/升crystacilin(Pliva公司,萨格勒布,克罗地亚)。细胞都保持在37 ° C,饱和湿度5%的CO 2,在孵化器的气氛为24小时。
  2. 放大质粒pEGFP - N1(Clontech公司Laboratories公司,山景,加利福尼亚,美国)编码大肠杆菌DH5α菌株绿色荧光蛋白(GFP)和隔离HiSpeed​​质粒马克西试剂盒(QIAGEN,Hilden的,德国)。质粒DNA的浓度(质粒在TE缓冲液溶解)应在260 nm分光光度计确定,并经凝胶电泳证实。
  3. 准备isoosmolar磷酸钠缓冲液(10毫米的Na 2 HPO 4,10毫米的NaH 2 PO 4,MgCl 2的 1毫米,250毫米蔗糖,pH值7.4)。
  4. 在实验当天准备由胰蛋白酶细胞悬液,用0.25%胰酶/ EDTA溶液(Deisenhofen,德国化学公司,Sigma - Aldrich公司)。离心机细胞5分钟在1000转(180 XG)4 ° C(Sigma公司,德国)和重悬细胞沉淀isoosmolar磷酸钠缓冲液到一个细胞密度为5 × 10 6细胞/ ml。

2。硬件设备

  1. 细胞暴露在枪头电场(图1)与集成电极连接到一个高电压的原型发电机。针尖与电极几何形状允许应用相对均匀的电场和电脉冲发生器允许在不同的方向传递。卢布尔雅那大学电气工程学院,生物控制论,在实验室开发的尖端和发电机。

图1
图1。垂直和水平(一)横截面和照片(B)与集成电极尖端吸管。在灰色的截面是用于塑料外壳和电极的黑色。集成了电极的枪头由四个圆棒电极。电极由不锈钢制成,其直径为1.4毫米,相邻电极相距1毫米,而相反的电极是2毫米。电极粘成并行的塑料尖,其适用的长度是30 毫米 2 。

3。基因electrotransfer协议

  1. 质粒pEGFP - N1的细胞悬液,在浓度为10微克/毫升。
  2. 为2-3分钟,在室温下孵育的混合物,在提出申请前电脉冲。
  3. ASPIRE 100μL细胞悬液与集成电极枪头。
  4. 为了达到最佳的基因electrotransfer疗效,并保持细胞活力,应使用最佳参数的电脉冲。在这个实验中,8矩形脉冲(每1毫秒,振幅225 V的重复频率为1 Hz的时间)的火车是适用于每个样本,使用高电压原型发生器。使用了两种不同的电场协议(图2):在第一个协议,所有的脉冲传递在同一个方向,而在第二个协议脉冲通过改变或者电场方向和方向交付。第二个协议只能使用适当的脉冲发生器,它允许应用程序在不同方向的电脉冲。
  5. 后立即脉冲的应用程序转移到6孔板枪头的细胞,并添加胎牛血清(FCS - 美国Sigma公司)(样本量的25%)。
  6. 5分钟的细胞在37 ° C至使细胞膜上再加盖印章。
  7. 每个样品中加入2毫升的HAM - F12在6孔,并在37 ° C孵育24小时的细胞在饱和湿度5%的CO 2在孵化器的气氛。

图2
图2电场的协议:(一)所有脉冲是在同一个方向传递,(二)脉冲传递改变或者电场方向和方向。

4。图像采集和测定基因electrotransfer疗效

  1. 基因electrotransfer疗效的细胞表达GFP的24小时后的脉冲应用程序的百分比确定。
  2. 使用与单色仪系统(彩瓷四,Visitron,德国)和排放量在507 nm处检测产生的488 nm的光激发荧光显微镜(在我们的例子中,AXIOVERT,ZR德国蔡司200)观察细胞。使用成像系统(MetaMorph成像系统,Visitr影像记录也可用于上,德国),但其他类似的数据采集软件。
  3. 收购至少5张图像放大20倍的目标(相衬和绿色荧光)。
  4. 计数相衬图像的细胞和细胞表达GFP绿色荧光图像。确定基因electrotransfer疗效的百分比除以细胞表达GFP的所有细胞,在每个相应的图像(图3)。

5。代表性的成果:

图3
图3时所有的脉冲是在同一个方向,并交付脉冲或者改变电场方向和方向,提出交付时表达GFP细胞的百分比。细胞暴露于列车的8个脉冲振幅225伏,持续时间为1 ms,重复频率为1 Hz。结果获得通过荧光显微镜。图中的每个值代表三个独立实验的±标准差的平均值。通过改变电场的方向和方向的细胞表达GFP增加的百分比。

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Discussion

基因electrotransfer是一个多功能的生物科技技术,使进入细胞的DNA转移,通过应用短,高电压电脉冲,并由于其安全性,有效性和易于应用的病毒载体,代表了更安全的替代。虽然在今天的基因electrotransfer被广泛用于转染所有类型的细胞和第一阶段的临床试验,使用这种方法,已报道4,底层的机制仍然没有完全理解。据了解,应用足够的实力来的细胞的电脉冲,导致跨膜电位的增加,从而引起不稳定5。细胞膜的通透性增加,否则nonpermeant分子进入细胞。许多参数描述6-9,从而影响基因electrotransfer的疗效,特别是不同的脉冲参数的应用程序进行了研究,以便更好地基因转移10-12。改变电场方向和方向的脉冲传递期间增加的面积因此增加可供转让DNA分子的主管领域的通透细胞膜 13 。结果表明,当电场方向和方向是在应用程序14改变细胞转移的基因表达的百分比增加。对于这一目的的电脉冲发生器,它允许应用程序在不同方向的脉冲,用1。我们使用的是与集成电极的脉冲发生器和枪头,在为了证明基因electrotransfer疗效的差异,当所有的脉冲传递在同一方向或脉冲时,通过改变或者电场方向和方向交付。转入绿色荧光蛋白基因表达的细胞的比例是评估24小时后,脉冲的应用和成功转染的细胞增加,当脉冲或者改变电场方向和方向(12%成活率80,8%± STD)交付在比较时所有脉冲被交付在同一方向(成活率76%± STD 16,2%)获得。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作得到了斯洛文尼亚的研究机构(项目,基建中心IP J2 - 9770 - 0510和程序P2 - 0249)。这个视频代表的“电穿孔技术为基础的技术和处理”的科学研讨会,并在斯洛文尼亚的卢布尔雅那大学电气工程学院举办的研究生课程,补充材料。作者还感谢Duša Hodžič请提供质粒DNA。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HAM-F12 PAA Laboratories E15-016 culture medium
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
fetal bovine serum PAA Laboratories A15-151
gentamicin Sigma-Aldrich G1397 antibiotic
crystacilin Pliva 625110 antibiotic
pEGFP-N1 Clontech Laboratories 6085-1 plasmid DNA
HiSpeed Plasmid Maxi Kit Qiagen 12662
Na2HPO4 Merck & Co., Inc. F640786 933
NaH2PO4 TKI Hrastnik 0795
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
sucrose Sigma-Aldrich 16104
trypsin/EDTA solution Sigma-Aldrich T4174
pipette tip Custom Made
electric pulse generator Custom Made
6 well plate Techno Plastic Products 92406
15 ml centrifuge tube Techno Plastic Products 91015
75 cm2 culture flask Techno Plastic Products 90076

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References

  1. Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
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  3. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
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