Author Produced

גזירת תרבויות Oligodendrocyte מועשר Neuron Oligodendrocyte / Myelinating משותף תרבויות מן שלאחר הלידה רקמות Murine

Neuroscience
 

Summary

מאמר זה מתאר שיטות להפיק אוכלוסיות מועשר Murine של תאים מבשר oligodendrocyte (OPCs) בתרבות העיקרי, אשר להבדיל לייצר oligodendrocytes בוגרת (OLS). בנוסף, דו"ח זה מתאר את טכניקות כדי לייצר Murine myelinating שיתוף תרבויות על ידי זריעת OPCs העכבר על המיטה neurite של הגב עכבר שורש עצב הגנגליון (DRGNs).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues. J. Vis. Exp. (54), e3324, doi:10.3791/3324 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

זיהוי המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח OL לא קריטי רק כדי לקדם את הידע שלנו על ביולוגיה OL, אבל יש גם השלכות להבנת בפתוגנזה של מחלות demyelinating כגון טרשת נפוצה (MS). פיתוח נייד הוא למד בדרך כלל עם מודלים תרבות העיקרית התא. תרבית תאים ראשונית מאפשר הערכה של סוג תא נתון על ידי מתן סביבה מבוקרת, ללא המשתנים זרים שנמצאים in vivo. בעוד תרבויות OL נגזר חולדות סיפקו כמות אדירה של תובנה בביולוגיה OL, מאמצים דומים הקמת תרבויות OL מעכברים כבר נפגש עם המכשולים העיקריים. פיתוח שיטות OLS תרבות Murine העיקרית היא הכרחית על מנת לנצל את קווי זמין עכבר מהונדס.

מספר שיטות להפקת OPCs מרקמות מכרסם תוארו, החל neurosphere גזירה, הדבקה טיהור דיפרנציאלי immunopurification 1-3. בעוד שיטות רבות מציעות הצלחה, רוב דורשות פעמים תרבות ענפה ו / או ציוד יקר / ריאגנטים. כדי לעקוף זאת, טיהור OPCs מרקמות Murine עם הסתגלות של השיטה המתוארת במקור על ידי מקארתי & דה Vellis 2 היא העדיפה. שיטה זו כרוכה פיזית OPCs הפרדת מתרבות גליה מעורבת שמקורם בקליפת המוח מכרסם הילוד. התוצאה היא האוכלוסייה OPC מטוהרים שיכול להיות מובחן לתוך התרבות OL מועשר. גישה זו מערערת בשל הזמן הקצר יחסית התרבות הדרישה מיותר עבור גורמי גדילה או נוגדנים immunopanning.

בעוד לחקור את המנגנונים של פיתוח OL בתרבות מטוהרים הוא אינפורמטיבי, הוא אינו מספק את הסביבה הרלוונטיות ביותר מבחינה פיזיולוגית להערכת היווצרות המיאלין נדן. Co-culturing OLS עם הנוירונים יעניק תובנה הבסיס המולקולרי ויסות OL בתיווך myelination של אקסונים. עבור רבים OL / נוירון שיתוף תרבות מחקרים, גנגליון השורש הגבי נוירונים (DRGNs) הוכיחו להיות סוג של נוירון בחירה. הם אידיאליים עבור תרבות בשיתוף עם OLS בשל הקלות שלהם ממוצא, כמות מזערית של זיהום תאים, היווצרות של מיטות neurite צפופה. בעוד שמחקרים באמצעות עכברוש / עכבר myelinating xenocultures פורסמו 4-6, בשיטה של גזירת כזה OL / DRGN myelinating שיתוף תרבויות מרקמות שלאחר הלידה Murine לא תוארה. כאן אנו מציגים שיטות מפורטות כיצד ביעילות תרבויות כאלה, יחד עם דוגמאות של התוצאות הצפויות. שיטות אלו יעילים לטיפול השאלות הרלוונטיות לפיתוח OL / פונקציה myelinating, הם כלים שימושיים בתחום מדעי המוח.

Protocol

הצהרת אתיקה

העכברים המשמשים בעבודה זו טופלו על פי המועצה הקנדית על טיפוח בעלי חיים (CCAC) הנחיות. אישור אתיות בניסויים שנערכו הושג מאוניברסיטת אוטווה Animal Care ועדת תחת פרוטוקול מספר OGH-119.

1. Dissection - קליפת עכבר בילוד עבור OPC מיצוי

  1. הקורבן P0-P2 העכבר בהתאם להנחיות מוסדיים.
  2. מנתחים את המוח ומניחים בצלחת פטרי המכילות קר כקרח ממ (ללא אנטיביוטיקה).
  3. מעבירים את המנה כדי מיקרוסקופ לנתיחה.
  4. באמצעות אזמל עם הצד המוח עד הגב, לעשות חתך רדוד sagittally לאורך הקצה המדיאלי ביותר של כל קליפת המוח (איור 1 א). חתך זה צריך רק לעבור את שכבת קרום המוח על מנת להקל הסרתו.
  5. שימוש במלקחיים היטה בסדר לקלף את קרומי המוח באופן רוחבי. אם נעשה בזהירות, שכבה זו ניתן להסיר בחתיכה אחת. במהלך שלב זה, להסיר את נורות חוש הריח.
  6. עם המוח הגחוני בצד למעלה, לעשות חתך עמוק sagittal שם בקליפת פוגש את האזור הגחוני של diencephalon (איור 1b).
  7. עם הגב המוח בצד למעלה, להפריד את קליפת המוח של המוח התיכון חטטניות על ידי רקמות המדיאלי אופנה לרוחב (איור 1 ג, ג "). הסר את כל שאריות קרומי המוח בשלב זה.
  8. כל הקוביות לתוך קליפת כ 4 חתיכות בעדינות להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 350 μL של המוח לכל עכבר ממ. שמור את הצינור על הקרח עד שכל העכברים עברו עיבוד.
  9. חזור על שלבים 1.1-1.8 עבור עכברים הנותרים.

2. דיסוציאציה של קליפת המוח בילוד ותחזוקה של תרבויות גליה מעורבת

הערה: המבוא של בועות לתוך ההשעיה תא יש להימנע במהלך כל השלבים הבאים.

  1. מוסיפים את צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל את מוח גזור טרי כדי אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים 3 דקות.
  2. העברת מוחות כדי ברדס רקמה סטרילית תרבות.
  3. בעדינות לעבור דרך הקורטקס קוביות טיפ פיפטה P1000 ליצירת שברים קטנים יותר. עצור pipetting פעם אין חתיכות מוח גדול מספיק כדי לשבש זרימה חלקה של השעיה דרך קצה פיפטה.
  4. הוסף 75 μL של פתרון papain OPC לכל המוח לתוך הצינור חרוטי. הפתרון papain OPC חייב להיות מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפני השימוש.
  5. דגירה של אמבטיה 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במים. בערך כל 2 דקות, להפוך בעדינות את הצינור כדי למנוע הצטברות רקמות. במהלך תקופה זו, להוסיף 5 מ"ל של מעורבות התקשורת בתרבות גליה זה פולי-L-ליזין (PLL) מצופה (1 מ"ג / מ"ל) T25 בקבוק (אחד לכל בקבוק במוח העכבר), וכן מקום 37 ° C רקמה תרבות החממה ב 8.5% CO 2.
  6. לאחר 20 דקות, להחזיר את ההשעיה רקמות למכסה המנוע סטרילית להוסיף 2 מ"ל של מעורבות התקשורת בתרבות גליה לכל המוח הצינור. בואו לשבת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר איון של הפתרון OPC papain.
  7. Aliquot רקמות ההשעיה לתוך צינורות פלסטיק 5 מ"ל. מספר צינורות צריך להתאים את מספר מוחות גזור, וכתוצאה מכך כ -2.5 מ"ל לכל צינור.
  8. שימוש סטרילי להבה זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר, בעדינות triturate רקמת בצינור אחד. Triturate לאט בהתחלה, ובהדרגה להגביר את מהירות כמו חתיכות לנתק. Triturate כ 10-15 פעמים, אולם מספר זה עשוי להשתנות בהתאם ליעילות של העיכול.

הערה: תחת, טחינה דקה תגרום עניים ניתוק של הרקמה, ואילו יתר טחינה דקה יהיה להשפיע לרעה על כדאיות התא. חשוב לא להכניס בועות לתוך הפתרון, כמו זה יהיה קשה להשפיע כדאיות התא.

  1. ברגע שאין גושים ברקמה גלויים שנותרו ההשעיה, להעביר צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 4 מ"ל של מעורבות התקשורת בתרבות גליה לכל המוח (כלומר, 4 מוחות = 16 מ"ל מעורבת התקשורת גליה תרבות).
  2. להפוך בעדינות צינור חרוטי 50 מ"ל וחזור במשך 5 צינורות הנותרים מ"ל.
  3. Aliquot ההשעיה תא אספו לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל (כ 6.5 מ"ל לכל שפופרת 15 מ"ל). מספר 15 צינורות מ"ל צריך להתאים את מספר מוחות גזור.
  4. צנטריפוגה צינורות ב 1200 סל"ד (~ 300 גרם) במשך 5 דקות.
  5. בזהירות לשאוב supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של מעורבות התקשורת חמים תרבות גליה אל צינור חרוטי 15 מ"ל כל אחד.
  6. לאט לאט resuspend את הכדור עם קצה פיפטה P1000, נזהר לא להכניס בועות. מוסיפים את ההשעיה תא מהצינור לכל בקבוקון מראש equilibrated T25 PLL מצופה, עיבוד הנפח הכולל של התקשורת תרבות מ"ל 6.
  7. מניחים את צלוחיות של תרבית רקמה חממה 3-4 שעות על מנת לאפשר לתאים לצרף המצע PLL. בצע שינוי התקשורת מלאה על ידי pipetting את התקשורת, והוסיף 6 מ"ל של מעורבות התקשורת טרי תרבות גליה על צלוחיות. צעד זה מסיר הרבה פסולתנגרמת על ידי טחינה דקה, ומקדם תרבות הכדאיות. אם OL / DRGN שיתוף תרבויות הם הרצויה, עיין בסעיף 3 של פרוטוקול זה.
  8. אחרי 3 ימים של תרבות, לבצע שינוי 2 / 3 על ידי הסרת התקשורת 4 מ"ל של התקשורת, והחלפת עם 4 מ"ל של מעורבות התקשורת טרי תרבות גליה. בשלב זה, monolayer astrocyte יש להרכיב על בסיס של צלוחיות.
  9. ביום 6, לבצע עוד 2 / 3 מדיה לשנות להשלים את צלוחיות עם ריכוז סופי של אינסולין מיקרוגרם / מ"ל ​​5. בשלב זה, monolayer astrocyte צריך להיות לעין, על גבי אשר OPCs יהיה מתרבים.

3. DRGN בידוד

הערה: כדי להפיק OL / DRGNs שיתוף תרבויות, DRGNs יש לקבוע יום אחרי דור מעורב תרבות גליה. שני הסוגים תרבות גדלים באופן עצמאי, בשילוב לאחר 9-10 ימים.

  1. הקורבן P5-P10 העכבר בהתאם להנחיות מוסדיים.
  2. חלץ את עמוד השדרה, ולהעביר בצלחת פטרי נקי.
  3. לחתוך כמו שרירים ועצמות הרבה מעמוד השדרה ככל האפשר (איור 1 ד ', ד), כמו זה יהיה להקל על דיסקציה של הגרעינים השורש הגבי (DRGs).
  4. מעבירים את עמוד השדרה כדי גזוז חדש צלחת פטרי הגחון למעלה בצד. בעזרת מספריים לנתיחה ולהתחיל caudally, לחתוך מדיאלית דרך עמוד השדרה בצורה אורכית.
  5. בעזרת שני זוגות מלקחיים, בעדינות לפרוץ את עמוד השדרה על מנת לחשוף את חוט השדרה.
  6. DRGs ניתן למצוא מתחת ו לרוחב בעמוד השדרה. בעזרת מלקחיים היטה בסדר, בעדינות להסיר את DRGs תוך הימנעות נזק בגרעיני (איור 1e).
  7. מעבירים את הסיר DRGs לפתרון שנאגרו קרים של האנק מלח (HBSS, ללא אנטיביוטיקה) בצלחת פטרי חדש. מבתר לשאוף לחלץ 40 DRGs לכל עכבר (איור 1f).
  8. לאחר DRGs הופקו, חתוך את כל השורשים של DRGs ארוך מדי (איור 1g, "ז) כדי למזער את ההקדמה של תאים מזהמים לתוך התרבות (ותאי גלייה, fibroblasts).
  9. מעבירים את DRGs לצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל 500 μL של HBSS קרח קר.
  10. צנטריפוגה ב 1200 סל"ד (~ 300 גרם) במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולה DRGs.
  11. העברת צינורות צנטריפוגות כדי ברדס רקמה סטרילית תרבות להסיר את HBSS מן הצינורות.
  12. הוספת 500 μL של טרום התחמם (20 דקות בשעה 37 ° C) DRG פתרון papain ו דגירה צינורות אמבטיה 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות במים. היפוך הצינורות כל 2 דקות כדי למנוע הצטברות רקמות.
  13. חזור על שלב 3.10.
  14. הסר את הפתרון papain DRG ולהוסיף 500 μL של (20 דקות בשעה 37 ° C) מראש חימם collagenase פתרון. מדגירים את אמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, כל 2 דקות היפוך.
  15. חזור על שלב 3.10.
  16. הסר supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של DRGN התקשורת. היפוך מספר פעמים צינור.
  17. חזור על שלב 3.10.
  18. חזור על שלב 3.16.
  19. מעיל סטרילי להבה זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר עם אלבומין בסרום שור (BSA) על ידי pipetting פתרון של BSA 0.25% ב מספר פעמים HBSS. הציפוי עם פתרון BSA תמנע DRGs מתוך דבקות קירות פיפטה מזכוכית.
  20. Triturate DRGs עם פיפטה BSA מצופה בעדינות בהתחלה, בעוצמה גוברת פעם גושים להתחיל dissociating. Triturate כ 10-15 פעמים, אולם מספר זה תלוי במידת העיכול, ומספר DRGs לכל צינור.
  21. לאחר ניתוק מושגת, להעביר את ההשעיה עד 50 מיקרומטר לסנן לתוך צלחת פטרי סטרילית המכילה 7 מ"ל של DRGN התקשורת. סינון יבטל הרבה של פסולת מן ההשעיה התא, למרות שצעד זה לא קריטי.
  22. דגירה צלחת פטרי ב 8.5% CO 2 כ 1.25 שעות.
  23. מספר Coat 12 מ"מ coverslips עם LN2 (10 מיקרוגרם / מ"ל ​​PBS) בצלחת 24-באר בתקופה זו הדגירה.
  24. לאחר דגירה נגמר, לשמור על צלחת פטרי תחת שדה בהיר. DRGNs מזוהים גדול, תאים גוף כהה שלב. מערבולת צלחת פטרי להרים בעדינות כל DRGNs דבק.

הערה: תאים מזהמים רבים יצטרכו דבק חזק צלחת פטרי, ובכך להעשיר את ההשעיה הסלולרי שלך עבור DRGNs.

  1. מעבירים את ההשעיה לתא צינור חרוטי 15 מ"ל. לשטוף בעדינות את המנה עם 4 מ"ל של DRGN התקשורת לאסוף כל DRGNs שיורית. העברת מ"ל נוספים עד 4 צינור חרוטי.
  2. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד (~ 300 גרם).
  3. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 500 μL של התקשורת DRGN טריים.
  4. לחשב את מספר DRGNs הניב באמצעות hemocytometer. הקפידו רק לספור את DRGNs, סוגי תאים אחרים לא. DRGNs ניתן לזהות על ידי גופים גדולים שלהם תא כדורי.
  5. זרעים 30,000-50,000 DRGNs כדי coverslip LN2 מצופה כל 1 מ"ל של DRGN התקשורת, מקום 37 ° C רקמה תרבות החממה ב -8.5% CO 2 לילה.
  6. למחרת בבוקר, לבצע שינוי התקשורת מלא על ידי החלפת DRGNהתקשורת עם התקשורת OL (מינוס CNTF) עם ריכוז סופי של 1% פן / סטרפטוקוקוס ו 10 FuDR מיקרומטר.
  7. בימים 3 ו - 5, לבצע 3 / 4 עם התקשורת לשנות את התקשורת כמו בשלב 3.30.
  8. ביום 7, לבצע שינוי בתקשורת מלא עם התקשורת OL (מינוס CNTF, פן / סטרפטוקוקוס, FuDR).
  9. ביום 9, DRGNs צריך יצרו מיטה neurite נרחב, וכעת הם מוכנים להיות שיתוף תרבותי עם OPCs.

4. טיהור OPCs מתרבויות גליה מעורבת להקמת OL מועשר תרבויות או OL / DRGN שיתוף תרבויות

  1. ביום 9 התרבות גליה מעורבת, כדי להעביר את צלוחיות שייקר מסלולית ב 5% CO 2 רקמות התרבות בחממה. מניחים את צלוחיות על גבי צלוחיות ריקות T25 למנוע החום שנוצר מן שייקר מסלולית מן להשפיע לרעה על תרבויות גליה מעורבת. אפשר התרבויות לאזן את זה חממה חדשה עבור 1 שעה.
  2. לאחר צלוחיות יש equilibrated, לנער את צלוחיות בסל"ד 50 דקות 45. מטרת לנער הזה היא להסיר את כל התאים לזהם חסיד רופף מ monolayer.
  3. הזז תאים בתרבית רקמה ברדס ולהסיר את כל אמצעי התקשורת מן הבקבוקים. החלף עם 4 מ"ל של מעורבות התקשורת טרי תרבות גליה בתוספת 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין.
  4. מניחים את צלוחיות בחזרה אל שייקר, ומאפשרים לאזן במשך כ 3 שעות.
  5. לאחר צלוחיות הם equilibrated, להדק אותם היטב שייקר מסלולית, ולנער צלוחיות במשך כ 16 שעות 220 סל"ד (לילה).
  6. למחרת בבוקר, אם OLS יש גדל בהעדר DRGNs (כלומר, OL מועשר התרבות), מספר מעיל סטרילי 12 מ"מ coverslips עם LN2 (10 מיקרוגרם / מ"ל PBS) במשך שעה 1. מעבירים את coverslips ל 24 גם כלים, לשטוף עם PBS ואחריו לשטוף התקשורת OL. הוסף 1 מ"ל של התקשורת OL היטב כל לאזן ב 8.5% CO 2.
  7. לאזן 10 ס"מ רקמות מנות תרבות 5% CO 2 למשך 30 דקות. מנה אחת תידרש לכל 2 צלוחיות. אלה ישמשו את העשרת הידבקות-ההפרש של OPCs תנאי.
  8. לאחר 30 דקות איזון תקופת עבר, להעביר את התקשורת מן צלוחיות מזועזע אל הכלים. כל מנה צריכה לקבל מדיה 2 צלוחיות, שווה כ -8 מ"ל של השעיה תא לכל צלחת 10 ס"מ.
  9. דגירה את הכלים בריבית של 5% CO 2 למשך 30 דקות, תוך מתן דחיפה קלה על סימן 15 דקות. דחיפה זה יעזור למנוע OPCs מתוך דבקות צלחת 10 ס"מ.
  10. לאחר דגירה תושלם, לבחון את הכלים תחת שדה בהיר. OPCs מזוהים גושי תאים קטנים, בדרך כלל של 3-5 תאים אבל לפעמים בצורת אגרגטים גדול הדומה neurospheres. רבים שאינם OL תאים השושלת צריך להיות דבק בתקיפות לבסס את הצלחת. בעדינות מערבולת הצלחות לנתק כל OPCs דבק רופף, ולהעביר את ההשעיה התא כל צלחת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
  11. צנטריפוגה ב 1200 סל"ד (~ 300 גרם) במשך 5 דקות.
  12. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של התקשורת OL עם קצה פיפטה P1000, ואחריו resuspension עם קצה פיפטה P200.
  13. ספירת התאים באמצעות hemocytometer.
  14. בשביל מועשר-OL תרבויות, זרע 25,000 - 50,000 OPCs זה coverslip 12 מ"מ מצופה LN2 בנפח סופי של 1 מ"ל התקשורת OL.
  15. עבור OL / DRGN שיתוף תרבויות, לבצע התקשורת OL מלא (מינוס CNTF) שינוי על DRGNs ממדור [3], בעדינות להוסיף 50,000 תאים ההשעיה OPC מועשר התא. שימו לב שלא לשבש את המיטה neurite DRGN במהלך תוספת של OPCs.
  16. המקום התרבויות 37 ° C החממה ב 8.5% CO 2, ולהימנע עד הסרת קיבוע. OPCs Murine רגישים לשינויים ב-pH, והסרה של החממה תשנה את ה-pH של התקשורת OL. כן, יש לציין, תוספת של DH 2 O ל בארות ריק סביב בתרביות תאים ימנע אידוי של התקשורת והתרבות, ובכך ממזערת את תנודות מומסים בתוך ריכוזי התקשורת OL. זה יספק סביבה עקבית יותר עבור OPCs.

5. עיבוד של תרבויות עבור מיקרוסקופיה immunofluorescence

  1. תקן תרבויות עם מתנול 100% ב -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, או 3% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  2. Permeabilize coverslips עם 0.1% Triton-X-100 במשך 10 דקות, לשטוף עם פוספט שנאגרו לחסום מלוחים (PBS) וכן במשך שעה 1 בסרום עיזים 10%.
  3. Coverslips דגירה עם נוגדנים העיקרי מדולל חסימת פתרון בן לילה ב 4 ° C.
  4. לשטוף coverslips 3 פעמים עם PBS, ו דגירה עם Alexa-פלואוריד נוגדנים משני מצומדות (Invitrogen) מדולל חסימת פתרון 45 דקות.
  5. Counterstain עם 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ולשטוף coverslips מספר פעמים עם PBS.
  6. הר coverslips ב DAKO פלורסנט הרכבה בינונית.
  7. ניתוח שקופיות באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence. בפרוטוקול זה, מגלשות נותחו גם עם Axiovert Zeiss פלואורסצנציה 200 מיליון הפוכהמיקרוסקופ או 510 LSM Zeiss לייזר META סריקת מיקרוסקופ confocal.

6. תאים שלמים חלבון חילוץ מתוך OL מועשר תרבויות

  1. הסר 24 גם תרבויות מן החממה מגניב על קרח דק 3.
  2. מוציאים בזהירות התקשורת, ולהוסיף 10-20 μL של חיץ תמוגה (50 mM טריס-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, deoxycholate נתרן 0.5%, 1% Triton-X-100, עם pepstatin 0.1%, aprotinin, PMSF, leupeptin, orthovanadate נתרן) היטב לכל (מינימום של 8 בארות לפי המדגם הוא הציע).
  3. גרדו בארות שימוש רחב נשא P1000 קצה פיפטה, ולהעביר את lysate אל צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל.
  4. במעבר lysate באמצעות מזרק ½ בקוטר 30 כ -15 פעמים, צמרמורת על קרח למשך 30 דקות.
  5. צנטריפוגה צינורות בסל"ד 14,000 (~ 20,000 ז) במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  6. העברת supernatant לצינורות צנטריפוגות חדשות, חנות ב -80 ° C.

7. SDS-PAGE ניתוח על חלבון מועשר-OL תרבות

  1. פתור 30 מיקרוגרם חלבון לכל מדגם בהפחתת חיץ ידי-SDS על תקן acrylamide מרובה ג'לים 12%.
  2. חצי יבש העברת ג'ל על ממברנות PVDF.
  3. ממברנות חסום במשך שעה 1 ב 5% אבקת חלב רזה TBST (10 mM טריס-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20).
  4. דגירה ממברנות עם נוגדנים העיקרי מדולל חסימת פתרון לשעה 1.
  5. לשטוף ממברנות 3 פעמים עם TBST עבור 10 דקות.
  6. דגירה הממברנות עם HRP-מצומדות נוגדנים משני דקות 45 בחסימת פתרון.
  7. לשטוף ממברנות מספר פעמים עם TBST ו דגירה עם Amersham ECL פלוס מגיב המערבי זיהוי סופג (GE Healthcare) עבור 5 דקות.
  8. זיהוי להקות חלבון עם סרט רגיל הדמיה מדעית.

8. נציג תוצאות:

בפרוטוקול זה, OPCs מורחבות על monolayer astrocyte בתרבות גליה מעורבת. תרבות זו גליה מעורב נגזר קליפת P0-P2 עכבר הילוד. באותו יום 1 במבחנה (DIV1), תרבות גליה מעורב מכיל תאים עם מורפולוגיות שונות כפי שניתן לראות במיקרוסקופ על ידי שלב ניגודיות (איור 2 א). בשלב DIV3, monolayer astrocyte מתחילה להיווצר על בסיס של הבקבוק, ועל DIV8, OPCs ניתן להבחין בבירור על פני השטח monolayer. בשלב DIV9, OPCs מתרבים הגיעו צפיפות מספיק להיות מטוהרים ידי ניעור מהיר לילה מסלולית. לאחר סיום תהליך הטיהור הושלם, התוצאה היא אוכלוסייה OPC מועשר התא. בשלב טיהור DIV1 פוסט, OPCs יש מורפולוגיה פשוטה, הרחבת מספר תהליכים (איור 2b). בשלב טיהור DIV3 לפרסם, תאים הרחיבו meshwork מורכב של תהליכים, מזכיר OLS בשלה. בשלב טיהור DIV6 לפרסם, OLS מטוהרים יש משוטח מוקרן עלון מבנים דמויי קרום. התפתחות זו מורפולוגיים אופייני של הבשלה חוץ גופית של OLS.

מיקרוסקופיה immunofluorescence מציין את התאים מטוהרים הם OL-השושלת (איור 3a). Seeded OPCs בתחילה להביע כונדרואיטין סולפט proteoglycan (NG2), ולהתפתח גליקופרוטאין המיאלין הקשורים (הפצ"ר) OLS בשלה חיובית תוך זריעת שלושה ימים שלאחר (איור 3 ב). בשלב DIV6, OLS רבים להביע חלבון המיאלין הבסיסי (MBP), וכן בעלי מורפולוגיה אופיינית OL בוגרת. OL-שושלת תאים אחוז היו לכמת בנקודות זמן שונות כדי לקבוע את טוהר התרבויות OL מועשר (איור 3c). בשלב טיהור DIV1 לפרסם, תרבויות הם 50 ± 14% NG2 + OPCs יש, עם יש או אין MAG + MBP + OLS יש. זה מצביע על מטוהרים OL-שושלת תאים הנמצאים בשלב מקדים בזמן זריעה, עם מספרים זניחים של OLS מובחן. בשלב DIV3, OLS רבים הבדיל לתוך תאים MAG + ve (24 ± 5.9%) בעוד כמה שומרים על הפנוטיפ מבשר, ולהישאר NG2 + (13 ± 8.0%). בשלב DIV3, חלק קטן MAG תאים + ve (3.2 1.2%) הם גם להביע MBP. בשלב DIV6, 20 ± 5.9% של OLS הם MAG + ve תוך 12 ± 7.3% להתמיד כמו NG2 + OPCs יש. בנוסף, 21 ± 9.3% של תאים בתוך התרבות הם MBP + OLS יש בנקודה זו בזמן. SDS-PAGE הניתוח מראה את הביטוי מדורגת של 2'3'-מחזורית-נוקלאוטיד 3'-phosphodiesterase (CNP) ו MBP לעומת התקופה והתרבות 6 יום, עוד הוכחת היכולת של OPCs בתרבות כדי סופני להתמיין OLS בוגרת (איור 3D ). ביחד, נתונים אלה קובע בשיטה זו כאמצעי לייצור מערכת OL מועשר התרבות מתאים ללימוד התבגרות OL מ OPCs.

פרוטוקול זה גם מתאר שיטות להקים OL / DRGN שיתוף תרבויות באמצעות Murine בלבד מקורות רקמות. עם זאת, על מנת לייצר שיתוף תרבות, DRGNs צריך קודם להיות מתורבת לבד כדי לייצר רשת neurite הולם. שלאחר הלידה אלה תרבויות נוירון Murine גדלים במשך 9 ימים בתקשורת בסרום נמוך עם תוספת של 10 מיקרומטר FuDR כדי למנוע התפשטות של זיהום fibroblasts ו gl ial תאים. במהלך 9 ימים במבחנה, DRGNs מבודד לייצר מיטה neurite צפופים (איור 4 א). זו המיטה neurite הוא immunopositive עבור neurofilament סמנים עצביים 200 (NF) ו Tuj1 (איור 4 ב). בשלב זה, OPCs מטוהרים ניתן להוסיף מיטות neurite, ותרבותי עבור 6 ימים נוספים כדי לייצר myelinating שיתוף תרבויות.

בשלב DIV6 של OL / DRGN שיתוף תרבות, MBP רבים + OLS ve ניתן להבחין בין + יש neurites NF DRGN (איור 5 א). לאחר בחינה מדוקדקת יותר, הם עדות לכך OLS ליצור קשר עם neurites DRGN רבים, לעתים קרובות ensheathing אותם עם MBP + יש קרום (איור 5 ב, ג).

איור 1
באיור 1. מיקרוסקופ Dissection תמונות של היבטים מסוימים של קליפת המוח בילוד עכבר ובידוד DRG. (א) להציג הגבי של המוח חילוץ טרי עכבר הילוד. קווים מקווקווים מצביעים על האזור שבו חתכים חייב להיעשות כדי להקל על הסרת שכבת קרום המוח. (ב) להציג הגחוני של המוח, קווים מקווקווים מצביעים על האזור שבו בקליפת פוגש את diencephalon הגחון. חתכים עמוקים חייבת להתבצע לאורך הקווים המקווקווים לסייע בבידוד של קליפת המוח. (C-c ') תיאור חזותי של כמה לחטט קליפת הרחק יתרת המוח. (ד) מבודדים טרי P5-P10 עמוד השדרה העכבר לפני זמירה משם עודף שרירים ועצמות (ד '). (ה) מיקום DRGs בתוך עמוד השדרה. (ו) המספר המשוער של DRGs כי יש לבודד עכבר אחד. (ז) DRG עם שורשים ארוכים שדורשים זמירה לפני עיכול אנזימטי. הקו המקווקו מציין את האזור בו שורשי צריך להיות trimmed. (ו ') הודעה DRG שורש זמירה.

איור 2
איור 2. OPCs מורחבות בתוך התרבות גליה מעורבת, מטוהרים, הבדיל לאחר מכן כתרבות OL מועשר. (א) בניגוד שלב תמונות של תרבויות גליה מעורבים בשלבים שונים של פיתוח. בשלב DIV1, תאים להופיע בסיבוב עם תאים שטוח מעט. ריבוד של התרבות גליה מעורבת מתחיל DIV3, שם צורה האסטרוציטים monolayer אחיד בבסיסו של הבקבוק, שעליו OPCs להתרבות. OPCs רבים נתפסים על DIV8 (חיצים) דבקה פני השטח של monolayer astrocyte. (ב) לאחר מטוהרים מן התרבות גליה מעורבת, DIV1 OPCs הרחיבו רק מספר תהליכים. בשלב DIV3, תאים הרחיבו תהליכים רבים, מזכיר ביניים בשלב OLS. בשלב DIV6, OLS שטוח (כוכבית) נראה יצרו גיליונות קרומי (קו מקווקו). סולם ברים, 50 מיקרומטר.

איור 3
איור 3. אפיון של התרבות OL מועשר. (א) תמונות של Confocal OLS מבודדת בשלבים שונים של פיתוח. NG2 + OPCs יש יש מורפולוגיה פשוטה, בעוד MAG + OLS יש להחזיק תהליכים arborous מרובים. MBP + OLS יש הרחיבו קרומי מיאלין כמו סדינים. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. (ב) מטוהרים OL-שושלת תאים שמקורם ככל OPCs ו להתמיין MAG + ve, MBP OLS + יש מעל DIV 6. בשלב DIV1, OPCs כל NG2 + ve, בעוד שאף הם MAG + ve או MBP + ve. בשלב DIV3, MAG + ve ו MBP כמה + OLS יש כיום ברור. רוב OLS הם MAG ו MBP יש + ב DIV6, עם NG2 שנותרו + OPCs יש. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. (ג) ממוצע ערכים ± סטיית תקן של OL-שושלת תאים אחוז בשלבים שונים של פיתוח מעל DIV 6. בשלב DIV1, כל OL-השושלת תאים NG2 +, יש החשבונאי 50 ± 14% של תאים הכולל בתרבות. בשלב DIV3 ו DIV6, OL-השושלת תאים בהתאמה בחשבון 36 ± 6.8% ו - 32 ± 8.4% של תאים הכוללת, המורכבת משתנות הפרופורציות של NG2 + ve, MAG + ve ו MBP + OLS ve.) ד (SDS-PAGE שבוצעה על חלבונים שמקורם מועשר-OL תרבויות הוכחת ביטוי מדורגת של OL-סמנים CNP ו MBP במהלך תקופת 6 תרבות DIV.

איור 4
איור 4. אפיון של זריעת מראש OPC תרבות DRGN. (א) שלב תמונות ניגודיות של DRGNs במהלך התקופה 9 DIV תרבות טרום OPC זריעה. DRGNs מקורן כמו גדול גוף תאים עם כמה תהליכים, לייצר רשת neurite מורכבים יותר ויותר. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. (ב) תמונות Confocal של תרבויות DRGN קבוע DIV9 (טרום זריעה OPC) ומוכתמת עבור נוירון הסמנים הספציפיים Tuj1 ו NF200. DRGNs יצרו רשת neurite שעליו OPCs ניתן seeded לייצר OL / DRGN myelinating שיתוף תרבויות. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר.

אף אוזן גרון "> איור 5
איור 5. OLS שיתוף תרבותי עם תוצאה DRGNs בעטיפה OL בתיווך של neurites DRGN עם MBP + ממברנה יש. (א) תמונה 4 שדה confocal מונטאז' של תרבות משותפת DIV6 OL / DRGN. MBP רבים + OLS ve ניתן לראות אינטראקציה עם המיטה DRGN הבסיסית neurite. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. (ב) להציג confocal מוגדל של MBP + OLS יש גלישת neurites DRGN מרובים. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. (ג) הגדלה דיגיטלית של אזור מסומן ב (ב) שבו neurite DRGN הוא להיות עטוף קרום OL. סרגל קנה מידה, 25 מיקרומטר.

Discussion

דו"ח זה מתאר שיטה לבידוד OPCs Murine לבידול בתרבויות OL מועשר או OL / DRGN שיתוף תרבויות. כאשר בתרבית לבד, OPCs להתמיין MBP + OLS יש, ייצור המיאלין כמו סדינים קרומי. כאשר נוספו DRGN מיטות neurite, OLS ללפף neurites DRGN עם MBP + ממברנה יש. מודל זה יתרונות חקירת היסודות מורכבים השולטים OL בתיווך ensheathment axonal.

בעוד בעל ערך רב, את הקמתה של תרבויות כאלה הוא מאתגר מבחינה טכנית. בפרט, בדרישה לכלול את ההיבטים לעיכול רקמת יעיל / דיסוציאציה, ותחזוקה של תרבות התקשורת pH מאוזן, DRGN שינויים התקשורת. חשוב לקחת בחשבון את אורך מערכת העיכול, כמות רקמת מתעכל וכמות טחינה דקה משפיע על התוצאה היעילות בסופו של ניתוק הרקמה. אין זה יוצא דופן עבור חוקרים מנוסים כדי להשיג תשואות הסלולר נמוך מ ניתק ברקמות מערכת העצבים. בנוסף, OPCs Murine נוטים להיות רגישים לשינויים ב-pH של התקשורת בתרבות, במיוחד בתנאים בסיסיים. תחזוקה של תרבויות ב 8.5% CO 2 נועד למנוע זאת, מאז OPCs נראה טוב יותר לסבול תנאים חומציים קצת יותר בסיסי. באשר DRGNs האכלה, שינויים התקשורת חייב להתבצע מהר ככל שלא ליבש את הנוירונים, לעומת זאת, חייב להיות עדין לא לשבש את המיטה neurite מתפתחות. פתאומית שינויים התקשורת עשוי לסלק את המיטה neurite מן המצע, והתוצאה סביר ניתוק מוחלט מן coverslip.

בזכות הפוטנציאל של מערכת מודל זה מאפיל מאוד תובענית מבחינה טכנית הטבע שלה. אחד היתרונות של המערכת הזו הוא השימוש שלאחר הלידה עכברים עבור הגזירה תרבית תאים, עקיפת הצורך להקריב את הנקבות לרבייה לקצור רקמה עוברית. יתרון נוסף הוא היעדר דרישה גורמי גדילה (GFS) להרחבת OPCs. תרבויות גליה מעורב לספק סביבה תומכת הפצת OPCs, כנראה בשל נוכחותם של astrocyte הנגזרות גורמים trophic. שיטות אחרות, כגון גזירה באמצעות neurospheres 7,8, להסתמך על המאפיינים mitogenic של GFS כגון גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF), גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו טסיות הנגזרות גורם הגדילה (PDGF) להרחבת OPC. באופן דומה, תוך שימוש לאחר הלידה (P5-10) עכברים עבור DRGNs ימנע את הדרישה להשלים את תרבות התקשורת עם גורם הגדילה העצבי (NGF), גורם neurotrophic הנדרשת עבור ההישרדות של DRGNs עובריים במבחנה 9, 10. מעניין להימנע משימוש NGF כפי שהוא משפיע לרעה על יכולת myelinating של OLS כאשר בתרבית עם DRGNs 4. הימנעות משימוש GF-שיושלם התקשורת יש גם יתרונות כלכליים, כמו ריאגנטים אלה הופכים יקרים כאשר נעשה שימוש בקנה מידה גדול.

אולי היתרון החשוב ביותר של מודל זה בתרבות היא גזירה מן העכבר בלבד רקמות, ובכך לספק את ההזדמנויות לגזור הן OPCs ו DRGNs ממגוון רחב של קווי עכבר מהונדס. זה מאפשר לימוד והן DRGN / או OPC ספציפיים המאפיינים השולטים myelination. זה יהיה חשוב במיוחד עבור הבהרת קולטן / אינטראקציות ליגנד ויסות OL בתיווך myelination של אקסונים. בסך הכל, טכניקה זו היא בעלת ערך רב לגבי מחקר מדעי המוח עקב היישומים שלה לקראת הבנה רמזים המולקולריים שבבסיס myelination.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

פרויקט זה מומן על ידי מענק מטעם האגודה לטרשת נפוצה בקנדה RKRWO הוא מקבל תעודת סטודנט מטעם האגודה לטרשת נפוצה בקנדה. SDR הוא הנמען של פוסט דוקטורט של האגודה לטרשת נפוצה בקנדה קנדה המכונים לחקר בריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Multicell 319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170-112
Minimum Essential Media (MEM) GIBCO, by Life Technologies 12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
GlutaMAX Invitrogen 35050-061
Poly-l-lysine Sigma-Aldrich P2636
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Human merosin purified protein (LN2) EMD Millipore CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF) PeproTech Inc 450-50
L-thyroxine Biochemika 89430
Holo-transferrin Sigma-Aldrich T0665
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 0080085-SA
Bovine insulin Sigma-Aldrich I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich I6634
Progesterone Sigma-Aldrich P8783
Putrescine Sigma-Aldrich P7505
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR) Sigma-Aldrich F0503
Papain solution Worthington Biochemical LS003126
DNaseI Roche Group 1010159001
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
24-well tissue culture dishes Cellstar 662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap Corning 430639
10 cm tissue culture dishes Corning 430167
10 cm petri dish Fisher Scientific 0875713
Collagenase A Roche Group 103578
CellTrics 50 μm filter (optional) PARTEC 04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody AbD Serotec MCA409S
NG2 antibody EMD Millipore AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody EMD Millipore MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody Covance SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody Fitzgerald 10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody Sigma-Aldrich N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody EMD Millipore MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody Invitrogen A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Bio-Rad 170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542

Media Recipes

100X OL-Supplement*

IngredientAmount to add
DMEM100 mL
BSA1.02 g
Progesterone0.6 mg
Putrescine161 mg
Sodium Selenite0.05 mg
3,3',5-Triiodo-L-thyronine4 mg

*Store at -80 °C in 250 μL aliquots

OL media

IngredientAmount to add
DMEM23.75 mL
100X OL-Supplement250 μL
Bovine insulin (from 1 mg/mL stock)125 μL
GlutaMAX250 μL
Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock)37.5 μL
B27 Supplement500 μL
FBS125 μL
CNTF (from 50 ng/μL stock)25 μL

Mixed glial culture media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (0.33% from stock)33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin
GlutaMAX1%

DRGN media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (1% from stock)100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin

Digestion Solution Recipes:

OPC papain solution (made up in MEM)

IngredientFinal concentration
Papain solution1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL
DNaseI60 μg/mL

DRG papain solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Papain1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL

DRG Collagenase A solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Collagenase A4 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avellana-Adalid, V. Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential. J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).
  2. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  3. Barres, B. A. Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage. Cell. 70, 31-46 (1992).
  4. Chan, J. R. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43, 183-1891 (2004).
  5. Camara, J. Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system. J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).
  6. Ishibashi, T. Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses. Neuron. 49, 823-832 (2006).
  7. Chen, Y. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  8. Pedraza, C. E. Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors. Glia. 56, 1339-1352 (2008).
  9. Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors. J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).
  10. Greene, L. A. Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons. Dev Biol. 58, 106-113 (1977).

Comments

46 Comments

  1. very nice video and presentation....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 28, 2011 - 12:44 PM
  2. Nice explanation. I have been carrying out this procedure for some time now and find that it works quite well.

    How many OPCs you generally obtain from a single mouse brain?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 26, 2012 - 4:35 PM
  3. Hi - thanks for your comment, typically I yield about ²00,000 OPCs per mouse brain (on average).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:04 AM
  4. Excellent. I am using B6 mice, usually P4-5 (because we also take cerebellar neurons from these same pups). I usually yield between 100-130,000 cells/brain. I see some differences in our protocols (I seed three brains/T75, use trypsin instead of papain, etc.). What steps have you found to dramatically increase your OPC yield post shake-off?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 12:17 PM
  5. The largest factor in OPC yield is the efficiency of your digestion (ie. minimal cell death). In addition, the age of the mice from which you isolate the mixed glial cultures is a factor. I think if you go too far past P², many OPCs will be postmitotic, and therefore limit their proliferation capacity. I usually try to go as young as possible (P0) as this seems to work best. If you absolutely need to use P4-P5, maybe try to culture your monolayers longer than 9 days - try waiting ² weeks prior to shake off. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:06 PM
  6. Thanks for the great info. That is interesting, as many of the protocols for the "DeVellis-method" use different enzymatic preparations (trypsin +/- EDTA, +/- DNAase, papain, etc.). I had basically adapted my rat OPC protocol for mice, but am realizing that they are just not the same. I will trip your papain method and let you know how things pan out. Also, is there a reason you use T²5 flasks instead of combining brains into a T75?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 4:55 PM
  7. No there is no specific reason for using T²5, simply this is what I have always been using. I would imagine combining 3 mice into a T75 flask would roughly be the same thing. Good Luck!

    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 12:00 PM
  8. Hi Ryan, nice video and explanation. Do you do lectin panning to further get rid of microglia or do you find that a 30 min incubation at 37 degrees is enough? Also, how do you know cells are ready to shake? are they always ready at day 9? what do you look for specifically?
    thank you

    Reply
    Posted by: luisa t.
    April 10, 2013 - 12:39 PM
  9. hello...I have gone through this video...very nicely presented...but I have one doubt that if I put the flasks on shaker which only maintains temp and speed but not CO² level, the pH will change...would it not allow the OPCs to survive at all??? and can I use HEPES in medium to solve this problem???
    M willingly waiting for your reply....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 4, 2012 - 12:35 PM
  10. Thank you for your comment, you are correct in that it will not work without CO² buffering. HEPES buffer will likely not solve this problem either. I'm afraid you will absolutely need to have CO² buffering for this isolation to work.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 11:56 AM
  11. Hi, very INFORMATIVE video, I zalak parikh working on glial cells. In your protocol you are not using any filter after papain digestion but I am facing one problem of Fibroblasts contamination. What could be the possible solution for this problem?
    thank you
    Zalak.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 7:59 AM
  12. Hi Zalak, thanks for your comment. What glial cell type are you trying to culture? Oligodendrocytes, astrocytes or microglia? I have never experienced fibroblast contamination.. are you sure they are fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 10:47 AM
  13. Hi there. Excellent video, very informative. I was just wondering if you can incubate the flasks in 5% CO² instead of 8% CO²?
    Thanks
    Matt

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 12:48 PM
  14. Hi Matt, Actually no, you need to have these at at least 8.5% CO² - otherwise you will have trouble establishing your mixed glial cultures - Good luck

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 10:22 PM
  15. Hi Ryan. Very nice video and presentation.
    I have to establish a DRG neuronal culture. Majority of all the papers I've read are using a embryonic source of DRG unlike you using post-natal mouse. What do you think will be the major difference between the cultures of the two??

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 1, 2012 - 12:23 PM
  16. Hi Lipi,
    You're right most papers use embryonic DRGs. The benefit of using post-natal DRGs is that you don't have to sacrifice the mother, and if you use P5-P10 mice, there is no need to use nerve growth factor (in my hands). Embryonic DRG neurons require NGF supplementation to the media for their survival. In terms of the difference between cultures, embryonic dervied ones may have a bit more contaminating cells, since I find they divide pretty quickly. Otherwise I imagine they would be the same as post-natal derived cultures. Good luck!

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    October 1, 2012 - 4:37 PM
  17. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:39 AM
  18. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:51 AM
  19. Great article Ryan. I had a question for you. Our lab generates mixed glial cell cultures by isolating NPCs from P1 mouse pup brains,expanding the NPCs via neurospheres in the presence of GFs, and then plating the spheres on matrigel for subsequent differentiation without GFs. My main goal in using the neurosphere protocol is to obtain OPCs, but I routinely get only ²0-30% O1+ OPCs following 8 days of differentiation on matrigel. GFAP+ astrocytes seem to dominate the whole culture, with OPCs growing on top of them. I wanted to try to incorporate your protocol into the neurosphere protocol by dissociating the spheres using TrypLE or Accutase, plating them on Poly-D-Lysine, letting the astrocytes grow to confluency while having OPCs proliferate on top, and then use the shaking technique to isolate OPCs. Do you think this is possible? When we perform in vitro studies with the NPCs, we usually plate the neurospheres on matrigel for a day and then trypsinize the cells for seeding into new dishes. Not only do I think the trypsin digest kills many OPCs, but I also remove astrocytes from the matrigel that then contaminate my cultures. Thanks for the help!

    Reply
    Posted by: Brett M.
    November 3, 2012 - 7:37 PM
  20. Hi Brett - To answer your question, yes I think it would be possible to do what you are suggesting. However, it seems to be a pretty roundabout approach. I think the more streamlined approach would be to simply seed your dissociated P1 neural cells onto PLL substrate to generate a monolayer. That way you would avoid having to generate neurospheres (which I imagine takes about 10 days) and then subsequently generating an astrocyte monolayer with the spheres (which would take another 10+ days). In my experience, OPCs don't like trypsin. If you wanted, you could try 0.05% Trypsin instead of 0.²5% and that seems to be more gentle. And if you don't incubate for too long, most astrocytes should remain on the plate. Hope this helps! -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    November 5, 2012 - 12:14 PM
  21. Ryan, thanks for the help! I tried your protocol and everything appeared to go well. However, one issue I ran into occurred during the overnight shaking step and subsequent differential adhesion assay to isolate a more pure population of OPCs. What I noticed was that after the overnight shaking I had many large oligospheres (maybe 10-²0 cells in size). These spheres did not stick down during the 30 minute plate incubation and I had difficulties trying to dissociate them as you described using the P1000 and P²00 tips. When I took the cells counts and plated the cells onto chamber slides, many smaller clumps remained and stuck down to the matrix. However, the clumps did not flatten out on the gel matrix very well (like neurospheres do) and eventually flaked off after about 5 days of cultures, leaving only sparse population of OPCs. Have you ever encountered this problem? I was thinking of seeding at a higher cells density than what you describe in the protocol.

    Reply
    Posted by: Brett M.
    December 2, 2012 - 10:21 PM
  22. Hi Brett - sounds like you're doing everything right. Normally I see lots of these "oligospheres" as a result of the overnight shaking protocol. However, I find that these are not the majority of OPCs, as there are many single cells and cells in clumps of ²-4. The oligospheres are difficult to dissociate, and due to this, I generally do not go out of my way to try and break them up. In my hands, these spheres spread out very nicely after about ²4hrs on Laminin-² substrate. You can try to seed at higher densities if you like, but the seeding density should be determined based on the experiment you want to conduct. For example, if you want to perform immunocytochemistry, it may not be ideal to have a very dense cell culture. Also, it's possible the clumps aren't super compatible with your matrix substrate - I always use Laminin. I hope this helps :)

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 3, 2012 - 11:42 AM
  23. HI Ryan, very informative and nice presentation. I have tried your protocol and everything seem to work fine except at the overnight shaking. There were very few OPCs isolated and it seems there are still many OPCs adhere to the astrocytes. Have you encounter this issue?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 13, 2012 - 3:25 AM
  24. Hi Esther, Thanks for your comment. How many OPCs are you yielding per mouse? I usually yield on average ²00,000 OPCs per mouse brain, but this is quite variable. At times I have yielded 500,000 or 50,000 per brain, and I'm not sure what accounts for this variability. In any case, you will never dissociate 100% of the OPCs from the monolayer, I've noticed a lot remain stuck. My advice would be to simply give it another shot and see if your yields are a bit higher next time. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 16, 2012 - 5:35 PM
  25. Thanks Ryan for your advice. My yield is definitely much lower than yours. I will definitely try another round. :)

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 16, 2012 - 8:24 PM
  26. HI Ryan, I face the problem of getting immature OPC instead of mature OPC after 6 days of OL-enriched culture. What is your view?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 2:51 AM
  27. Hi Esther, you should always expect to have some OPCs that don't differentiate during the timecourse. However, the majority of OLs should at least be expressing MAG, if not MBP at DIV6. My guess would be that your media is not exactly correct. Make sure that all the ingredients are at the correct concentration in your 100x OL-supplement stock - especially tri-iodothyronine and L-thyroxine (4mg per 100mL). I hope this helps, let me know if you still have problems.

    Posted by: Ryan O.
    January 23, 2013 - 12:56 PM
  28. Thanks Ryan for replying. I have added tri-iodothyronine only as there is no mentioned of L-thyronine in the 100x OL-supp recipe. Can i still add L-thyronine when the OL-enriched is on DIV5?

    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 8:05 PM
  29. Thanks for notifying me of this mistake, I'll notify the editorial team ASAP. Yes you can try to add it on DIV5, but no guarantees this will drive them any farther since they are aleady 5 days in. Give the protocol a second try, and let me know if the lack of differentiation still occurs. -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    January 24, 2013 - 12:47 AM
  30. Hi Luisa thanks for your comment :) I don't do lectin panning, as I find that incubation on the culture plates is enough to get rid of most of them, but if you're having a problem with microglia that is an additional option. I usually shake on day 9, but I've found you can shake anywhere from 9 to 1² days, but any longer than that you will get less OPCs. Generally if you see a lot of cells on top of the astrocyte monolayer, they are ready to go. However in my experience this dŒsn't really happen before day 9. Hope this helps RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    April 10, 2013 - 2:28 PM
  31. Hi Ryan.Thanks for this protocol. I did exactly what you have described in this protocol, except the shaking step. I did it without CO2, but the caps are tightly sealed, how is it possible that CO2 will effect pH of tightly sealed flask? My yield was very low, besides I had fibroblast contamination as well. I used uncoated flasks as well, because once during the shaking all the layer came off the bottom of the flask, what do you think would be the reason for this?.And in my experience when FBS is used in OPC culture media it made OPC's to differentiate to astrocytes rather then oligodendrocytes.Overall I couldnt replicate this procedure unfortunately and trying to find other methods..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 20, 2014 - 5:33 PM
  32. Hi Aysel - from what you describe in your message, you didn't follow my protocol.

    1) So you didn't shake the flasks? Or you didn't use the same method of shaking?

    2) As far as I know, all standard tissue culture incubators have some level of CO2 buffering (usually 5%). Strictly speaking, if you tighten the cap of your flasks, there will be no gas exchange between the incubator and the flask, if you are using plugged caps. I use vent-capped flasks (0.22um pore), so gas exchange occurs between the flask and the incubator when the caps are tight. To answer your question, CO2 buffering will have little-to-no effect on the pH of the media if you are using tightly-screwed plugged flask caps.

    3) I haven't experienced fibroblast contamination in my cultures, I imagine this would be a dissection issue. The only source of fibroblasts I can imagine would be from the meninges, so be sure to fully remove this prior to dissociation of the cortex. Unless you are confusing fibroblasts for astrocytes. Too many astrocytes is a result of too much agitation at the differential adhesion step.

    4) I have always used coated flasks, in my experience OPCs will not adhere to uncoated surfaces. I am willing to bet you'll get almost no OPCs if you continue to use uncoated flasks. If you want you can try to use other substrates such as PDL, poly-O-ornithine, collagen etc.

    5) I haven't noticed any significant transformation of OPCs into astrocytes in the presence of FBS. I imagine this might occur more frequently in immortalized OPC cell lines. Perhaps that's what you are thinking of.

    I hope this helps, otherwise best of luck in your research.

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 20, 2014 - 8:52 PM
  33. Hi Ryan, thank you ver much for detailed answer. Sorry for my english, i couldnt explain good.
    I did the shaking of course but without putting shaker inside the CO2 incubator, I did shaking at 37 degree incubation only and at 180 rpm. Because the flasks are uncoated(I have used uncoated flasks for rat OPC"s without problem, that is why I tried this way with mouse as well) I hesitated to increase rpm to 240 or so, to prevent astrocyte detachment, and I also think that fibroblast contamination is because of the meninges. Second time I will prevent it.
    It is good to know that I must use coated flasks, I will try again, if you say so.
    Thank you so much, good luck to too..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 21, 2014 - 6:22 AM
  34. Hi Again,
    Alright - I strongly suggest to put the shaker in the incubator for the overnight shake, as I have found this to be a crucial step in maintaining pH balance. The media on your cells should always be a rich red colour (indicative of a balanced pH) all the time. Mouse OPCs are very sensitive to pH, and will die with too much fluctuation. If during your shaking, the media becomes at all purple-ish or yellow-ish, your OPC yield will drastically reduce. I wouldn't be surprised either if this was a contributing factor to the monolayer detachment you experienced previously. There is a significant difference in the in vitro behaviour/viability of mouse OPCs as compared to rat, hence the generation of this protocol. Your best bet is to simply follow this protocol exactly as is.

    Thanks for your comment, and good luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 21, 2014 - 12:25 PM
  35. Hi.
    One more question Ryan, about amount of the brains seeded, I was seeding 2 rat brains/ T75 flask , in the mouse case to obtain same amount of cells seeded I was using 6 brains per flask. Would you suggest to use 3-4 instead of six? and if i seed 6 animals should I increase concentration of insulin added to mixed culture media? Overall what would be optimum amount of brains per T75 flask in your opinion? Does it matter to much? Because here you use 1 brainper T25 flask.
    Thanks again..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 26, 2014 - 4:20 PM
  36. Hi Aysel,
    Again, your best bet for success is to follow the protocol exactly as is - T25 flasks are what this method has been optimized for. I suppose T75 flasks have 3 times the surface area, so in theory 3 mice would have to be seeded to a T75 to yield the same cell density. I've never tried this protocol with T75 flasks, and I know that different culture vessels have different impact on growth and survival of OLs.
    Best - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 27, 2014 - 10:47 AM
  37. Hi Ryan . I want to say that I replicated the procedure exactly as here, and have got very good yield, but I have 1 more question to you, majority of OPCs die in the differentiation media after 6-7 days of incubation. You indicated that it is important not to distrub them until fixation, but how do you do the medium chage, I put 1 ml media first day and did 2/3 media change each 3 days, I seeded all cells to one 24 well format plate, at each time points(3 d, 6 d, 9 d) I transfer the slides to new plate and fix them there and do medium change for rest of the slides. By the way I culture OPCs at 5% CO2, becaue I have only 2 options 5% and 10%, i cant adjust ph of the incubators at this time point. Is it the contributing factor for death of the cells after 4-5 days of incubation?

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 2:43 PM
  38. Hi Aysel - I'm glad to hear things are looking up -

    1. I don't suggest differentiating the OLs for longer than 6 days. If you're finding they are not differentiating fast enough, you can add 4 mg of L-Thyroxine to the 100X OL-supplement (see the media recipe list above).

    2. It is normal to lose OLs over the time course of differentiation. That being said, you don't want to encourage death by moving the cells or culturing at low pH. You should not be changing the media of the purified OL cultures at any point - they do not require media changes. The protocol also says to culture the OLs at 8.5% CO2. Since you have access to both 5 and 10% CO2 incubators, and 8.5 is closer to 10 than it is to 5, I suggest culturing them at 10%.

    3. Rather than culturing all of your time points in one dish, use 3 dishes (one for 3 days, one for 6 etc). That way, you won't have to disturb your other time points.

    4. Do not remove the coverslips from the wells of your 24 well dish during fixation - simply add concentrated PFA directly into the media and allow to fix for about 15 mins at room temp.

    Sounds like you're almost there, Best of luck - Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 3:58 PM
  39. Let me write it again to see if I have understood you correct, you say dont do any media change ever, neither at 3 days or 6 days or further? The other things I will try what you suggest, culturing and seeding in different plates at 10% CO2
    I want to thank you a lot for your help and all of the explanations.
    Thanks ..
    Best,
    Aysel

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 4:22 PM
  40. Thats correct :)
    You're very welcome,

    Ryan

    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 5:49 PM
  41. Hi Ryan,

    Thanks for sharing this protocol, looks really good and will try it out. I have a couple of questions regarding your protocol and was hoping you could shed some light on some problem I am experiencing at the moment.

    With regards to what you have just described, we actually perform a very similar mixed glial culture on P0-P3 rat brains. Our isolation stages are very similar with the exception we use DNAse1 and L-cysteine along with Papain. Upon plating our cell suspensions the flasks are densely populated with microglia on top, then opc's below and then astrocytes. We basically shake off our microglia before doing the overnight shake for the OPC's.

    My question is how do you get rid/ not see any microglia in your mouse cultures? Is it also possible to obtain microglia from your method?

    We are currently experiencing problems with obtaining OPC's from our overnight shake (in rat). The cells look healthy when in culture with the microglia but once the microglia are removed and we perform the steps required to plate the OPC's we have a lot of contaminants in with the cells, almost like long fibrous structures that are stained by trypan blue. We still obtain + 5 million OPC's but the cells do not look healthy and the morphology is not consistent with OPC's. Upon plating these cells they fail to show characteristics of OPCs and a lot die off. I will mention we do not shake in an incubator but in an orbital shaker at 250rpm with the caps sealed tight and parafilm. Have you ever encountered this?

    Many thanks .

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    February 9, 2015 - 1:06 PM
  42. Hi Graeme, thanks for your question.
    We do in fact get microglia in our mixed cultures, but we remove them prior to the overnight shake with a slow short shake (as in the rat method). These shaken off microglia are a very pure population, and can be cultured separately if desired.
    With regard to the problems you’re encountering shaking your rat cultures, I can’t say I’ve experienced anything quite like what you’re describing. It almost sounds like your cultures are suffering from contamination (maybe yeast?). We’ve experienced contamination a couple of times, and it resulted in much of the monolayer dissociating from the base of the flask during the overnight shake. If you like, you can send me a pic of the fibrous structures in the hopes that I could recognize what they are (romea077@uottawa.ca).
    We have never had luck shaking flasks in an orbital shaker – we exclusively use tissue culture incubators with vented caps. One risk of using an orbital shaker is they pose a threat for contamination, as they are often used for bacterial cultures.
    I hope this helps and best of luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2015 - 11:12 AM
  43. Hi Ryan,

    Thanks for your reply.

    I tried the protocol and achieved very nice OPC's so everything seems ok there.

    With regards to what I was seeing after my rat OPC shake, I believe it not to be of any contamination but more something coming out of solution in our media. As a test I shook DMEM10% in a T75 flask, 37 degrees, 250rpm overnight. The next day I took an aliquot and looked at it with trypan blue. To my surprise I saw the same fibrous clumps that I was seeing after the OPC shake

    . My DMEM only contains FBS and pen-step so this has to be something in FBS. My most recent shake off I decided to shake off 5 flasks with DMEM 10% and 5 flasks with OPC media (our OPC media contains 2.5ml FBS vs 50ml in DMEM). The next day after following normal protocol I counted the cells from both conditions. The OPC media flasks had almost none of the fibrous clumps whereas the DMEM flasks had alot. I can now partially get round this problem by filtering with 40uM strainer but have you ever heard or seen this kind of thing. We have used several batches if FBS so it cannot be that every batch has precipitated proteins in it but perhaps what were doing is causing precipitation of FBS proteins that are affecting the OPC's?

    Thanks

    Graeme

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    March 15, 2015 - 4:16 PM
  44. Hi Ryan,

    Is your FBS from Invitrogen decomplemented ? If so did you buy decomplemented or did you heat it at 56*C and for how long.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Ludovic D.
    February 24, 2017 - 10:40 AM
  45. Hi Ludovic,
    I've used FBS that has been heat-inactivated by the manufacturer, and I've also used FBS that I've heat inactivated myself. For the latter, if memory serves, about 30 minutes at roughly 50 degrees C should do the trick (water bath).
    Good luck, Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2017 - 11:49 AM
  46. Hi Ryan,
    I am wondering if you have any experience with adding Cre Recombinase Adenovirus to the cultures? And if you think a particular day would be best to add it? I was thinking of adding it on D8 (1 day before the full media change) but wasn't sure if adding virus and then shaking the cells would cause too much stress?
    Thanks,
    Megan

    Reply
    Posted by: Megan R.
    April 30, 2018 - 2:39 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics