Author Produced

Afleiding van Verrijkt oligodendrocyt Culturen en oligodendrocyt / Neuron Myelinating co-culturen van Post-natale Murine Tissues

Neuroscience
 

Summary

Dit artikel beschrijft methoden voor het afleiden van verrijkte populaties van muizen oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's) in het primair cultuur, die een onderscheid te rijpen oligodendrocyten (OLS) te produceren. Daarnaast is dit rapport beschrijft technieken te produceren voor muriene myelinating co-culturen door zaaien muis OPC's op een bedje van neurieten muis dorsale wortel ganglion neuronen (DRGNs).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues. J. Vis. Exp. (54), e3324, doi:10.3791/3324 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het identificeren van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen OL ontwikkeling is niet alleen van cruciaal belang voor het bevorderen van onze kennis van OL biologie, maar heeft ook implicaties voor het begrijpen van de pathogenese van demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose (MS). Ontwikkeling van de cellen wordt vaak bestudeerd met primaire celcultuur modellen. Primaire celcultuur vergemakkelijkt de evaluatie van een bepaald celtype door middel van een gecontroleerde omgeving, vrij van de externe variabelen die aanwezig zijn in vivo. Terwijl de OL culturen afkomstig van ratten hebben een grote hoeveelheid inzicht in de OL biologie, heeft vergelijkbare pogingen tot oprichting van OL culturen van muizen is voldaan met grote obstakels. Ontwikkelen van methoden om de cultuur van muizen primaire OLS is noodzakelijk om te profiteren van de beschikbare transgene muis lijnen.

Meerdere methoden voor de extractie van OPC's van knaagdieren weefsel zijn beschreven, variërend van neurosphere afleiding, differentiële hechting zuivering en immunopurification 1-3. Hoewel veel methoden bieden succes, de meeste vereisen uitgebreide cultuur tijden en / of dure apparatuur / reagentia. Om dit te omzeilen, is zuiverend OPC's van muizen-weefsel met een aanpassing van de methode die oorspronkelijk beschreven door McCarthy & de Vellis 2 de voorkeur. Deze methode houdt in het fysiek scheiden van OPC's uit een gemengde cultuur gliale afgeleid van neonatale knaagdieren cortex. Het resultaat is een gezuiverd OPC bevolking die kan worden onderscheiden in een OL-verrijkte cultuur. Deze aanpak is te wijten aan de relatief korte tijd de cultuur en de onnodige vereiste voor groeifactoren of immunopanning antilichamen aantrekkelijk.

Tijdens het verkennen van de mechanismen van OL ontwikkeling in een gezuiverde cultuur is informatief, is het niet de meest fysiologisch relevante omgeving voor de beoordeling van myelineschede formatie. Co-kweken OLS met neuronen zou geven inzicht in de moleculaire onderbouwing reguleren OL-gemedieerde myelinisatie van axonen. Voor veel OL / neuron co-cultuur studies, hebben dorsale wortel ganglion neuronen (DRGNs) bewezen dat het neuron soort keuze. Ze zijn ideaal voor co-cultuur met OLS vanwege hun gemak van de winning, minimale hoeveelheid van vervuilende cellen en de vorming van dichte neurieten bedden. Terwijl studies met rat / muis myelinating xenocultures zijn gepubliceerd 4-6, een methode voor de afleiding van dergelijke OL / DRGN myelinating co-culturen van de post-natale murine weefsel is niet beschreven. Hier presenteren wij gedetailleerde methoden over hoe je effectief te produceren dergelijke culturen, samen met voorbeelden van de verwachte resultaten. Deze methoden zijn nuttig voor de aanpak van vraagstukken met betrekking tot OL ontwikkeling / myelinating functie en zijn nuttige instrumenten op het gebied van de neurowetenschappen.

Protocol

Ethiek Verklaring

De muizen die in dit werk werden verzorgd volgens de Canadese Raad over Animal Care (CCAC) richtlijnen. Ethische goedkeuring voor de experimenten werd verkregen van de Universiteit van Ottawa Animal Care Committee onder protocol nummer OGH-119.

1. Dissectie - neonatale muis cortex voor de OPC-extractie

  1. Sacrifice P0-P2 muis volgens de institutionele richtlijnen.
  2. Ontleden van de hersenen en in een petrischaal met ijskoud MEM (antibioticum-vrij).
  3. Breng de schotel naar een dissectie microscoop.
  4. Met behulp van een scalpel met de hersenen dorsale kant naar boven, sagittally een ondiepe snede langs de meest mediale rand van elke cortex (figuur 1a). Deze incisie moet alleen door het meningeale laag om de verwijdering te vergemakkelijken.
  5. Gebruik fijn getipt tang te pellen uit de hersenvliezen in een zijdelingse manier. Indien zorgvuldig gebeurt, kan deze laag verwijderd worden uit een stuk. Tijdens deze stap, verwijder de olfactorische bollen.
  6. Met de hersenen ventrale zijde-up, maak een diepe sagittale snede waar de cortex aan de ventrale gebied van het diencephalon (afb. 1b).
  7. Met de hersenen dorsale zijde-up, scheid de cortex van de middenhersenen door nieuwsgierige het weefsel in een mediaal naar lateraal fashion (afb. 1c, c '). Verwijder eventuele resterende hersenvliezen bij deze stap.
  8. Dice elk cortex in ongeveer 4 stukken en zachtjes over te dragen aan een 15 ml conische buis met 350 ul van MEM per hersenen van muizen. Houd de buis op ijs totdat alle muizen zijn verwerkt.
  9. Herhaal de stappen 1.1-1.8 voor de resterende muizen.

2. Dissociatie van neonatale cortex en het onderhoud van gemengde gliale culturen

Opmerking: De introductie van bellen in de cel suspensie moet worden vermeden tijdens de volgende stappen.

  1. Voeg de 15 ml conische buis met het vers opengesneden hersenen om een ​​37 ° C waterbad gedurende 3 minuten.
  2. Overdracht hersenen om een ​​steriele weefselkweek kap.
  3. Voorzichtig gaan in blokjes gesneden cortex door middel van een P1000 pipet tip om kleinere fragmenten te genereren. Stop pipetteren zodra er geen hersenen stuk groot genoeg is om een ​​vlotte doorstroming van de schorsing door de pipetpunt verstoren.
  4. Voeg 75 ul van OPC papaïne oplossing per hersenen in de conische buis. De OPC papaïne oplossing moet worden voorverwarmd bij 37 ° C gedurende 20 minuten voorafgaand aan gebruik.
  5. Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 20 minuten. Ongeveer elke 2 minuten, voorzichtig omkeren van de buis om weefsel aggregatie te voorkomen. Gedurende deze tijd, voeg 5 ml van de gemengde gliale cultuur media aan elke poly-L-lysine (PLL) coating (1 mg / ml) T25 fles (een fles per muis hersenen), en plaats in een 37 ° C weefselkweek incubator op 8,5% CO 2.
  6. Na 20 min, terug het weefsel suspensie aan de steriele kap en voeg 2 ml van de gemengde gliale cultuur media per hersenen naar de buis. Laat zitten voor 10 min bij kamertemperatuur tot inactivatie van de OPC papaïne oplossing mogelijk te maken.
  7. Aliquot het weefsel schorsing in 5 ml plastic buizen. Het aantal buizen moet overeenkomen met het aantal ontleed hersenen, wat resulteert in ongeveer 2,5 ml per buis.
  8. Met behulp van een steriele vlam gepolijst glas Pasteur pipet voorzichtig vermaal het weefsel in elke buis. Vermaal eerst langzaam en geleidelijk te verhogen snelheid als stukken los. Vermaal circa 10-15 keer, maar dit aantal kan variëren, afhankelijk van de effectiviteit van de spijsvertering.

Opmerking: Onder-tritureren zal resulteren in een slechte dissociatie van het weefsel, terwijl de over-tritureren zal een negatieve impact op de levensvatbaarheid van de cellen. Het is belangrijk om niet bubbels te introduceren in de oplossing, omdat dit ernstige gevolgen voor levensvatbaarheid van de cellen.

  1. Zodra er geen zichtbare weefsel klonten die nog in de opschorting, over te dragen aan een 50 ml conische buis met 4 ml van de gemengde gliale cultuur media per hersenen (dat wil zeggen, 4 hersenen = 16 ml gemengde gliale cultuur media).
  2. Keer de 50 ml conische buis en herhaal voor de resterende 5 ml buizen.
  3. Aliquot de gepoolde celsuspensie in 15 ml conische buizen (ongeveer 6,5 ml per 15 mL buis). Het aantal van 15 ml buizen moeten overeenkomen met het aantal ontleed hersenen.
  4. Centrifugeer de buizen op 1200 rpm (~ 300 g) gedurende 5 minuten.
  5. Zorgvuldig aspireren het supernatans en voeg 1 ml warm gemengde gliale voedingsbodems voor elke 15 ml conische buis.
  6. Langzaam resuspendeer de pellet met een P1000 pipet tip, zorg dat u bubbels te introduceren. Voeg de celsuspensie van elke buis naar een pre-evenwicht PLL-gecoate T25 fles, waardoor het totale volume van de cultuur media tot 6 ml.
  7. Plaats de kolven in een weefselkweek incubator voor 3-4 uur om de cellen te hechten aan de PLL substraat. Voer een volledige media veranderen door pipetteren uit de media, en het toevoegen van 6 ml vers gemengde gliale cultuur media aan de kolven. Deze stap verwijdert een groot deel van het puinveroorzaakt door de trituratie, en bevordert de cultuur levensvatbaarheid. Als OL / DRGN co-culturen zijn gewenst, wordt verwezen naar paragraaf 3 van dit protocol.
  8. Na 3 dagen van de cultuur, het uitvoeren van een 2 / 3 media wijzigen door het verwijderen van 4 ml van media, en het vervangen met 4 ml verse gemengde gliale cultuur media. Op dit punt moet een astrocyten monolaag te vormen op basis van de kolven.
  9. Op dag 6, voer dan een andere 2 / 3 media veranderen en de kolven te vullen met een uiteindelijke concentratie van 5 ug / ml insuline. Op dit punt moet een astrocyten monolaag duidelijk zichtbaar, op de top van die OPC's zullen worden prolifererende.

3. DRGN isolatie

Opmerking: Voor de productie van OL / DRGNs co-culturen, DRGNs te worden vastgesteld op de dag na gemengde gliale cultuur generatie. Beide cultuur types zijn onafhankelijk van elkaar gegroeid, en samen na 9-10 dagen.

  1. Sacrifice P5-P10 muis volgens de institutionele richtlijnen.
  2. Pak de wervelkolom, en overbrengen in een schone petrischaal.
  3. Trim weg zo veel spier-en bot van de wervelkolom als mogelijk (afb. 1d, d '), omdat dit de ontleding van de achterwortelganglia (DRG) te vergemakkelijken.
  4. Breng de bijgesneden rug om een ​​nieuwe petrischaal buikzijde-up. Met behulp van dissectie schaar en het starten van caudaal, snijd mediaal door de wervelkolom in een longitudinale manier.
  5. Gebruik van twee paar tang voorzichtig los te wrikken opent aan de wervelkolom en het ruggenmerg bloot te leggen.
  6. DRG's kan worden gevonden onder en lateraal van het ruggenmerg. Met behulp van fijne getipt tang, verwijder voorzichtig de DRG's terwijl het vermijden van schade aan de ganglia (afb. 1e).
  7. Breng de verwijderde DRG's te gebufferde zoutoplossing ijskoud Hank's (HBSS, antibiotica-vrij) in een nieuwe petrischaal. De dissector dient te streven naar 40 DRG's per muis (afb. 1f) extract.
  8. Zodra de DRG's zijn uitgepakt, trim de DRG's van een te lange wortels (afb. 1 g, g ') aan de introductie van verontreinigende cellen in de cultuur (gliacellen, fibroblasten) te minimaliseren.
  9. Overdracht van de DRG's met een 1,5 ml centrifuge buisje met 500 pL ijskoude HBSS.
  10. Centrifugeer bij 1200 rpm (~ 300 g) gedurende 5 min bij 4 ° C tot pellet de DRG's.
  11. Breng de centrifuge buizen aan een steriele cultuur kap en verwijder het HBSS uit de buizen.
  12. Voeg 500 ul van voorverwarmde (20 min bij 37 ° C) DRG papaïne oplossing, en de buizen in een 37 ° C waterbad gedurende 10 minuten incuberen. Omkeren van de buizen om de 2 minuten om weefsel aggregatie te voorkomen.
  13. Herhaal stap 3.10.
  14. Verwijder de DRG papaïne oplossing en voeg 500 ul van de voorverwarmde (20 min bij 37 ° C) Collagenase Een oplossing. Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 10 min, om te keren om de 2 minuten.
  15. Herhaal stap 3.10.
  16. Verwijder supernatant en voeg 1 ml DRGN media. Omgekeerde buis een paar keer.
  17. Herhaal stap 3.10.
  18. Herhaal stap 3.16.
  19. Coat een steriele vlam gepolijst glas Pasteur pipet met bovine serum albumine (BSA) door pipetteren een oplossing van 0,25% BSA in HBSS meerdere malen. De coating met BSA-oplossing zal voorkomen dat de DRG's van zich te houden aan de wanden van de glazen pipet.
  20. Vermaal het DRG's met de BSA-gecoate pipet eerst zachtjes, en met toenemende intensiteit eens klompen te beginnen dissociëren. Vermaal circa 10-15 keer, maar dit aantal is afhankelijk van de mate van de spijsvertering, en het aantal DRG's per buis.
  21. Zodra dissociatie is bereikt, gaan de suspensie door een 50 um filter in een steriele petrischaal met 7 ml DRGN media. Filtratie kan elimineren veel van het puin van de celsuspensie, maar deze stap is niet kritisch.
  22. Incubeer de petrischaal op 8,5% CO 2 ongeveer 1.25 uur.
  23. Vacht diverse 12 mm dekglaasjes met LN2 (10 ug / ml in PBS) in een 24-well schotel gedurende deze incubatietijd.
  24. Zodra de incubatie is voltooid, acht de petrischaal onder helder veld. DRGNs worden geïdentificeerd als grote body, fase donkere cellen. Schud de petrischaal voorzichtig aan een gehandeld DRGNs lift.

Opmerking: Veel contaminerende cellen zullen sterk hebben gehandeld op grond van de petrischaal, zodat verrijken van uw celsuspensie voor DRGNs.

  1. Breng de celsuspensie om een ​​15 ml conische buis. Voorzichtig spoelen de schotel met 4 ml DRGN media om eventueel resterende DRGNs te verzamelen. Breng de extra 4 ml tot de conische buis.
  2. Centrifugeer gedurende 5 min bij 1200 rpm (~ 300 g).
  3. Aspireren supernatant en resuspendeer de pellet in 500 ui van verse DRGN media.
  4. Bereken het aantal leverde DRGNs met behulp van een hemocytometer. Zorg ervoor dat u alleen tellen de DRGNs, en niet voor andere celtypes. DRGNs kunnen worden geïdentificeerd door hun grote bolvormige cellichamen.
  5. Seed 30.000-50.000 DRGNs aan elke LN2-gecoate dekglaasje in 1 ml DRGN media, en plaats in een 37 ° C weefselkweek incubator op 8,5% CO 2 's nachts.
  6. De volgende ochtend, een volledige media veranderen door het vervangen van de DRGNmedia met OL media (minus CNTF) met een uiteindelijke concentratie van 1% Pen / Strep en 10 uM FuDR.
  7. Op dag 3 en 5, voert u een 3 / 4 media veranderen met dezelfde media als in stap 3.30.
  8. Op dag 7, een volledige media te veranderen met OL media (minus CNTF, Pen / Strep, FuDR).
  9. Op dag 9, moet de DRGNs hebben gevormd een uitgebreide neurieten bed, en zijn nu klaar om te worden samen gekweekt met OPCs.

4. Zuivering van OPC's uit gemengde gliale culturen voor de oprichting van OL-verrijkte culturen of OL / DRGN co-culturen

  1. Op dag 9 van de gemengde gliale cultuur, overdracht van de kolven om een rondschudapparaat in een 5% CO 2 weefselkweek incubator. Plaats de kolven op de top van lege T25 flessen aan een warmte gegenereerd uit de schudapparaat voorkomen dat schadelijke gevolgen voor het gemengd gliale culturen. Laat de culturen om dit nieuwe incubator equilibreren gedurende 1 uur.
  2. Zodra de kolven zijn evenwicht, schudden de kolven bij 50 rpm gedurende 45 minuten. Het doel van deze shake is het verwijderen van alle losse aanhanger vervuilende cellen van de monolaag.
  3. Verhuizen cellen om een ​​weefselkweek kap en verwijder alle media van de kolven. Vervangen met 4 ml verse gemengde gliale cultuur media, aangevuld met 5 ug / ml insuline.
  4. Plaats de kolven weer op de shaker, om de temperatuur voor ongeveer 3 uur.
  5. Zodra de kolven zijn evenwicht, stevig te bevestigen ze aan de orbitale shaker en schud de kolven gedurende ongeveer 16 uur bij 220 rpm ('s nachts).
  6. De volgende ochtend, als OLS worden gekweekt in de afwezigheid van DRGNs (dat wil zeggen, OL-verrijkte cultuur), laag aantal steriele 12 mm dekglaasjes met LN2 (10 ug / ml in PBS) gedurende 1 uur. Overdracht van de dekglaasjes tot 24-well gerechten, wassen met PBS, gevolgd door een OL media wassen. Voeg 1 mL van OL media aan elk putje en evenwicht op 8,5% CO 2.
  7. Equilibreren 10 cm weefselkweek gerechten op 5% CO 2 gedurende 30 minuten. Een gerecht is vereist voor elke 2 flessen. Deze zullen worden gebruikt voor de differentiële adhesie-verrijking van de geschorste OPCs.
  8. Zodra de 30 min equilibreren periode voorbij is, overdracht van de media uit de geschud kolven aan de gerechten. Elk gerecht moeten krijgen media van twee flessen, gelijk aan ongeveer 8 ml celsuspensie per 10 cm schotel.
  9. Incubeer de gerechten bij 5% CO 2 gedurende 30 minuten, terwijl een zacht duwtje in de 15 min. te markeren. Dit duwtje zal helpen voorkomen dat OPC's van zich te houden aan de 10 cm schotel.
  10. Zodra de incubatietijd is voltooid, gaan de gerechten onder helder veld. OPC's zijn geïdentificeerd als kleine cel groepjes, meestal van 3-5 cellen, maar soms vormen grote aggregaten die lijkt op neurospheres. Veel niet-OL lijn cellen moeten stevig worden gehandeld op grond van de onderkant van de plaat. Zwenk de platen op een losjes aangehouden OPCs los, en breng de celsuspensie van elke plaat in een 15 ml conische buis.
  11. Centrifugeer bij 1200 rpm (~ 300 g) gedurende 5 minuten.
  12. Resuspendeer de pellet in 1 ml van OL media met een P1000 pipetpunt, gevolgd door resuspensie met een P200 pipetpunt.
  13. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
  14. Voor verrijkte-OL culturen, zaad 25.000 - 50.000 OPC's voor elke 12 mm LN2-gecoate dekglaasje in een eindvolume van 1 ml OL media.
  15. Voor OL / DRGN co-culturen, een volledige OL media (minus CNTF) te wijzigen uit te voeren op de DRGNs van sectie [3], en zachtjes toe te voegen 50.000 cellen van de OPC-verrijkte celsuspensie. Zorg ervoor dat de DRGN neurieten bed niet te verstoren tijdens de toevoeging van OPCs.
  16. Plaats culturen in een 37 ° C incubator op 8,5% CO 2, en voorkoming van de verwijdering tot fixatie. Murine OPCs zijn gevoelig voor veranderingen in pH, en verwijdering uit de incubator zal veranderen de pH van de OL media. Ook te worden opgemerkt, zal de toevoeging van dH 2 O naar de lege waterputten rond de celculturen te voorkomen dat de verdamping van de cultuur media, dus het minimaliseren van fluctuaties in de concentraties van opgeloste stoffen in de OL media. Dit zal zorgen voor een meer consistente omgeving voor de OPCs.

5. Verwerking van culturen voor immunofluorescentie microscopie

  1. Fix culturen met 100% methanol bij -20 ° C gedurende 10 min, of 3% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  2. Permeabilize coverslips met 0,1% Triton-X-100 gedurende 10 min, wassen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en blokkeren voor een uur in 10% geit serum.
  3. Incubeer coverslips met primaire antilichamen verdund in het blokkeren van oplossing overnacht bij 4 ° C.
  4. Was coverslips drie keer met PBS, en incubeer met Alexa Fluor-geconjugeerde secundaire antilichamen (Invitrogen) verdund in het blokkeren oplossing gedurende 45 minuten.
  5. Achtergrondkleuring met 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en was coverslips meerdere malen met PBS.
  6. Mount coverslips in DAKO fluorescerende montage medium.
  7. Analyseren van dia's via immunofluorescentie microscopie. In dit protocol werden dia's geanalyseerd met ofwel een Zeiss Axiovert 200M omgekeerde fluorescentiemicroscoop of een Zeiss LSM 510 META laser scanning confocale microscoop.

6. Hele cel proteïne extractie uit OL-verrijkte culturen

  1. Verwijder de 24-well culturen uit incubator en koel op ijs gedurende 3 minuten.
  2. Verwijder voorzichtig de media, en voeg 10-20 ul lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxycholaat, 1% Triton-X-100, met 0,1% pepstatine, aprotinine, PMSF, leupeptin, natrium orthovanadate) aan elk putje (een minimum van 8 wells per monster wordt gesuggereerd).
  3. Schraap putten met behulp van een breed boring P1000 pipetpunt, en breng het lysaat naar een 1,5 ml centrifugebuis.
  4. Passeren het lysaat door middel van een 30 ½-gauge spuit ongeveer 15 keer, en zet op ijs gedurende 30 minuten.
  5. Centrifugebuis bij 14.000 rpm (~ 20.000 g) gedurende 15 min bij 4 ° C.
  6. Overdracht supernatans om nieuwe centrifuge buizen, en bewaar bij -80 ° C.

7. SDS-PAGE analyse van verrijkte-OL cultuur eiwit

  1. Resolve 30 ug eiwit per monster in het verminderen van buffer door SDS-PAGE op standaard 12% poly-acrylamide gels.
  2. Semi-droge overdracht gels op PVDF-membranen.
  3. Block membranen voor 1 uur in 5% magere melkpoeder in TBST (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20).
  4. Incubeer membranen met primaire antilichamen verdund in het blokkeren van oplossing gedurende 1 uur.
  5. Was membranen drie keer met TBST gedurende 10 minuten.
  6. Incubeer de membranen met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 45 minuten in het blokkeren van oplossing.
  7. Was membranen meerdere keren met TBST en incubeer met Amersham ECL Plus western blotting detectie reagens (GE Healthcare) gedurende 5 minuten.
  8. Detecteren eiwit banden met standaard wetenschappelijke beeldvorming film.

8. Representatieve resultaten:

In dit protocol zijn OPC's uitgebreid op een astrocyten monolaag binnen een gemengde glia-cultuur. Dit gemengde gliale cultuur is afgeleid van P0-P2 neonatale muis cortex. Op dag een in vitro (div1), de gemengde gliale cultuur bevat cellen met verschillende morfologie zoals gezien door de fase-contrast-microscopie (afb. 2a). Op DIV3, een astrocyten monolaag begint te vormen op basis van de kolf, en bij DIV8, OPC's kan duidelijk worden waargenomen op de monolaag oppervlak. Op DIV9 zijn de prolifererende OPCs bereikt voldoende dichtheid te worden gezuiverd door 's nachts met hoge snelheid orbital schudden. Zodra het zuiveringsproces is voltooid, is het resultaat een OPC-verrijkte celpopulatie. Op div1-post zuivering, OPC's hebben eenvoudige morfologie, uitbreiding van enkele processen (afb. 2b). Op DIV3 na zuivering, hebben cellen een uitgebreid complex meshwork van processen, die doen denken aan onvolwassen OLS. Op DIV6 na zuivering, hebben het gezuiverde OLS afgeplat en geprojecteerd brochure-achtige membraan structuren. Deze morfologische ontwikkeling is typerend voor de in vitro rijping van OLS.

Immunofluorescentie microscopie geeft aan dat het gezuiverde cellen van de OL-stam (afb. 3a). Geplaatste OPC's in eerste instantie te uiten chondroïtinesulfaat proteoglycanen (NG2), en zich ontwikkelen tot myeline-geassocieerd glycoproteïne (MAG) positief onvolwassen OLS binnen drie dagen na zaaien (afb. 3b). Op DIV6 veel OLS express myeline basic protein (MBP), en bezitten typische volwassen OL morfologie. Procent OL-lijn cellen werden gekwantificeerd op verschillende tijdstippen aan de zuiverheid van de OL-verrijkte culturen (afb. 3c) te bepalen. Op div1 na zuivering, culturen zijn 50 ± 14% NG2 + ve OPCs, zonder MAG + ve of MBP + ve OLS. Dit geeft het gezuiverde OL-lijn cellen in het voorstadium te zaaien tijd, met een verwaarloosbare aantallen van gedifferentieerde OLS. Op DIV3, veel OLS hebben onderscheiden in MAG + ve-cellen (24 ± 5,9%) terwijl sommige behoudt de voorloper fenotype, en blijven NG2 + (13 ± 8,0%). Op DIV3, zijn een klein deel van de MAG + ve cellen (3,2 +1,2%) ook uiten MBP. Op DIV6, 20 ± 5,9% van het OLS zijn MAG + ve, terwijl 12 ± 7,3% aanhouden als NG2 + ve OPCs. Daarnaast, 21 ± 9,3% van de cellen in de cultuur zijn MBP + ve OLS op dit tijdstip. SDS-PAGE analyse toont de gesorteerde expressie van 2'3'-cyclische nucleotide-3'-fosfodiësterase (CNP) en MBP over de periode van 6 dagen cultuur, hetgeen opnieuw aantoont vermogen van OPCs in de cultuur aan terminale differentiëren tot rijpe OLS (Fig 3d ). Tezamen zijn deze gegevens stelt deze methode als een middel van het produceren van een OL-verrijkte cultuur systeem dat geschikt is voor de studie van OL rijping van OPCs.

Dit protocol beschrijft ook methoden om OL / DRGN co-culturen met behulp van muis-only weefsel bronnen kan worden vastgesteld. Echter, om de co-cultuur te produceren, moet DRGNs eerst alleen worden gekweekt om een ​​adequaat netwerk van neurieten produceren. Deze post-natale murine neuron culturen worden gekweekt voor 9 dagen in een lage serum media met 10 uM FuDR aanvulling om de verspreiding van verontreinigende fibroblasten en gl te voorkomen ial cellen. In de loop van negen dagen in vitro, geïsoleerde DRGNs produceren een dichte neurieten bed (afb. 4a). Deze neurieten bed is immunopositive voor de neuronale markers neurofilament 200 (NF) en Tuj1 (afb. 4b). Op dit punt kan gezuiverd OPC's worden toegevoegd aan de neurieten bedden en gekweekt voor een extra 6 dagen te produceren myelinating co-culturen.

Op DIV6 van OL / DRGN co-cultuur, veel MBP + ve OLS kan worden waargenomen bij de NF + ve DRGN neurieten (afb. 5a). Bij nader onderzoek zijn OLS blijkt om contact te maken met tal van DRGN neurieten, vaak ensheathing ze met een MBP + ve membraan (figuur 5b, c).

Figuur 1
Figuur 1. Dissectie microscoop beelden van bepaalde aspecten van neonatale muis cortex en DRG isolatie. (A) Dorsaal uitzicht op een vers gewonnen neonatale hersenen van muizen. De gestippelde lijnen geven het gebied waar incisies moeten worden geleverd om het verwijderen van de meningeale laag mogelijk te maken. (B) Ventraal uitzicht van de hersenen, stippellijnen het gebied waar de cortex aan de ventrale diencephalon te geven. Diepe insnijdingen worden gemaakt langs de stippellijn om het isolement van de cortex hulp. (C-c '), visuele voorstelling van hoe de cortex weg te wrikken van de rest van de hersenen. (D) Een vers geïsoleerde P5-P10 muis rug voorafgaand aan de weg te trimmen overtollige spier-en bot (d '). (e) Locatie van DRG's in de wervelkolom. (f) Het geschatte aantal DRG's die moeten worden geïsoleerd van een muis. (g) een DRG met lange wortels die nodig trimmen voorafgaand aan de enzymatische spijsvertering. De gestippelde lijn geeft de regio waar de wortels moeten worden ontdaan. (G ') DRG na de root-trimmen.

Figuur 2
Figuur 2. OPC's zijn uitgebreid in een gemengde gliale cultuur, gezuiverd, en vervolgens gedifferentieerd als een OL-verrijkte cultuur. (A) Fase contrast beelden van mixed gliale culturen in verschillende stadia van ontwikkeling. Op div1, cellen blijken ronde met weinig afgeplatte cellen. Stratificatie van gemengde gliale cultuur begint bij DIV3, waar astrocyten vormen een uniform monolaag aan de voet van de kolf, waarop OPCs vermenigvuldigen. Veel OPC's worden waargenomen bij DIV8 (pijlen) gehandeld op grond van het oppervlak van de astrocyte monolaag. (B) Als gezuiverd uit de gemengde gliale cultuur, div1 OPCs verlengd met nog een paar processen. Op DIV3, hebben cellen uitgebreid vele processen, die doet denken aan intermediaire fase OLS. Op DIV6, afgeplatte OLS (asterisk) lijken te hebben geproduceerd vliezig vel (stippellijn). Schaal van bars, 50 urn.

Figuur 3
Figuur 3. Karakterisering van de OL-verrijkte cultuur. (A) confocale beelden van geïsoleerd OLS in verschillende stadia van ontwikkeling. NG2 + ve OPC's hebben een eenvoudige morfologie, terwijl de MAG + ve OLS bezitten meerdere arborous processen. MBP + ve OLS hebben uitgebreid membraneuze myeline-achtige platen. Schaalbalk, 50 pm. (B) Gezuiverd OL-lijn cellen ontstaan ​​als OPCs, en differentiëren in MAG + ve, MBP + ve OLS op 6 DIV. Op div1, alle OPCs zijn NG2 + ve, terwijl niemand zijn MAG + ve of MBP + ve. Op DIV3, MAG + ve en weinig MBP + ve OLS zijn nu duidelijk. De meerderheid van de OLS zijn MAG en MBP + ve op DIV6, met weinig overgebleven NG2 + ve OPCs. Schaal bar, 100 micrometer. (C) Gemiddelde waarden ± SD van het percentage OL-lijn cellen in verschillende stadia van ontwikkeling meer dan 6 DIV. Op div1, alle OL-lijn cellen zijn NG2 + ve, goed voor 50 ± 14% van het totaal cellen in de cultuur. Op DIV3 en DIV6, OL-lijn cellen respectievelijk verantwoordelijk voor 36 ± 6,8% en 32 ± 8,4% van het totaal cellen, bestaande uit verschillende verhoudingen van NG2 + ve, MAG + ve en MBP + ve OLS. (D) SDS-PAGE uitgevoerd op de eiwitten die afkomstig zijn verrijkt OL-culturen waaruit de gesorteerde expressie van OL-markers CNP en MBP over de 6 DIV cultuur periode.

Figuur 4
Figuur 4. Karakterisering van de DRGN cultuur pre-OPC zaaien. (A) Fase contrast beelden van DRGNs over de 9 DIV cultuur periode van pre-OPC zaaien. DRGNs ontstaan ​​als grote-bodied cellen met enkele processen, en produceren een steeds complexer neurieten netwerk. Schaal bar, 100 micrometer. (B) confocale beelden van DRGN culturen vastgesteld op DIV9 (pre-OPC seeding) en gekleurd voor neuron-specifieke merkers Tuj1 en NF200. DRGNs hebben een neurieten netwerk waarop OPC's kunnen worden gezaaid voor de productie van OL / DRGN myelinating co-culturen. Schaalbalk, 50 urn.

ENT "> Figuur 5
Figuur 5. OLS co-gekweekt met DRGNs resulteren in OL-gemedieerde verpakking van DRGN neurieten met MBP + ve membraan. (A) Een 4-veld confocale image montage van een DIV6 OL / DRGN co-cultuur. Veel MBP + ve OLS kan worden gezien in wisselwerking met de onderliggende DRGN neurieten bed. Schaal bar, 100 micrometer. (B) Een vergroot confocale uitzicht op MBP + ve OLS-wrapping meerdere DRGN neurieten. Schaalbalk, 50 pm. (C) Digitale vergroting van het gebied aangeduid in (b) wanneer een DRGN neurieten wordt omwikkeld met OL membraan. Schaalbalk, 25 pm.

Discussion

Dit rapport beschrijft een methode voor het isoleren van muizen-OPC's voor differentiatie in de OL-verrijkte culturen of OL / DRGN co-culturen. Wanneer alleen gekweekt, de OPCs differentiëren tot MBP + ve OLS, het produceren van myeline-achtige membraneuze vellen. Wanneer toegevoegd aan neurieten bedden DRGN, OLS omhullen de DRGN neurieten met MBP + ve membraan. Dit biedt voordelen voor de onderzoek naar de complexe onderbouwing voor OL-gemedieerde axonale ensheathment.

Terwijl van grote waarde, de oprichting van dergelijke culturen is technisch gezien een uitdaging. In het bijzonder veeleisende aspecten omvatten een efficiënte spijsvertering weefsel / dissociatie, het onderhoud van een evenwichtige cultuur media pH en DRGN media veranderingen. Het is belangrijk om te oordelen dat de lengte van de spijsvertering, de hoeveelheid weefsel worden verteerd en de hoeveelheid van fijnwrijving invloed op de effectiviteit en eindresultaat van het weefsel dissociatie. Het is niet ongebruikelijk voor ervaren onderzoekers om een ​​lage cellulaire rendement te verkrijgen uit gedissocieerd zenuwstelsel weefsels. Daarnaast, muizen OPC's zijn vaak gevoelig voor veranderingen in de pH van de cultuur media, met name onder alkalische omstandigheden. Het onderhoud van culturen op 8,5% CO 2 heeft tot doel dit te voorkomen, omdat OPC's lijken beter te licht zure omstandigheden tolereren meer dan basic. Met betrekking tot het voeden DRGNs-, media-aanpassingen moeten snel worden uitgevoerd als om niet de neuronen uitdrogen, moet echter worden voorzichtig om niet de zich ontwikkelende neurieten bed verstoren. Abrupte media veranderingen kunnen verjagen de neurieten bed van het substraat, en waarschijnlijk resulteren in de volledige dissociatie van het dekglaasje.

De potentiële verdienste van dit model systeem overschaduwt sterk zijn technisch veeleisend karakter. Een voordeel van dit systeem is het gebruik van postnatale muizen voor celkweek afleiding, omzeilen de noodzaak om de voedsters te offeren aan embryonaal weefsel oogst. Een ander voordeel is het ontbreken van een vereiste voor de groei factoren (SBO) voor de uitbreiding van OPCs. Gemengde gliale culturen zorgen voor een omgeving die de verspreiding van OPCs, waarschijnlijk door de aanwezigheid van astrocyte afgeleide trofische factoren ondersteunt. Andere methoden, zoals afleiding via neurospheres 7,8, vertrouwen op de mitogene eigenschappen van GFS, zoals basic fibroblast groeifactor (bFGF), epidermale groeifactor (EGF) en platelet-derived growth factor (PDGF) voor OPC expansie. Op dezelfde manier, met behulp van postnatale (P5-10) muizen voor DRGNs vermijdt de eis van aanvulling van de cultuur media met een zenuw groeifactor (NGF), een neurotrofe factor die nodig is voor de in vitro embryonale overleving van DRGNs 9, 10. Het is van belang om te voorkomen dat met behulp van NGF als het negatief van invloed op de capaciteit van myelinating OLS bij gekweekt met DRGNs 4. Vermijden van het gebruik van de GF-aangevuld met de media ook economische voordelen heeft, omdat deze reagentia worden kostbaar bij gebruik op grote schaal.

Misschien wel het belangrijkste voordeel van deze cultuur model is de afleiding van de muis alleen weefsels, en zo de kansen af ​​te leiden zowel de OPC's en DRGNs uit de grote verscheidenheid van transgene muis lijnen. Dit maakt voor de studie van zowel DRGN en / of OPC-specifieke eigenschappen die myelinisatie regeren. Dit zal vooral van belang voor het ophelderen van de receptor / ligand-interacties reguleren van OL-gemedieerde myelinisatie van axonen. Met al deze techniek is van grote waarde met betrekking tot neurowetenschappelijk onderzoek als gevolg van de applicaties naar het begrijpen van de moleculaire signalen die ten grondslag liggen myelinisatie.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit project werd gefinancierd door een subsidie ​​van de Multiple Sclerose Vereniging van Canada naar RKRWO is een ontvanger van een studententijd van de Multiple Sclerose Vereniging van Canada. SDR is een ontvanger van Post-Doctoral beurzen van de Multiple Sclerose Vereniging van Canada en de Canadese Institutes of Health Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Multicell 319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170-112
Minimum Essential Media (MEM) GIBCO, by Life Technologies 12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
GlutaMAX Invitrogen 35050-061
Poly-l-lysine Sigma-Aldrich P2636
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Human merosin purified protein (LN2) EMD Millipore CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF) PeproTech Inc 450-50
L-thyroxine Biochemika 89430
Holo-transferrin Sigma-Aldrich T0665
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 0080085-SA
Bovine insulin Sigma-Aldrich I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich I6634
Progesterone Sigma-Aldrich P8783
Putrescine Sigma-Aldrich P7505
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR) Sigma-Aldrich F0503
Papain solution Worthington Biochemical LS003126
DNaseI Roche Group 1010159001
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
24-well tissue culture dishes Cellstar 662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap Corning 430639
10 cm tissue culture dishes Corning 430167
10 cm petri dish Fisher Scientific 0875713
Collagenase A Roche Group 103578
CellTrics 50 μm filter (optional) PARTEC 04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody AbD Serotec MCA409S
NG2 antibody EMD Millipore AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody EMD Millipore MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody Covance SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody Fitzgerald 10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody Sigma-Aldrich N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody EMD Millipore MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody Invitrogen A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Bio-Rad 170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542

Media Recipes

100X OL-Supplement*

IngredientAmount to add
DMEM100 mL
BSA1.02 g
Progesterone0.6 mg
Putrescine161 mg
Sodium Selenite0.05 mg
3,3',5-Triiodo-L-thyronine4 mg

*Store at -80 °C in 250 μL aliquots

OL media

IngredientAmount to add
DMEM23.75 mL
100X OL-Supplement250 μL
Bovine insulin (from 1 mg/mL stock)125 μL
GlutaMAX250 μL
Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock)37.5 μL
B27 Supplement500 μL
FBS125 μL
CNTF (from 50 ng/μL stock)25 μL

Mixed glial culture media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (0.33% from stock)33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin
GlutaMAX1%

DRGN media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (1% from stock)100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin

Digestion Solution Recipes:

OPC papain solution (made up in MEM)

IngredientFinal concentration
Papain solution1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL
DNaseI60 μg/mL

DRG papain solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Papain1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL

DRG Collagenase A solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Collagenase A4 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avellana-Adalid, V. Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential. J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).
  2. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  3. Barres, B. A. Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage. Cell. 70, 31-46 (1992).
  4. Chan, J. R. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43, 183-1891 (2004).
  5. Camara, J. Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system. J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).
  6. Ishibashi, T. Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses. Neuron. 49, 823-832 (2006).
  7. Chen, Y. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  8. Pedraza, C. E. Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors. Glia. 56, 1339-1352 (2008).
  9. Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors. J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).
  10. Greene, L. A. Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons. Dev Biol. 58, 106-113 (1977).

Comments

46 Comments

  1. very nice video and presentation....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 28, 2011 - 12:44 PM
  2. Nice explanation. I have been carrying out this procedure for some time now and find that it works quite well.

    How many OPCs you generally obtain from a single mouse brain?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 26, 2012 - 4:35 PM
  3. Hi - thanks for your comment, typically I yield about ²00,000 OPCs per mouse brain (on average).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:04 AM
  4. Excellent. I am using B6 mice, usually P4-5 (because we also take cerebellar neurons from these same pups). I usually yield between 100-130,000 cells/brain. I see some differences in our protocols (I seed three brains/T75, use trypsin instead of papain, etc.). What steps have you found to dramatically increase your OPC yield post shake-off?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 12:17 PM
  5. The largest factor in OPC yield is the efficiency of your digestion (ie. minimal cell death). In addition, the age of the mice from which you isolate the mixed glial cultures is a factor. I think if you go too far past P², many OPCs will be postmitotic, and therefore limit their proliferation capacity. I usually try to go as young as possible (P0) as this seems to work best. If you absolutely need to use P4-P5, maybe try to culture your monolayers longer than 9 days - try waiting ² weeks prior to shake off. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:06 PM
  6. Thanks for the great info. That is interesting, as many of the protocols for the "DeVellis-method" use different enzymatic preparations (trypsin +/- EDTA, +/- DNAase, papain, etc.). I had basically adapted my rat OPC protocol for mice, but am realizing that they are just not the same. I will trip your papain method and let you know how things pan out. Also, is there a reason you use T²5 flasks instead of combining brains into a T75?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 4:55 PM
  7. No there is no specific reason for using T²5, simply this is what I have always been using. I would imagine combining 3 mice into a T75 flask would roughly be the same thing. Good Luck!

    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 12:00 PM
  8. Hi Ryan, nice video and explanation. Do you do lectin panning to further get rid of microglia or do you find that a 30 min incubation at 37 degrees is enough? Also, how do you know cells are ready to shake? are they always ready at day 9? what do you look for specifically?
    thank you

    Reply
    Posted by: luisa t.
    April 10, 2013 - 12:39 PM
  9. hello...I have gone through this video...very nicely presented...but I have one doubt that if I put the flasks on shaker which only maintains temp and speed but not CO² level, the pH will change...would it not allow the OPCs to survive at all??? and can I use HEPES in medium to solve this problem???
    M willingly waiting for your reply....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 4, 2012 - 12:35 PM
  10. Thank you for your comment, you are correct in that it will not work without CO² buffering. HEPES buffer will likely not solve this problem either. I'm afraid you will absolutely need to have CO² buffering for this isolation to work.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 11:56 AM
  11. Hi, very INFORMATIVE video, I zalak parikh working on glial cells. In your protocol you are not using any filter after papain digestion but I am facing one problem of Fibroblasts contamination. What could be the possible solution for this problem?
    thank you
    Zalak.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 7:59 AM
  12. Hi Zalak, thanks for your comment. What glial cell type are you trying to culture? Oligodendrocytes, astrocytes or microglia? I have never experienced fibroblast contamination.. are you sure they are fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 10:47 AM
  13. Hi there. Excellent video, very informative. I was just wondering if you can incubate the flasks in 5% CO² instead of 8% CO²?
    Thanks
    Matt

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 12:48 PM
  14. Hi Matt, Actually no, you need to have these at at least 8.5% CO² - otherwise you will have trouble establishing your mixed glial cultures - Good luck

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 10:22 PM
  15. Hi Ryan. Very nice video and presentation.
    I have to establish a DRG neuronal culture. Majority of all the papers I've read are using a embryonic source of DRG unlike you using post-natal mouse. What do you think will be the major difference between the cultures of the two??

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 1, 2012 - 12:23 PM
  16. Hi Lipi,
    You're right most papers use embryonic DRGs. The benefit of using post-natal DRGs is that you don't have to sacrifice the mother, and if you use P5-P10 mice, there is no need to use nerve growth factor (in my hands). Embryonic DRG neurons require NGF supplementation to the media for their survival. In terms of the difference between cultures, embryonic dervied ones may have a bit more contaminating cells, since I find they divide pretty quickly. Otherwise I imagine they would be the same as post-natal derived cultures. Good luck!

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    October 1, 2012 - 4:37 PM
  17. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:39 AM
  18. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:51 AM
  19. Great article Ryan. I had a question for you. Our lab generates mixed glial cell cultures by isolating NPCs from P1 mouse pup brains,expanding the NPCs via neurospheres in the presence of GFs, and then plating the spheres on matrigel for subsequent differentiation without GFs. My main goal in using the neurosphere protocol is to obtain OPCs, but I routinely get only ²0-30% O1+ OPCs following 8 days of differentiation on matrigel. GFAP+ astrocytes seem to dominate the whole culture, with OPCs growing on top of them. I wanted to try to incorporate your protocol into the neurosphere protocol by dissociating the spheres using TrypLE or Accutase, plating them on Poly-D-Lysine, letting the astrocytes grow to confluency while having OPCs proliferate on top, and then use the shaking technique to isolate OPCs. Do you think this is possible? When we perform in vitro studies with the NPCs, we usually plate the neurospheres on matrigel for a day and then trypsinize the cells for seeding into new dishes. Not only do I think the trypsin digest kills many OPCs, but I also remove astrocytes from the matrigel that then contaminate my cultures. Thanks for the help!

    Reply
    Posted by: Brett M.
    November 3, 2012 - 7:37 PM
  20. Hi Brett - To answer your question, yes I think it would be possible to do what you are suggesting. However, it seems to be a pretty roundabout approach. I think the more streamlined approach would be to simply seed your dissociated P1 neural cells onto PLL substrate to generate a monolayer. That way you would avoid having to generate neurospheres (which I imagine takes about 10 days) and then subsequently generating an astrocyte monolayer with the spheres (which would take another 10+ days). In my experience, OPCs don't like trypsin. If you wanted, you could try 0.05% Trypsin instead of 0.²5% and that seems to be more gentle. And if you don't incubate for too long, most astrocytes should remain on the plate. Hope this helps! -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    November 5, 2012 - 12:14 PM
  21. Ryan, thanks for the help! I tried your protocol and everything appeared to go well. However, one issue I ran into occurred during the overnight shaking step and subsequent differential adhesion assay to isolate a more pure population of OPCs. What I noticed was that after the overnight shaking I had many large oligospheres (maybe 10-²0 cells in size). These spheres did not stick down during the 30 minute plate incubation and I had difficulties trying to dissociate them as you described using the P1000 and P²00 tips. When I took the cells counts and plated the cells onto chamber slides, many smaller clumps remained and stuck down to the matrix. However, the clumps did not flatten out on the gel matrix very well (like neurospheres do) and eventually flaked off after about 5 days of cultures, leaving only sparse population of OPCs. Have you ever encountered this problem? I was thinking of seeding at a higher cells density than what you describe in the protocol.

    Reply
    Posted by: Brett M.
    December 2, 2012 - 10:21 PM
  22. Hi Brett - sounds like you're doing everything right. Normally I see lots of these "oligospheres" as a result of the overnight shaking protocol. However, I find that these are not the majority of OPCs, as there are many single cells and cells in clumps of ²-4. The oligospheres are difficult to dissociate, and due to this, I generally do not go out of my way to try and break them up. In my hands, these spheres spread out very nicely after about ²4hrs on Laminin-² substrate. You can try to seed at higher densities if you like, but the seeding density should be determined based on the experiment you want to conduct. For example, if you want to perform immunocytochemistry, it may not be ideal to have a very dense cell culture. Also, it's possible the clumps aren't super compatible with your matrix substrate - I always use Laminin. I hope this helps :)

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 3, 2012 - 11:42 AM
  23. HI Ryan, very informative and nice presentation. I have tried your protocol and everything seem to work fine except at the overnight shaking. There were very few OPCs isolated and it seems there are still many OPCs adhere to the astrocytes. Have you encounter this issue?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 13, 2012 - 3:25 AM
  24. Hi Esther, Thanks for your comment. How many OPCs are you yielding per mouse? I usually yield on average ²00,000 OPCs per mouse brain, but this is quite variable. At times I have yielded 500,000 or 50,000 per brain, and I'm not sure what accounts for this variability. In any case, you will never dissociate 100% of the OPCs from the monolayer, I've noticed a lot remain stuck. My advice would be to simply give it another shot and see if your yields are a bit higher next time. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 16, 2012 - 5:35 PM
  25. Thanks Ryan for your advice. My yield is definitely much lower than yours. I will definitely try another round. :)

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 16, 2012 - 8:24 PM
  26. HI Ryan, I face the problem of getting immature OPC instead of mature OPC after 6 days of OL-enriched culture. What is your view?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 2:51 AM
  27. Hi Esther, you should always expect to have some OPCs that don't differentiate during the timecourse. However, the majority of OLs should at least be expressing MAG, if not MBP at DIV6. My guess would be that your media is not exactly correct. Make sure that all the ingredients are at the correct concentration in your 100x OL-supplement stock - especially tri-iodothyronine and L-thyroxine (4mg per 100mL). I hope this helps, let me know if you still have problems.

    Posted by: Ryan O.
    January 23, 2013 - 12:56 PM
  28. Thanks Ryan for replying. I have added tri-iodothyronine only as there is no mentioned of L-thyronine in the 100x OL-supp recipe. Can i still add L-thyronine when the OL-enriched is on DIV5?

    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 8:05 PM
  29. Thanks for notifying me of this mistake, I'll notify the editorial team ASAP. Yes you can try to add it on DIV5, but no guarantees this will drive them any farther since they are aleady 5 days in. Give the protocol a second try, and let me know if the lack of differentiation still occurs. -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    January 24, 2013 - 12:47 AM
  30. Hi Luisa thanks for your comment :) I don't do lectin panning, as I find that incubation on the culture plates is enough to get rid of most of them, but if you're having a problem with microglia that is an additional option. I usually shake on day 9, but I've found you can shake anywhere from 9 to 1² days, but any longer than that you will get less OPCs. Generally if you see a lot of cells on top of the astrocyte monolayer, they are ready to go. However in my experience this dŒsn't really happen before day 9. Hope this helps RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    April 10, 2013 - 2:28 PM
  31. Hi Ryan.Thanks for this protocol. I did exactly what you have described in this protocol, except the shaking step. I did it without CO2, but the caps are tightly sealed, how is it possible that CO2 will effect pH of tightly sealed flask? My yield was very low, besides I had fibroblast contamination as well. I used uncoated flasks as well, because once during the shaking all the layer came off the bottom of the flask, what do you think would be the reason for this?.And in my experience when FBS is used in OPC culture media it made OPC's to differentiate to astrocytes rather then oligodendrocytes.Overall I couldnt replicate this procedure unfortunately and trying to find other methods..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 20, 2014 - 5:33 PM
  32. Hi Aysel - from what you describe in your message, you didn't follow my protocol.

    1) So you didn't shake the flasks? Or you didn't use the same method of shaking?

    2) As far as I know, all standard tissue culture incubators have some level of CO2 buffering (usually 5%). Strictly speaking, if you tighten the cap of your flasks, there will be no gas exchange between the incubator and the flask, if you are using plugged caps. I use vent-capped flasks (0.22um pore), so gas exchange occurs between the flask and the incubator when the caps are tight. To answer your question, CO2 buffering will have little-to-no effect on the pH of the media if you are using tightly-screwed plugged flask caps.

    3) I haven't experienced fibroblast contamination in my cultures, I imagine this would be a dissection issue. The only source of fibroblasts I can imagine would be from the meninges, so be sure to fully remove this prior to dissociation of the cortex. Unless you are confusing fibroblasts for astrocytes. Too many astrocytes is a result of too much agitation at the differential adhesion step.

    4) I have always used coated flasks, in my experience OPCs will not adhere to uncoated surfaces. I am willing to bet you'll get almost no OPCs if you continue to use uncoated flasks. If you want you can try to use other substrates such as PDL, poly-O-ornithine, collagen etc.

    5) I haven't noticed any significant transformation of OPCs into astrocytes in the presence of FBS. I imagine this might occur more frequently in immortalized OPC cell lines. Perhaps that's what you are thinking of.

    I hope this helps, otherwise best of luck in your research.

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 20, 2014 - 8:52 PM
  33. Hi Ryan, thank you ver much for detailed answer. Sorry for my english, i couldnt explain good.
    I did the shaking of course but without putting shaker inside the CO2 incubator, I did shaking at 37 degree incubation only and at 180 rpm. Because the flasks are uncoated(I have used uncoated flasks for rat OPC"s without problem, that is why I tried this way with mouse as well) I hesitated to increase rpm to 240 or so, to prevent astrocyte detachment, and I also think that fibroblast contamination is because of the meninges. Second time I will prevent it.
    It is good to know that I must use coated flasks, I will try again, if you say so.
    Thank you so much, good luck to too..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 21, 2014 - 6:22 AM
  34. Hi Again,
    Alright - I strongly suggest to put the shaker in the incubator for the overnight shake, as I have found this to be a crucial step in maintaining pH balance. The media on your cells should always be a rich red colour (indicative of a balanced pH) all the time. Mouse OPCs are very sensitive to pH, and will die with too much fluctuation. If during your shaking, the media becomes at all purple-ish or yellow-ish, your OPC yield will drastically reduce. I wouldn't be surprised either if this was a contributing factor to the monolayer detachment you experienced previously. There is a significant difference in the in vitro behaviour/viability of mouse OPCs as compared to rat, hence the generation of this protocol. Your best bet is to simply follow this protocol exactly as is.

    Thanks for your comment, and good luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 21, 2014 - 12:25 PM
  35. Hi.
    One more question Ryan, about amount of the brains seeded, I was seeding 2 rat brains/ T75 flask , in the mouse case to obtain same amount of cells seeded I was using 6 brains per flask. Would you suggest to use 3-4 instead of six? and if i seed 6 animals should I increase concentration of insulin added to mixed culture media? Overall what would be optimum amount of brains per T75 flask in your opinion? Does it matter to much? Because here you use 1 brainper T25 flask.
    Thanks again..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 26, 2014 - 4:20 PM
  36. Hi Aysel,
    Again, your best bet for success is to follow the protocol exactly as is - T25 flasks are what this method has been optimized for. I suppose T75 flasks have 3 times the surface area, so in theory 3 mice would have to be seeded to a T75 to yield the same cell density. I've never tried this protocol with T75 flasks, and I know that different culture vessels have different impact on growth and survival of OLs.
    Best - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 27, 2014 - 10:47 AM
  37. Hi Ryan . I want to say that I replicated the procedure exactly as here, and have got very good yield, but I have 1 more question to you, majority of OPCs die in the differentiation media after 6-7 days of incubation. You indicated that it is important not to distrub them until fixation, but how do you do the medium chage, I put 1 ml media first day and did 2/3 media change each 3 days, I seeded all cells to one 24 well format plate, at each time points(3 d, 6 d, 9 d) I transfer the slides to new plate and fix them there and do medium change for rest of the slides. By the way I culture OPCs at 5% CO2, becaue I have only 2 options 5% and 10%, i cant adjust ph of the incubators at this time point. Is it the contributing factor for death of the cells after 4-5 days of incubation?

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 2:43 PM
  38. Hi Aysel - I'm glad to hear things are looking up -

    1. I don't suggest differentiating the OLs for longer than 6 days. If you're finding they are not differentiating fast enough, you can add 4 mg of L-Thyroxine to the 100X OL-supplement (see the media recipe list above).

    2. It is normal to lose OLs over the time course of differentiation. That being said, you don't want to encourage death by moving the cells or culturing at low pH. You should not be changing the media of the purified OL cultures at any point - they do not require media changes. The protocol also says to culture the OLs at 8.5% CO2. Since you have access to both 5 and 10% CO2 incubators, and 8.5 is closer to 10 than it is to 5, I suggest culturing them at 10%.

    3. Rather than culturing all of your time points in one dish, use 3 dishes (one for 3 days, one for 6 etc). That way, you won't have to disturb your other time points.

    4. Do not remove the coverslips from the wells of your 24 well dish during fixation - simply add concentrated PFA directly into the media and allow to fix for about 15 mins at room temp.

    Sounds like you're almost there, Best of luck - Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 3:58 PM
  39. Let me write it again to see if I have understood you correct, you say dont do any media change ever, neither at 3 days or 6 days or further? The other things I will try what you suggest, culturing and seeding in different plates at 10% CO2
    I want to thank you a lot for your help and all of the explanations.
    Thanks ..
    Best,
    Aysel

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 4:22 PM
  40. Thats correct :)
    You're very welcome,

    Ryan

    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 5:49 PM
  41. Hi Ryan,

    Thanks for sharing this protocol, looks really good and will try it out. I have a couple of questions regarding your protocol and was hoping you could shed some light on some problem I am experiencing at the moment.

    With regards to what you have just described, we actually perform a very similar mixed glial culture on P0-P3 rat brains. Our isolation stages are very similar with the exception we use DNAse1 and L-cysteine along with Papain. Upon plating our cell suspensions the flasks are densely populated with microglia on top, then opc's below and then astrocytes. We basically shake off our microglia before doing the overnight shake for the OPC's.

    My question is how do you get rid/ not see any microglia in your mouse cultures? Is it also possible to obtain microglia from your method?

    We are currently experiencing problems with obtaining OPC's from our overnight shake (in rat). The cells look healthy when in culture with the microglia but once the microglia are removed and we perform the steps required to plate the OPC's we have a lot of contaminants in with the cells, almost like long fibrous structures that are stained by trypan blue. We still obtain + 5 million OPC's but the cells do not look healthy and the morphology is not consistent with OPC's. Upon plating these cells they fail to show characteristics of OPCs and a lot die off. I will mention we do not shake in an incubator but in an orbital shaker at 250rpm with the caps sealed tight and parafilm. Have you ever encountered this?

    Many thanks .

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    February 9, 2015 - 1:06 PM
  42. Hi Graeme, thanks for your question.
    We do in fact get microglia in our mixed cultures, but we remove them prior to the overnight shake with a slow short shake (as in the rat method). These shaken off microglia are a very pure population, and can be cultured separately if desired.
    With regard to the problems you’re encountering shaking your rat cultures, I can’t say I’ve experienced anything quite like what you’re describing. It almost sounds like your cultures are suffering from contamination (maybe yeast?). We’ve experienced contamination a couple of times, and it resulted in much of the monolayer dissociating from the base of the flask during the overnight shake. If you like, you can send me a pic of the fibrous structures in the hopes that I could recognize what they are (romea077@uottawa.ca).
    We have never had luck shaking flasks in an orbital shaker – we exclusively use tissue culture incubators with vented caps. One risk of using an orbital shaker is they pose a threat for contamination, as they are often used for bacterial cultures.
    I hope this helps and best of luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2015 - 11:12 AM
  43. Hi Ryan,

    Thanks for your reply.

    I tried the protocol and achieved very nice OPC's so everything seems ok there.

    With regards to what I was seeing after my rat OPC shake, I believe it not to be of any contamination but more something coming out of solution in our media. As a test I shook DMEM10% in a T75 flask, 37 degrees, 250rpm overnight. The next day I took an aliquot and looked at it with trypan blue. To my surprise I saw the same fibrous clumps that I was seeing after the OPC shake

    . My DMEM only contains FBS and pen-step so this has to be something in FBS. My most recent shake off I decided to shake off 5 flasks with DMEM 10% and 5 flasks with OPC media (our OPC media contains 2.5ml FBS vs 50ml in DMEM). The next day after following normal protocol I counted the cells from both conditions. The OPC media flasks had almost none of the fibrous clumps whereas the DMEM flasks had alot. I can now partially get round this problem by filtering with 40uM strainer but have you ever heard or seen this kind of thing. We have used several batches if FBS so it cannot be that every batch has precipitated proteins in it but perhaps what were doing is causing precipitation of FBS proteins that are affecting the OPC's?

    Thanks

    Graeme

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    March 15, 2015 - 4:16 PM
  44. Hi Ryan,

    Is your FBS from Invitrogen decomplemented ? If so did you buy decomplemented or did you heat it at 56*C and for how long.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Ludovic D.
    February 24, 2017 - 10:40 AM
  45. Hi Ludovic,
    I've used FBS that has been heat-inactivated by the manufacturer, and I've also used FBS that I've heat inactivated myself. For the latter, if memory serves, about 30 minutes at roughly 50 degrees C should do the trick (water bath).
    Good luck, Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2017 - 11:49 AM
  46. Hi Ryan,
    I am wondering if you have any experience with adding Cre Recombinase Adenovirus to the cultures? And if you think a particular day would be best to add it? I was thinking of adding it on D8 (1 day before the full media change) but wasn't sure if adding virus and then shaking the cells would cause too much stress?
    Thanks,
    Megan

    Reply
    Posted by: Megan R.
    April 30, 2018 - 2:39 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics