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Derivación de las Culturas enriquecido oligodendrocitos y neuronas oligodendrocitos / myelinating Co-culturas de Post-natal tejidos murinos

Neuroscience
 

Summary

En este artículo se describen los métodos para obtener poblaciones enriquecidas de células precursoras de oligodendrocitos murinas (OPC) en cultivo primario, que se diferencian para producir oligodendrocitos maduros (MCO). Además, este informe se describen las técnicas para producir murino myelinating co-cultivos de siembra de los OPC del ratón sobre un lecho de neuritas de neuronas de ratón ganglio de la raíz dorsal (DRGNs).

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O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues. J. Vis. Exp. (54), e3324, doi:10.3791/3324 (2011).

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Abstract

Identificar los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo OL no sólo es fundamental para ampliar nuestro conocimiento de la biología OL, pero también tiene implicaciones para la comprensión de la patogénesis de las enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple (EM). Desarrollo celular es comúnmente estudiadas con modelos de cultivos celulares primarios. Cultivo de células primarias facilita la evaluación de un tipo de célula, proporcionando un ambiente controlado y libre de las variables externas que están presentes en vivo. Mientras que las culturas OL derivadas de ratas han proporcionado una gran cantidad de conocimiento de la biología OL, esfuerzos similares en el establecimiento de cultivos de OL de los ratones se ha encontrado con obstáculos importantes. El desarrollo de métodos de cultivo primario LB murino es imprescindible a fin de tomar ventaja de las líneas de ratones transgénicos disponibles.

Múltiples métodos para la extracción de OPC a partir de tejido de roedores se han descrito, desde la derivación neuroesfera, purificación y adhesión diferencial inmunopurificación 1-3. Mientras que muchos métodos ofrecen el éxito de la mayoría, requieren tiempos de amplia cultura y / o equipos costosos / reactivos. Para evitar esto, purificación de OPC a partir de tejido murino con una adaptación del método descrito originalmente por McCarthy y de Vellis 2 es preferido. Este método consiste en separar físicamente los OPC a partir de un cultivo mixto gliales derivadas de cortezas de roedores recién nacidos. El resultado es una población purificada OPC que pueden diferenciarse en una cultura OL-enriquecido. Este enfoque es atractivo debido a su tiempo de cultivo relativamente corto y el requisito innecesario para los factores de crecimiento o anticuerpos immunopanning.

Mientras explora los mecanismos de desarrollo OL en una cultura purificada es informativo, no proporciona el entorno más fisiológicamente relevantes para la evaluación de la formación de la vaina de mielina. Co-cultivo LB con las neuronas que ayudan a comprender la las bases moleculares que regulan la OL mediada por la mielinización de los axones. Para muchos OL / co-cultivo de neuronas estudios, las neuronas ganglionares de la raíz dorsal (DRGNs) han demostrado ser el tipo de neurona de la elección. Son ideales para el co-cultivo con LB, debido a su facilidad de extracción, cantidad mínima de células contaminantes, y la formación de neuritas camas densas. Mientras que los estudios con ratas / ratones myelinating xenocultures han sido publicados por 4-6, un método para la obtención de tales OL / DRGN myelinating co-cultivos de post-natal tejido murino no se ha descrito. Aquí se presentan los métodos detallados sobre la manera de producir eficazmente estos cultivos, junto con ejemplos de los resultados esperados. Estos métodos son útiles para abordar cuestiones relacionadas con el desarrollo OL / myelinating función, y son herramientas útiles en el campo de la neurociencia.

Protocol

Declaración de Ética

Los ratones utilizados en este trabajo fueron atendidos de acuerdo con el Consejo Canadiense de los Animales (CCPA) directrices. La aprobación ética para los experimentos realizados se obtuvo de la Universidad de Ottawa Animal Care Comité en virtud del número de protocolo OGH-119.

1. Disección - corteza del ratón neonatal para la extracción de OPC

  1. Sacrificio P0-P2 ratón de acuerdo con las directrices institucionales.
  2. Diseccionar el cerebro y colocar en una placa de Petri que contiene helado MEM (sin antibióticos).
  3. La transferencia de la antena a un microscopio de disección.
  4. El uso de un bisturí con la parte dorsal del cerebro para arriba, hacer una incisión superficial sagitalmente lo largo del borde medial de la mayoría de cada una corteza (Fig. 1a). Esta incisión sólo se debe pasar a través de la capa meníngea con el fin de facilitar su eliminación.
  5. Use unas pinzas de punta fina que se despeguen las meninges de un modo lateral. Si se hace con cuidado, esta capa se puede eliminar en una sola pieza. Durante este paso, quitar los bulbos olfatorios.
  6. Con el cerebro ventral lado-para arriba, hacer una incisión profunda sagital donde se reúne la corteza de la zona ventral del diencéfalo (Fig 1b).
  7. Con el dorsal del cerebro lado-para arriba, separar la corteza del cerebro medio, haciendo palanca en el tejido en un medio a la moda lateral (Fig. 1c, c '). Eliminar cualquier meninges residual en este paso.
  8. Dado en cada uno corteza en unos 4 trozos y suavemente transferir a un tubo cónico de 15 ml que contiene 350 l de cerebro de ratón por MEM. Mantener el tubo en hielo hasta que todos los ratones han sido procesados.
  9. Repita los pasos 1.1-1.8 para los ratones restantes.

2. La disociación de la corteza neonatal y el mantenimiento de cultivos mixtos de glía

Nota: La introducción de burbujas en la suspensión celular se debe evitar durante todos los pasos siguientes.

  1. Añadir el tubo cónico de 15 ml que contiene el cerebro recién disecado a un baño de agua 37 ° C durante 3 min.
  2. La transferencia de los cerebros de una campana de cultivo de tejido estéril.
  3. Suavemente pase picado corteza a través de una punta de la pipeta P1000 para generar fragmentos más pequeños. Dejar de pipeteo una vez que no hay piezas cerebro lo suficientemente grande como para interrumpir la fluidez de la suspensión a través de la punta de la pipeta.
  4. Añadir 75 l de solución de papaína OPC por el cerebro en el tubo cónico. La solución de papaína OPC deben ser pre-calentado a 37 ° C durante 20 minutos antes de su uso.
  5. Incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 20 min. Aproximadamente cada 2 minutos, invierta suavemente el tubo para evitar la agregación de los tejidos. Durante este tiempo, añadir 5 ml de mezcla de medios de cultivo gliales a cada poli-L-lisina (PLL) recubierto (1 mg / ml) T25 recipiente (un frasco por el cerebro del ratón), y colóquelo en un 37 ° C de cultivo de tejidos incubadora a 8,5% de CO 2.
  6. Después de 20 minutos, vuelva a la suspensión del tejido a la campana estéril y agregar 2 ml de mezcla de medios de cultivo por gliales del cerebro y el tubo. Deje reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir la inactivación de la solución OPC papaína.
  7. Alícuota de la suspensión de tejido en tubos de 5 ml de plástico. El número de tubos debe coincidir con el número de cerebros disecados, lo que resulta en aproximadamente 2,5 ml por tubo.
  8. Utilizando una aguja estéril llama pulido pipeta Pasteur de vidrio, con cuidado triturar el tejido en cada tubo. Triturar lentamente al principio, y poco a poco aumentar la velocidad como piezas de disociar. Triturar aproximadamente 10 a 15 veces, sin embargo este número puede variar en función de la eficacia de la digestión.

Nota: Bajo-trituración dará lugar a los pobres la disociación de los tejidos, mientras que el exceso de trituración tendrá un impacto negativo sobre la viabilidad celular. Es importante no introducir burbujas en la solución, ya que esto afectaría severamente la viabilidad celular.

  1. Una vez que no hay grupos visibles del tejido que queda en la suspensión, el traslado a un tubo cónico de 50 ml que contiene 4 ml de mezcla de medios de cultivo por gliales del cerebro (es decir, cuatro cerebros = 16 ml mixta cultura gliales).
  2. Invierta suavemente el tubo cónico de 50 ml y repetir a los tubos ml restantes 5.
  3. Alícuota de la suspensión de células agrupadas en tubos de 15 mL cónico (aproximadamente 6,5 ml por tubo de 15 ml). El número de tubos de 15 ml debe coincidir con el número de cerebros disecados.
  4. Centrifugar los tubos a 1200 rpm (~ 300 g) durante 5 min.
  5. Con cuidado, aspirar el sobrenadante y agregar 1 ml de calentar el medio de cultivo mixto gliales a cada tubo cónico de 15 ml.
  6. Poco a poco resuspender el precipitado con un P1000 punta de la pipeta, teniendo cuidado de no introducir burbujas. Añadir la suspensión de células de cada tubo a un pre-equilibrio PLL recubiertos T25 frasco, haciendo que el volumen total de los medios de cultivo a 6 mL.
  7. Colocar los matraces en una incubadora de cultivo de tejidos durante 3-4 horas para permitir que las células se adhieren a la del sustrato PLL. Realizar un cambio de los medios de comunicación lleno al vaso de los medios de comunicación, y la adición de 6 ml de agua dulce mixta cultura gliales de los frascos. Este paso elimina la mayor parte de los escombroscausado por la trituración, y promueva la viabilidad cultura. Si OL / DRGN co-cultivos se desea, consulte la sección 3 de este protocolo.
  8. Después de 3 días de cultivo, realizar un cambio de 02.03 medios de comunicación mediante la eliminación de 4 ml de los medios de comunicación, y su sustitución con 4 ml de agua dulce mixta cultura gliales. En este punto, una monocapa de astrocitos se forman en la base de los frascos.
  9. El día 6, realizar otro medio de comunicación 3.2 cambiar y complementar los frascos con una concentración final de 5 mg / ml de insulina. En este punto, una monocapa de astrocitos debe ser claramente visible, sobre el que los OPC se proliferan.

3. DRGN aislamiento

Nota: Para producir OL / DRGNs co-cultivos, DRGNs debe establecer el día después de la generación de cultura mixta gliales. Ambos tipos de cultura se cultivan de forma independiente, y se combinan después de 90-10 días.

  1. Sacrificio P5-P10 ratón de acuerdo con las directrices institucionales.
  2. Extracto de la columna vertebral, y traslado a un lugar limpio placa de Petri.
  3. Recorte tanto músculo y el hueso de la columna vertebral como sea posible (Fig. 1D, d '), ya que esto facilitará la disección de los ganglios de la raíz dorsal (GRD).
  4. La transferencia de la columna recortada de un nuevo plato de Petri ventral lado-para arriba. Usando tijeras de disección y caudalmente a partir, cortar en sentido medial a través de la columna vertebral en forma longitudinal.
  5. El uso de dos pares de pinzas, suavemente forzar la apertura de la columna vertebral para exponer la médula espinal.
  6. GRD se encuentran por debajo y lateral de la médula espinal. Utilizando unas pinzas de punta fina, retire suavemente la GRD, evitando daños a los ganglios (Fig. 1e).
  7. La transferencia de los GRD eliminado a la solución helada de Hank salina tamponada (HBSS, sin antibióticos) en una nueva placa de Petri. El disector debe tratar de extraer 40 GRD por ratón (Fig. 1f).
  8. Una vez que los GRD han sido extraídos, recorte los GRD de las raíces excesivamente largo (Fig. 1 g, g ') para minimizar la introducción de células contaminantes a la cultura (las células gliales, fibroblastos).
  9. La transferencia de los GRD a un tubo de centrífuga de 1,5 ml que contiene 500 l de HBSS helada.
  10. Centrifugar a 1200 rpm (~ 300 g) durante 5 min a 4 ° C para que sedimenten los GRD.
  11. La transferencia de los tubos de centrifugación de una campana de cultivo de tejido estéril y retire la HBSS de los tubos.
  12. Añadir 500 l de pre-calentado (20 min a 37 ° C) DRG solución de papaína e incubar los tubos en un baño de agua 37 ° C durante 10 min. Invertir los tubos cada 2 minutos para evitar la agregación de tejidos.
  13. Repita el paso 3.10.
  14. Retire la solución de papaína DRG y añadir 500 l de pre-calentado (20 min a 37 ° C) Una solución de colagenasa. Incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 10 minutos, invirtiendo cada 2 minutos.
  15. Repita el paso 3.10.
  16. Quitar el sobrenadante y agregar 1 ml de DRGN medios de comunicación. Invertir el tubo varias veces.
  17. Repita el paso 3.10.
  18. Repita el paso 3.16.
  19. Un abrigo estéril llama cristal pulido pipeta Pasteur con albúmina sérica bovina (BSA) con la pipeta una solución de 0,25% de BSA en HBSS varias veces. El recubrimiento con una solución de BSA evitará que los GRD se adhiera a las paredes de la pipeta de vidrio.
  20. Triturar los GRD con la pipeta BSA recubierto suavemente al principio, y con creciente intensidad una vez que grupos comienzan disociar. Triturar aproximadamente 10-15 veces, sin embargo este número depende del grado de digestión, y el número de GRD por tubo.
  21. Una vez que la disociación se consigue, pasar la suspensión a través de un filtro de 50 micras en una placa de Petri estéril que contiene 7 ml de DRGN los medios de comunicación. Filtración eliminará gran parte de los restos de la suspensión de células, aunque este paso no es crítico.
  22. Incubar la placa de Petri en el 8,5% de CO 2 por aproximadamente 1,25 horas.
  23. Escudo varios 12 mm cubreobjetos con LN2 (10 mg / ml en PBS) en un plato de 24 pozos durante este tiempo de incubación.
  24. Una vez que la incubación ha terminado, observe la placa de Petri en campo claro. DRGNs se identifican como grandes células de cuerpo, moreno de fase. Agitar la placa de Petri con suavidad para eliminar todo DRGNs adherido.

Nota: Muchas células contaminantes se han adherido firmemente a la placa de Petri, enriqueciendo de esta manera la suspensión de su celda para DRGNs.

  1. La transferencia de la suspensión de células a un tubo cónico de 15 ml. Enjuague suavemente el plato con 4 ml de DRGN los medios de comunicación para recoger cualquier DRGNs residual. Transferir el adicional de 4 ml para el tubo cónico.
  2. Centrifugar durante 5 min a 1200 rpm (~ 300 g).
  3. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 l de los medios de comunicación DRGN fresco.
  4. Calcular el número de DRGNs producido utilizando un hemocitómetro. Asegúrese de contar sólo la DRGNs, y otros tipos de células no. DRGNs se pueden identificar por sus grandes cuerpos de células esféricas.
  5. Semillas de 30.000-50.000 DRGNs a cada cubreobjetos recubiertos LN2 en 1 ml de DRGN medios de comunicación, y colóquelo en un 37 ° C tejidos incubadora de la cultura en el 8,5% de CO 2 durante la noche.
  6. A la mañana siguiente, realizar un cambio de los medios de comunicación mediante la sustitución completa de la DRGNlos medios de comunicación con los medios de comunicación OL (menos CNTF) con una concentración final de 1% de penicilina / estreptomicina y 10 FUDR M.
  7. Los días 3 y 5, realizar un cambio de 3 / 4 medios de comunicación con los medios de comunicación como en el paso 3.30.
  8. El día 7, realizar un cambio de los medios de comunicación plena con los medios de comunicación OL (menos CNTF, penicilina / estreptomicina, FUDR).
  9. El día 9, el DRGNs debería haber formado una cama amplia neuritas, y ahora están listos para ser co-cultivadas con OPC.

4. Purificación de OPC de cultivos mixtos gliales para el establecimiento de OL enriquecido las culturas o OL / DRGN co-culturas

  1. En el Día 9 de la cultura gliales mixtos, la transferencia de los frascos de un agitador orbital en un 5% de CO 2 incubadora de cultivo de tejidos. Colocar los frascos en la parte superior de los frascos vacíos T25 para evitar que el calor generado por el agitador orbital afecten negativamente a los cultivos gliales mixtos. Permita que las culturas se equilibre a esta nueva incubadora durante 1 hora.
  2. Una vez que los frascos han equilibrado, agitar los frascos a 50 rpm durante 45 minutos. El propósito de este movimiento es para eliminar las células de baja adherencia contaminantes de la monocapa.
  3. A que las células de una campana de cultivo de tejidos y eliminar todos los medios de comunicación de los frascos. Vuelva a colocar con 4 ml de agua dulce mixta cultura gliales suplementado con 5 mg / ml de insulina.
  4. Colocar los frascos de nuevo en la coctelera, y hasta que se estabilice por aproximadamente 3 horas.
  5. Una vez que los frascos se equilibran, apriételos firmemente con el agitador orbital, y agitar los frascos durante aproximadamente 16 horas a 220 rpm (la noche).
  6. A la mañana siguiente, si LB se van a cultivar en la ausencia de DRGNs (es decir, OL-enriquecido la cultura), capa de varios estéril de 12 mm cubreobjetos con LN2 (10 mg / ml en PBS) durante 1 hora. La transferencia de los cubreobjetos de 24 y los platos, lavar con PBS, seguido de un lavado de los medios de comunicación OL. Añadir 1 ml de los medios de comunicación OL a cada pocillo y equilibrar a un 8,5% de CO 2.
  7. Equilibre 10 cm placas de cultivo de tejidos en el 5% de CO 2 durante 30 min. Un plato se requiere para cada 2 frascos. Estos serán utilizados para la diferencia de adhesión de enriquecimiento de las OPC en suspensión.
  8. Una vez que el período de 30 minutos de equilibrio ha pasado, la transferencia de los medios de comunicación de los frascos sacudido a los platos. Cada plato debe recibir los medios de comunicación de dos frascos, lo que equivale aproximadamente a 8 ml de suspensión celular por antena de 10 cm.
  9. Incubar las placas a 5% de CO 2 durante 30 minutos, mientras que proporciona un pequeño empujoncito en la marca de 15 minutos. Este empujón ayudará a evitar que los OPC de la adherido a la cápsula de 10 cm.
  10. Una vez que la incubación, examinar los platos en campo claro. OPC se identifican como grupos de células pequeñas, típicamente de 3-5 células, pero a veces se forman grandes agregados parecido neuroesferas. Muchos no-OC células de estirpe debe estar firmemente adherido a la base de la placa. Agite suavemente las placas para separar cualquier OPC libremente adheridos, y la transferencia de la suspensión de células de cada placa en un tubo cónico de 15 ml.
  11. Centrifugar a 1200 rpm (~ 300 g) durante 5 min.
  12. Resuspender el precipitado en 1 ml de los medios de comunicación OL con una punta de pipeta P1000, seguido de resuspensión con una punta de pipeta P200.
  13. Contar las células utilizando un hemocitómetro.
  14. Para enriquecido OL culturas, las semillas de 25.000 - 50.000 OPC para cada una de 12 mm LN2 recubierto cubreobjetos en un volumen final de 1 mL OL medios de comunicación.
  15. De OL / DRGN co-cultivos, realizar una media total OL (menos CNTF) el cambio en la DRGNs de la sección [3], y con cuidado añadir 50.000 células de la suspensión celular OPC-enriquecido. Tenga cuidado de no perturbar la cama neuritas DRGN durante la adición de las OPC.
  16. Culturas a cabo en una incubadora a 37 ° C en el 8,5% de CO 2, y evitar que se eliminen hasta la fijación. OPC murinos son sensibles a los cambios en el pH, y la eliminación de la incubadora se altera el pH de los medios de OL. También hay que resaltar, además de dH 2 O de los pozos vacíos alrededor de los cultivos celulares se evite la evaporación de los medios de cultivo, reduciendo así al mínimo las fluctuaciones en la concentración de solutos en los medios de comunicación OL. Esto proporcionará un entorno más coherente de las OPC.

5. Procesamiento de los cultivos para microscopía de inmunofluorescencia

  1. Fix culturas con 100% de metanol a -20 ° C durante 10 minutos, o 3% de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 15 min.
  2. Permeabilizar cubreobjetos con 0,1% Triton-X-100 durante 10 minutos, lavar con tampón fosfato bloque salino (PBS) y durante 1 hora en suero de cabra al 10%.
  3. Cubreobjetos se incuban con anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo durante la noche a 4 ° C.
  4. Lave cubreobjetos 3 veces con PBS, e incubar con Alexa-flúor anticuerpos conjugados secundaria (Invitrogen) diluido en solución de bloqueo durante 45 min.
  5. De contraste con 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y lavar cubreobjetos varias veces con PBS.
  6. Monte cubreobjetos en Dako fluorescentes medio de montaje.
  7. Analizar las diapositivas a través de microscopio de inmunofluorescencia. En este protocolo, las diapositivas se analizan, ya sea con una fluorescencia Zeiss Axiovert 200M invertidomicroscopio o un Zeiss LSM 510 META láser microscopio confocal de barrido.

6. De células enteras de extracción de proteínas a partir de OL enriquecido las culturas

  1. Retire 24 y culturas de la incubadora y enfriar en hielo durante 3 min.
  2. Retire con cuidado los medios de comunicación, y añadir 10-20 l de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% de desoxicolato de sodio, 1% Triton-X-100, con un 0,1% pepstatina, aprotinina, PMSF, leupeptina, ortovanadato de sodio) a cada pocillo (un mínimo de 8 pozos por muestra se sugiere).
  3. Raspe los pozos con un diámetro ancho P1000 punta de la pipeta, y la transferencia del lisado a un tubo centrífugo de 1,5 ml.
  4. Pasar el lisado a través de un calibre 30 ½ jeringa aproximadamente 15 veces, y se enfría en hielo durante 30 min.
  5. Centrifugar los tubos a 14.000 rpm (~ 20.000 g) durante 15 min a 4 ° C.
  6. Transferir el sobrenadante a tubos de centrífuga de nuevo, y guardar a -80 ° C.

7. SDS-PAGE análisis de proteínas enriquecido la cultura-OC

  1. Resolver 30 g de proteína por muestra en la reducción de buffer por SDS-PAGE en el estándar del 12% de poli-acrilamida geles.
  2. Semi-seco de transferencia de geles a membranas de PVDF.
  3. Bloquear las membranas durante 1 hora en un 5% leche desnatada en polvo en TBST (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20).
  4. Incube las membranas con anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo durante 1 hora.
  5. Lave las membranas 3 veces con TBST durante 10 minutos.
  6. Se incuban las membranas con conjugado HRP-secundaria de anticuerpos durante 45 minutos en solución de bloqueo.
  7. Lave las membranas varias veces con TBST y se incuban con Amersham ECL Plus Western Blot reactivo de detección (GE Healthcare) durante 5 min.
  8. Detectar las bandas de proteínas con una película estándar de imágenes científicas.

8. Los resultados representativos:

En este protocolo, los OPC se expanden en una monocapa de astrocitos dentro de una cultura gliales mixtos. Esta cultura gliales mixtos se deriva de la P0-P2 corteza del ratón neonatal. En el día 1 in vitro (DIV1), la cultura gliales mixtos contienen células con morfologías diferentes como se ve al microscopio de contraste de fase (figura 2a). En DIV3, una monocapa de astrocitos se empieza a formar en la base del frasco, y en DIV8, OPC se puede observar claramente en la superficie de monocapa. En DIV9, la proliferación de las OPC han alcanzado una densidad suficiente para ser purificada por la noche a la mañana de alta velocidad agitación orbital. Una vez que el proceso de purificación ha sido completada, el resultado es una población de células OPC-enriquecido. En la purificación DIV1-post, OPC tienen una morfología simple, extendiendo algunos procesos (figura 2b). En la purificación posterior DIV3, las células se han extendido una malla compleja de procesos, que recuerda a LB inmaduros. En la purificación posterior DIV6, el LB purificada han aplanado y proyectado folleto-como las estructuras de la membrana. Este desarrollo morfológico es típico de la maduración in vitro de MCO.

Microscopio de inmunofluorescencia indica que las células son purificadas de OL de linaje (Figura 3a). Cabeza de serie OPC inicialmente expresar sulfato de condroitina proteoglicanos (NG2), y se desarrollan en la mielina glicoproteína asociada (MAG) positivo LB inmaduros dentro de los tres días después de la siembra (Figura 3b). En DIV6, LB muchos expresan proteína básica de mielina (MBP), y poseen la morfología típica OL madura. OL por ciento de linaje células se cuantificaron en diferentes puntos temporales para determinar la pureza de las culturas OL-enriquecido (Fig. 3c). En la purificación posterior DIV1, las culturas son de 50 ± 14% NG2 OPC + ve, que no he MAG + o MBP + LB ve. Esto indica que el purificado OL-linaje de células se encuentran en la etapa previa a la hora de la siembra, con un número insignificante de LB diferenciados. En DIV3, LB muchos se han diferenciado en células MAG he + (24 ± 5,9%) mientras que otros mantienen el fenotipo precursor, y siguen siendo NG2 + (13 ± 8,0%). En DIV3, una pequeña proporción de células MAG + ve (3,2 al 1,2%) también son expresión de MBP. En DIV6, 20 ± 5,9% de MCO son MAG + ve mientras que el 12 ± 7,3% persisten como NG2 + OPC ve. Además, 21 ± 9,3% de las células dentro de la cultura son MBP + LB ve en este punto del tiempo. SDS-PAGE análisis muestra la expresión gradual de 2'3'-cíclico de nucleótido 3'-fosfodiesterasa (CNP) y MBP durante el período de cultivo de 6 días, lo que demuestra la capacidad de los OPC en la cultura de diferenciar en fase terminal en LB maduros (Fig. 3d ). Colectivamente, estos datos se establece a este método como una manera de producir un sistema de cultivo OL enriquecido apto para el estudio de la maduración de OL OPC.

Este protocolo también se describen los métodos para establecer OL / DRGN co-cultivos con murino de sólo fuentes de tejidos. Sin embargo, con el fin de producir el co-cultivo, DRGNs debe ser cultivada sólo para producir una red de neuritas adecuada. Estas culturas murino post-natal de neuronas se producen durante 9 días en los medios de comunicación de baja de suero con 10 suplementos FUDR M para evitar la proliferación de los fibroblastos de la contaminación y gl células ial. En el transcurso de 9 días in vitro, DRGNs aislados producen una cama neuritas densa (Fig. 4a). Esta cama es neuritas inmunopositivas de neurofilamentos marcadores neuronales 200 (NF) y Tuj1 (Fig. 4B). En este punto, los OPC purificada se puede añadir a los lechos de las neuritas, y cultivadas durante 6 días para producir myelinating co-cultivos.

En DIV6 de OL / DRGN co-cultivo, muchas MBP + LB ve se puede observar entre los NF + ve neuritas DRGN (Fig. 5a). Un examen más detenido, la Operación se ponen de manifiesto para hacer contacto con neuritas DRGN numerosas, a menudo ensheathing con una membrana de MBP + ve (Fig. 5b, c).

Figura 1
Figura 1. Imágenes de microscopio de disección de los aspectos particulares de la corteza cerebral del ratón neonatal y el aislamiento DRG. (A) Vista dorsal de un cerebro de ratón recién extraído neonatal. Las líneas punteadas indican el área donde las incisiones se debe hacer para facilitar la remoción de la capa meníngea. (B) Vista ventral del cerebro, líneas de puntos indican la zona donde la corteza se reúne el diencéfalo ventral. Incisiones profundas se debe hacer a lo largo de las líneas de puntos para ayudar al aislamiento de las cortezas. (C-c ') la representación visual de la forma de arrancar la corteza de distancia del resto del cerebro. (D) Un recién aisladas P5-P10 columna vertebral del ratón antes de que el recorte de distancia exceso de músculo y hueso (d). (e) Ubicación de los GRD de la columna vertebral. (f) El número aproximado de los GRD que debe estar aislado de un ratón. (g) A DRG con raíces largas que requieren corte antes de la digestión enzimática. La línea punteada indica la zona donde las raíces se deben recortar. (G) DRG después de cortar de raíz.

Figura 2
Figura 2. OPC se expanden dentro de una cultura gliales mixtos, se purifica, y, posteriormente, como una cultura diferenciada OL-enriquecido. (A) las imágenes de contraste de fase de cultivos mixtos de glía en diferentes etapas de desarrollo. En DIV1, las células parecen redondas con pocas células aplanadas. La estratificación de la cultura gliales mixtos comienza en DIV3, donde los astrocitos forman una monocapa uniforme en la base del frasco, en el que proliferan los OPC. OPC se ven muchas en DIV8 (flechas) adherida a la superficie de la monocapa de astrocitos. (B) Una vez purificado de la cultura gliales mixtos, DIV1 OPC han extendido sólo unos pocos procesos. En DIV3, las células se han extendido muchos procesos, una reminiscencia de la etapa intermedia de MCO. En DIV6, LB aplanado (asterisco) parecen haber producido hojas membranosas (línea discontinua). Las barras de escala, de 50 micras.

Figura 3
Figura 3. Caracterización de la LO-enriquecido la cultura. (A) Confocal de imágenes de la Operación aisladas en diferentes etapas de desarrollo. NG2 + OPC ve tienen una morfología simple, mientras que MAG LB + ve poseen múltiples procesos arborous. MBP + LB he han extendido membranosa de mielina como las hojas. Barra de escala, de 50 micras. (B) purificada OL-linaje de células se originan como OPC, y se diferencian en MAG + ve, la Operación he MBP + más de 6 DIV. En DIV1, todas las OPC son NG2 + ve, mientras que ninguno se MAG + ve o MBP + ve. En DIV3, MAG + ve y MBP pocos LB + ve ahora son evidentes. La mayoría de las MCO son MAG y MBP + ve en DIV6, con NG2 pocas + OPC ve. Barra de escala, 100 micras. (C) Los valores medios ± desviación estándar del porcentaje OL-linaje células en diferentes etapas de desarrollo de más de 6 DIV. En DIV1, todas las células de linaje son OL NG2 + ve, con un 50 ± 14% del total de células dentro de la cultura. En DIV3 y DIV6, OL-linaje células representan respectivamente el 36 ± 6,8% y 32 ± 8,4% del total de células, que consiste en proporciones variables de NG2 + ve, MAG + ve y MBP + LB ve. (D) SDS-PAGE realizado de proteína derivada de la enriquecido OL-culturas que demuestra la expresión gradual de marcadores OL-CNP y MBP durante el período de 6 DIV cultura.

Figura 4
Figura 4. Caracterización de la cultura pre-OPC DRGN siembra. (A) Fase de imágenes de contraste de DRGNs durante el período de nueve DIV cultura pre-OPC siembra. DRGNs se originan como células de cuerpo grande, con pocos procesos, y producir una red de neuritas cada vez más complejo. Barra de escala, 100 micras. (B) Confocal de imágenes de las culturas DRGN fija en DIV9 (pre-siembra OPC) y se tiñeron de las neuronas de marcadores específicos de Tuj1 y NF200. DRGNs han producido una red de neuritas en el que los OPC pueden sembrar para producir OL / DRGN myelinating co-cultivos. Barra de escala, de 50 micras.

ent "> Figura 5
Figura 5. LB co-cultivadas con resultado DRGNs en OL-mediada por la envoltura de las neuritas DRGN con MBP + membrana ve. (A) Una imagen de 4-campo confocal montaje de un DIV6 OL / DRGN co-cultivo. Muchos MBP + LB he puede ver la interacción con el lecho subyacente DRGN neuritas. Barra de escala, 100 micras. (B) A la vista ampliada confocal de MBP + LB he envolver neuritas múltiples DRGN. Barra de escala, de 50 micras. (C) ampliación digital de la región indicada en (b) cuando una neurita DRGN está envuelto con la membrana de la mucosa bucal. Barra de escala, de 25 micras.

Discussion

Este informe describe un método para aislar OPC murino para la diferenciación de las culturas OL-enriquecido o OL / DRGN co-culturas. Cuando se cultiva solo, el OPC se diferencian en MBP + LB ve, la producción de mielina, como las hojas membranosas. Cuando se añade a DRGN camas neuritas, LB envuelven las neuritas DRGN con MBP + membrana ve. Este modelo beneficia a la investigación de los complejos fundamentos que rigen OL mediada ensheathment axonal.

Aunque de gran valor, el establecimiento de estas culturas es un reto técnico. En particular, los aspectos difíciles incluyen la digestión del tejido eficiente / disociación, el mantenimiento de la cultura equilibrada pH del medio, y los cambios DRGN los medios de comunicación. Es importante tener en cuenta que la longitud de la digestión, la cantidad de tejido que se digieren y la cantidad de trituración afecta el resultado de la eficacia y al final de la disociación del tejido. No es inusual para los investigadores con experiencia para obtener bajos rendimientos celulares de disociar los tejidos del sistema nervioso. Además, los OPC murino tienden a ser sensibles a los cambios en el pH del medio de cultivo, especialmente bajo condiciones alcalinas. El mantenimiento de los cultivos en el 8,5% de CO 2 tiene por objeto prevenir esto, ya que los OPC parecen tolerar mejor las condiciones más básicas ligeramente ácido. En cuanto a DRGNs alimentación, cambios en los medios debe realizarse rápidamente ya que no para desecar las neuronas, sin embargo, debe ser suave como para no interrumpir la cama neuritas en desarrollo. Cambios bruscos de medios puede desplazar la cama neuritas del sustrato, y el resultado probable de su disociación completa de la cubreobjetos.

El mérito potencial de este modelo de sistema enormemente eclipsa su naturaleza exigente técnicamente. Una de las ventajas de este sistema es el uso de post-natal para la derivación de los ratones de cultivo celular, evitando la necesidad de sacrificar las hembras reproductoras de la cosecha del tejido embrionario. Otra ventaja es la falta de exigencia de los factores de crecimiento (FC) para la expansión de las OPC. Mezcla de culturas gliales ofrecen un entorno que apoye la difusión de las OPC, presumiblemente debido a la presencia de factores tróficos astrocitos derivados. Otros métodos, como la derivación a través de neuroesferas 7,8, se basan en las propiedades mitogénicas de FC como el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el derivado de plaquetas factor de crecimiento (PDGF) para la expansión de OPC. Del mismo modo, el uso postnatal (P5-10) de los ratones DRGNs evita la necesidad de complementar los medios de cultivo con el factor de crecimiento nervioso (NGF), un factor neurotrófico necesarios para la supervivencia in vitro de embriones DRGNs 9, 10. Es de interés para evitar el uso de NGF, ya que influye negativamente en la capacidad de myelinating LB cuando se cultivan con DRGNs 4. Evitar el uso de GF-complementado los medios de comunicación también tiene beneficios económicos, ya que estos reactivos ser costoso cuando se utiliza a gran escala.

Tal vez el beneficio más importante de este modelo de cultivo es su derivación de ratón sólo los tejidos, proporcionando así las oportunidades para obtener los OPC y DRGNs de la amplia variedad de líneas de ratones transgénicos. Esto permite el estudio de ambos DRGN y / o OPC propiedades específicas que rigen la mielinización. Esto será especialmente importante para dilucidar las interacciones receptor / ligando que regulan OL mediada por la mielinización de los axones. En total, esta técnica es de gran valor en cuanto a investigación en neurociencias, debido a sus aplicaciones a la comprensión de las señales moleculares que subyacen en la mielinización.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este proyecto fue financiado por una beca de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá a RKRWO es beneficiario de una beca de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá. El DEG es un receptor de becas post-doctorales de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá y de Institutos Canadienses de Investigación en Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Multicell 319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170-112
Minimum Essential Media (MEM) GIBCO, by Life Technologies 12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
GlutaMAX Invitrogen 35050-061
Poly-l-lysine Sigma-Aldrich P2636
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Human merosin purified protein (LN2) EMD Millipore CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF) PeproTech Inc 450-50
L-thyroxine Biochemika 89430
Holo-transferrin Sigma-Aldrich T0665
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 0080085-SA
Bovine insulin Sigma-Aldrich I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich I6634
Progesterone Sigma-Aldrich P8783
Putrescine Sigma-Aldrich P7505
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR) Sigma-Aldrich F0503
Papain solution Worthington Biochemical LS003126
DNaseI Roche Group 1010159001
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
24-well tissue culture dishes Cellstar 662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap Corning 430639
10 cm tissue culture dishes Corning 430167
10 cm petri dish Fisher Scientific 0875713
Collagenase A Roche Group 103578
CellTrics 50 μm filter (optional) PARTEC 04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody AbD Serotec MCA409S
NG2 antibody EMD Millipore AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody EMD Millipore MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody Covance SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody Fitzgerald 10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody Sigma-Aldrich N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody EMD Millipore MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody Invitrogen A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Bio-Rad 170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542

Media Recipes

100X OL-Supplement*

IngredientAmount to add
DMEM100 mL
BSA1.02 g
Progesterone0.6 mg
Putrescine161 mg
Sodium Selenite0.05 mg
3,3',5-Triiodo-L-thyronine4 mg

*Store at -80 °C in 250 μL aliquots

OL media

IngredientAmount to add
DMEM23.75 mL
100X OL-Supplement250 μL
Bovine insulin (from 1 mg/mL stock)125 μL
GlutaMAX250 μL
Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock)37.5 μL
B27 Supplement500 μL
FBS125 μL
CNTF (from 50 ng/μL stock)25 μL

Mixed glial culture media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (0.33% from stock)33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin
GlutaMAX1%

DRGN media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (1% from stock)100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin

Digestion Solution Recipes:

OPC papain solution (made up in MEM)

IngredientFinal concentration
Papain solution1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL
DNaseI60 μg/mL

DRG papain solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Papain1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL

DRG Collagenase A solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Collagenase A4 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avellana-Adalid, V. Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential. J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).
  2. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  3. Barres, B. A. Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage. Cell. 70, 31-46 (1992).
  4. Chan, J. R. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43, 183-1891 (2004).
  5. Camara, J. Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system. J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).
  6. Ishibashi, T. Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses. Neuron. 49, 823-832 (2006).
  7. Chen, Y. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  8. Pedraza, C. E. Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors. Glia. 56, 1339-1352 (2008).
  9. Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors. J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).
  10. Greene, L. A. Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons. Dev Biol. 58, 106-113 (1977).

Comments

46 Comments

  1. very nice video and presentation....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 28, 2011 - 12:44 PM
  2. Nice explanation. I have been carrying out this procedure for some time now and find that it works quite well.

    How many OPCs you generally obtain from a single mouse brain?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 26, 2012 - 4:35 PM
  3. Hi - thanks for your comment, typically I yield about ²00,000 OPCs per mouse brain (on average).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:04 AM
  4. Excellent. I am using B6 mice, usually P4-5 (because we also take cerebellar neurons from these same pups). I usually yield between 100-130,000 cells/brain. I see some differences in our protocols (I seed three brains/T75, use trypsin instead of papain, etc.). What steps have you found to dramatically increase your OPC yield post shake-off?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 12:17 PM
  5. The largest factor in OPC yield is the efficiency of your digestion (ie. minimal cell death). In addition, the age of the mice from which you isolate the mixed glial cultures is a factor. I think if you go too far past P², many OPCs will be postmitotic, and therefore limit their proliferation capacity. I usually try to go as young as possible (P0) as this seems to work best. If you absolutely need to use P4-P5, maybe try to culture your monolayers longer than 9 days - try waiting ² weeks prior to shake off. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:06 PM
  6. Thanks for the great info. That is interesting, as many of the protocols for the "DeVellis-method" use different enzymatic preparations (trypsin +/- EDTA, +/- DNAase, papain, etc.). I had basically adapted my rat OPC protocol for mice, but am realizing that they are just not the same. I will trip your papain method and let you know how things pan out. Also, is there a reason you use T²5 flasks instead of combining brains into a T75?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 4:55 PM
  7. No there is no specific reason for using T²5, simply this is what I have always been using. I would imagine combining 3 mice into a T75 flask would roughly be the same thing. Good Luck!

    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 12:00 PM
  8. Hi Ryan, nice video and explanation. Do you do lectin panning to further get rid of microglia or do you find that a 30 min incubation at 37 degrees is enough? Also, how do you know cells are ready to shake? are they always ready at day 9? what do you look for specifically?
    thank you

    Reply
    Posted by: luisa t.
    April 10, 2013 - 12:39 PM
  9. hello...I have gone through this video...very nicely presented...but I have one doubt that if I put the flasks on shaker which only maintains temp and speed but not CO² level, the pH will change...would it not allow the OPCs to survive at all??? and can I use HEPES in medium to solve this problem???
    M willingly waiting for your reply....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 4, 2012 - 12:35 PM
  10. Thank you for your comment, you are correct in that it will not work without CO² buffering. HEPES buffer will likely not solve this problem either. I'm afraid you will absolutely need to have CO² buffering for this isolation to work.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 11:56 AM
  11. Hi, very INFORMATIVE video, I zalak parikh working on glial cells. In your protocol you are not using any filter after papain digestion but I am facing one problem of Fibroblasts contamination. What could be the possible solution for this problem?
    thank you
    Zalak.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 7:59 AM
  12. Hi Zalak, thanks for your comment. What glial cell type are you trying to culture? Oligodendrocytes, astrocytes or microglia? I have never experienced fibroblast contamination.. are you sure they are fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 10:47 AM
  13. Hi there. Excellent video, very informative. I was just wondering if you can incubate the flasks in 5% CO² instead of 8% CO²?
    Thanks
    Matt

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 12:48 PM
  14. Hi Matt, Actually no, you need to have these at at least 8.5% CO² - otherwise you will have trouble establishing your mixed glial cultures - Good luck

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 10:22 PM
  15. Hi Ryan. Very nice video and presentation.
    I have to establish a DRG neuronal culture. Majority of all the papers I've read are using a embryonic source of DRG unlike you using post-natal mouse. What do you think will be the major difference between the cultures of the two??

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 1, 2012 - 12:23 PM
  16. Hi Lipi,
    You're right most papers use embryonic DRGs. The benefit of using post-natal DRGs is that you don't have to sacrifice the mother, and if you use P5-P10 mice, there is no need to use nerve growth factor (in my hands). Embryonic DRG neurons require NGF supplementation to the media for their survival. In terms of the difference between cultures, embryonic dervied ones may have a bit more contaminating cells, since I find they divide pretty quickly. Otherwise I imagine they would be the same as post-natal derived cultures. Good luck!

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    October 1, 2012 - 4:37 PM
  17. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:39 AM
  18. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:51 AM
  19. Great article Ryan. I had a question for you. Our lab generates mixed glial cell cultures by isolating NPCs from P1 mouse pup brains,expanding the NPCs via neurospheres in the presence of GFs, and then plating the spheres on matrigel for subsequent differentiation without GFs. My main goal in using the neurosphere protocol is to obtain OPCs, but I routinely get only ²0-30% O1+ OPCs following 8 days of differentiation on matrigel. GFAP+ astrocytes seem to dominate the whole culture, with OPCs growing on top of them. I wanted to try to incorporate your protocol into the neurosphere protocol by dissociating the spheres using TrypLE or Accutase, plating them on Poly-D-Lysine, letting the astrocytes grow to confluency while having OPCs proliferate on top, and then use the shaking technique to isolate OPCs. Do you think this is possible? When we perform in vitro studies with the NPCs, we usually plate the neurospheres on matrigel for a day and then trypsinize the cells for seeding into new dishes. Not only do I think the trypsin digest kills many OPCs, but I also remove astrocytes from the matrigel that then contaminate my cultures. Thanks for the help!

    Reply
    Posted by: Brett M.
    November 3, 2012 - 7:37 PM
  20. Hi Brett - To answer your question, yes I think it would be possible to do what you are suggesting. However, it seems to be a pretty roundabout approach. I think the more streamlined approach would be to simply seed your dissociated P1 neural cells onto PLL substrate to generate a monolayer. That way you would avoid having to generate neurospheres (which I imagine takes about 10 days) and then subsequently generating an astrocyte monolayer with the spheres (which would take another 10+ days). In my experience, OPCs don't like trypsin. If you wanted, you could try 0.05% Trypsin instead of 0.²5% and that seems to be more gentle. And if you don't incubate for too long, most astrocytes should remain on the plate. Hope this helps! -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    November 5, 2012 - 12:14 PM
  21. Ryan, thanks for the help! I tried your protocol and everything appeared to go well. However, one issue I ran into occurred during the overnight shaking step and subsequent differential adhesion assay to isolate a more pure population of OPCs. What I noticed was that after the overnight shaking I had many large oligospheres (maybe 10-²0 cells in size). These spheres did not stick down during the 30 minute plate incubation and I had difficulties trying to dissociate them as you described using the P1000 and P²00 tips. When I took the cells counts and plated the cells onto chamber slides, many smaller clumps remained and stuck down to the matrix. However, the clumps did not flatten out on the gel matrix very well (like neurospheres do) and eventually flaked off after about 5 days of cultures, leaving only sparse population of OPCs. Have you ever encountered this problem? I was thinking of seeding at a higher cells density than what you describe in the protocol.

    Reply
    Posted by: Brett M.
    December 2, 2012 - 10:21 PM
  22. Hi Brett - sounds like you're doing everything right. Normally I see lots of these "oligospheres" as a result of the overnight shaking protocol. However, I find that these are not the majority of OPCs, as there are many single cells and cells in clumps of ²-4. The oligospheres are difficult to dissociate, and due to this, I generally do not go out of my way to try and break them up. In my hands, these spheres spread out very nicely after about ²4hrs on Laminin-² substrate. You can try to seed at higher densities if you like, but the seeding density should be determined based on the experiment you want to conduct. For example, if you want to perform immunocytochemistry, it may not be ideal to have a very dense cell culture. Also, it's possible the clumps aren't super compatible with your matrix substrate - I always use Laminin. I hope this helps :)

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 3, 2012 - 11:42 AM
  23. HI Ryan, very informative and nice presentation. I have tried your protocol and everything seem to work fine except at the overnight shaking. There were very few OPCs isolated and it seems there are still many OPCs adhere to the astrocytes. Have you encounter this issue?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 13, 2012 - 3:25 AM
  24. Hi Esther, Thanks for your comment. How many OPCs are you yielding per mouse? I usually yield on average ²00,000 OPCs per mouse brain, but this is quite variable. At times I have yielded 500,000 or 50,000 per brain, and I'm not sure what accounts for this variability. In any case, you will never dissociate 100% of the OPCs from the monolayer, I've noticed a lot remain stuck. My advice would be to simply give it another shot and see if your yields are a bit higher next time. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 16, 2012 - 5:35 PM
  25. Thanks Ryan for your advice. My yield is definitely much lower than yours. I will definitely try another round. :)

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 16, 2012 - 8:24 PM
  26. HI Ryan, I face the problem of getting immature OPC instead of mature OPC after 6 days of OL-enriched culture. What is your view?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 2:51 AM
  27. Hi Esther, you should always expect to have some OPCs that don't differentiate during the timecourse. However, the majority of OLs should at least be expressing MAG, if not MBP at DIV6. My guess would be that your media is not exactly correct. Make sure that all the ingredients are at the correct concentration in your 100x OL-supplement stock - especially tri-iodothyronine and L-thyroxine (4mg per 100mL). I hope this helps, let me know if you still have problems.

    Posted by: Ryan O.
    January 23, 2013 - 12:56 PM
  28. Thanks Ryan for replying. I have added tri-iodothyronine only as there is no mentioned of L-thyronine in the 100x OL-supp recipe. Can i still add L-thyronine when the OL-enriched is on DIV5?

    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 8:05 PM
  29. Thanks for notifying me of this mistake, I'll notify the editorial team ASAP. Yes you can try to add it on DIV5, but no guarantees this will drive them any farther since they are aleady 5 days in. Give the protocol a second try, and let me know if the lack of differentiation still occurs. -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    January 24, 2013 - 12:47 AM
  30. Hi Luisa thanks for your comment :) I don't do lectin panning, as I find that incubation on the culture plates is enough to get rid of most of them, but if you're having a problem with microglia that is an additional option. I usually shake on day 9, but I've found you can shake anywhere from 9 to 1² days, but any longer than that you will get less OPCs. Generally if you see a lot of cells on top of the astrocyte monolayer, they are ready to go. However in my experience this dŒsn't really happen before day 9. Hope this helps RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    April 10, 2013 - 2:28 PM
  31. Hi Ryan.Thanks for this protocol. I did exactly what you have described in this protocol, except the shaking step. I did it without CO2, but the caps are tightly sealed, how is it possible that CO2 will effect pH of tightly sealed flask? My yield was very low, besides I had fibroblast contamination as well. I used uncoated flasks as well, because once during the shaking all the layer came off the bottom of the flask, what do you think would be the reason for this?.And in my experience when FBS is used in OPC culture media it made OPC's to differentiate to astrocytes rather then oligodendrocytes.Overall I couldnt replicate this procedure unfortunately and trying to find other methods..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 20, 2014 - 5:33 PM
  32. Hi Aysel - from what you describe in your message, you didn't follow my protocol.

    1) So you didn't shake the flasks? Or you didn't use the same method of shaking?

    2) As far as I know, all standard tissue culture incubators have some level of CO2 buffering (usually 5%). Strictly speaking, if you tighten the cap of your flasks, there will be no gas exchange between the incubator and the flask, if you are using plugged caps. I use vent-capped flasks (0.22um pore), so gas exchange occurs between the flask and the incubator when the caps are tight. To answer your question, CO2 buffering will have little-to-no effect on the pH of the media if you are using tightly-screwed plugged flask caps.

    3) I haven't experienced fibroblast contamination in my cultures, I imagine this would be a dissection issue. The only source of fibroblasts I can imagine would be from the meninges, so be sure to fully remove this prior to dissociation of the cortex. Unless you are confusing fibroblasts for astrocytes. Too many astrocytes is a result of too much agitation at the differential adhesion step.

    4) I have always used coated flasks, in my experience OPCs will not adhere to uncoated surfaces. I am willing to bet you'll get almost no OPCs if you continue to use uncoated flasks. If you want you can try to use other substrates such as PDL, poly-O-ornithine, collagen etc.

    5) I haven't noticed any significant transformation of OPCs into astrocytes in the presence of FBS. I imagine this might occur more frequently in immortalized OPC cell lines. Perhaps that's what you are thinking of.

    I hope this helps, otherwise best of luck in your research.

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 20, 2014 - 8:52 PM
  33. Hi Ryan, thank you ver much for detailed answer. Sorry for my english, i couldnt explain good.
    I did the shaking of course but without putting shaker inside the CO2 incubator, I did shaking at 37 degree incubation only and at 180 rpm. Because the flasks are uncoated(I have used uncoated flasks for rat OPC"s without problem, that is why I tried this way with mouse as well) I hesitated to increase rpm to 240 or so, to prevent astrocyte detachment, and I also think that fibroblast contamination is because of the meninges. Second time I will prevent it.
    It is good to know that I must use coated flasks, I will try again, if you say so.
    Thank you so much, good luck to too..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 21, 2014 - 6:22 AM
  34. Hi Again,
    Alright - I strongly suggest to put the shaker in the incubator for the overnight shake, as I have found this to be a crucial step in maintaining pH balance. The media on your cells should always be a rich red colour (indicative of a balanced pH) all the time. Mouse OPCs are very sensitive to pH, and will die with too much fluctuation. If during your shaking, the media becomes at all purple-ish or yellow-ish, your OPC yield will drastically reduce. I wouldn't be surprised either if this was a contributing factor to the monolayer detachment you experienced previously. There is a significant difference in the in vitro behaviour/viability of mouse OPCs as compared to rat, hence the generation of this protocol. Your best bet is to simply follow this protocol exactly as is.

    Thanks for your comment, and good luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 21, 2014 - 12:25 PM
  35. Hi.
    One more question Ryan, about amount of the brains seeded, I was seeding 2 rat brains/ T75 flask , in the mouse case to obtain same amount of cells seeded I was using 6 brains per flask. Would you suggest to use 3-4 instead of six? and if i seed 6 animals should I increase concentration of insulin added to mixed culture media? Overall what would be optimum amount of brains per T75 flask in your opinion? Does it matter to much? Because here you use 1 brainper T25 flask.
    Thanks again..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 26, 2014 - 4:20 PM
  36. Hi Aysel,
    Again, your best bet for success is to follow the protocol exactly as is - T25 flasks are what this method has been optimized for. I suppose T75 flasks have 3 times the surface area, so in theory 3 mice would have to be seeded to a T75 to yield the same cell density. I've never tried this protocol with T75 flasks, and I know that different culture vessels have different impact on growth and survival of OLs.
    Best - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 27, 2014 - 10:47 AM
  37. Hi Ryan . I want to say that I replicated the procedure exactly as here, and have got very good yield, but I have 1 more question to you, majority of OPCs die in the differentiation media after 6-7 days of incubation. You indicated that it is important not to distrub them until fixation, but how do you do the medium chage, I put 1 ml media first day and did 2/3 media change each 3 days, I seeded all cells to one 24 well format plate, at each time points(3 d, 6 d, 9 d) I transfer the slides to new plate and fix them there and do medium change for rest of the slides. By the way I culture OPCs at 5% CO2, becaue I have only 2 options 5% and 10%, i cant adjust ph of the incubators at this time point. Is it the contributing factor for death of the cells after 4-5 days of incubation?

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 2:43 PM
  38. Hi Aysel - I'm glad to hear things are looking up -

    1. I don't suggest differentiating the OLs for longer than 6 days. If you're finding they are not differentiating fast enough, you can add 4 mg of L-Thyroxine to the 100X OL-supplement (see the media recipe list above).

    2. It is normal to lose OLs over the time course of differentiation. That being said, you don't want to encourage death by moving the cells or culturing at low pH. You should not be changing the media of the purified OL cultures at any point - they do not require media changes. The protocol also says to culture the OLs at 8.5% CO2. Since you have access to both 5 and 10% CO2 incubators, and 8.5 is closer to 10 than it is to 5, I suggest culturing them at 10%.

    3. Rather than culturing all of your time points in one dish, use 3 dishes (one for 3 days, one for 6 etc). That way, you won't have to disturb your other time points.

    4. Do not remove the coverslips from the wells of your 24 well dish during fixation - simply add concentrated PFA directly into the media and allow to fix for about 15 mins at room temp.

    Sounds like you're almost there, Best of luck - Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 3:58 PM
  39. Let me write it again to see if I have understood you correct, you say dont do any media change ever, neither at 3 days or 6 days or further? The other things I will try what you suggest, culturing and seeding in different plates at 10% CO2
    I want to thank you a lot for your help and all of the explanations.
    Thanks ..
    Best,
    Aysel

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 4:22 PM
  40. Thats correct :)
    You're very welcome,

    Ryan

    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 5:49 PM
  41. Hi Ryan,

    Thanks for sharing this protocol, looks really good and will try it out. I have a couple of questions regarding your protocol and was hoping you could shed some light on some problem I am experiencing at the moment.

    With regards to what you have just described, we actually perform a very similar mixed glial culture on P0-P3 rat brains. Our isolation stages are very similar with the exception we use DNAse1 and L-cysteine along with Papain. Upon plating our cell suspensions the flasks are densely populated with microglia on top, then opc's below and then astrocytes. We basically shake off our microglia before doing the overnight shake for the OPC's.

    My question is how do you get rid/ not see any microglia in your mouse cultures? Is it also possible to obtain microglia from your method?

    We are currently experiencing problems with obtaining OPC's from our overnight shake (in rat). The cells look healthy when in culture with the microglia but once the microglia are removed and we perform the steps required to plate the OPC's we have a lot of contaminants in with the cells, almost like long fibrous structures that are stained by trypan blue. We still obtain + 5 million OPC's but the cells do not look healthy and the morphology is not consistent with OPC's. Upon plating these cells they fail to show characteristics of OPCs and a lot die off. I will mention we do not shake in an incubator but in an orbital shaker at 250rpm with the caps sealed tight and parafilm. Have you ever encountered this?

    Many thanks .

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    February 9, 2015 - 1:06 PM
  42. Hi Graeme, thanks for your question.
    We do in fact get microglia in our mixed cultures, but we remove them prior to the overnight shake with a slow short shake (as in the rat method). These shaken off microglia are a very pure population, and can be cultured separately if desired.
    With regard to the problems you’re encountering shaking your rat cultures, I can’t say I’ve experienced anything quite like what you’re describing. It almost sounds like your cultures are suffering from contamination (maybe yeast?). We’ve experienced contamination a couple of times, and it resulted in much of the monolayer dissociating from the base of the flask during the overnight shake. If you like, you can send me a pic of the fibrous structures in the hopes that I could recognize what they are (romea077@uottawa.ca).
    We have never had luck shaking flasks in an orbital shaker – we exclusively use tissue culture incubators with vented caps. One risk of using an orbital shaker is they pose a threat for contamination, as they are often used for bacterial cultures.
    I hope this helps and best of luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2015 - 11:12 AM
  43. Hi Ryan,

    Thanks for your reply.

    I tried the protocol and achieved very nice OPC's so everything seems ok there.

    With regards to what I was seeing after my rat OPC shake, I believe it not to be of any contamination but more something coming out of solution in our media. As a test I shook DMEM10% in a T75 flask, 37 degrees, 250rpm overnight. The next day I took an aliquot and looked at it with trypan blue. To my surprise I saw the same fibrous clumps that I was seeing after the OPC shake

    . My DMEM only contains FBS and pen-step so this has to be something in FBS. My most recent shake off I decided to shake off 5 flasks with DMEM 10% and 5 flasks with OPC media (our OPC media contains 2.5ml FBS vs 50ml in DMEM). The next day after following normal protocol I counted the cells from both conditions. The OPC media flasks had almost none of the fibrous clumps whereas the DMEM flasks had alot. I can now partially get round this problem by filtering with 40uM strainer but have you ever heard or seen this kind of thing. We have used several batches if FBS so it cannot be that every batch has precipitated proteins in it but perhaps what were doing is causing precipitation of FBS proteins that are affecting the OPC's?

    Thanks

    Graeme

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    March 15, 2015 - 4:16 PM
  44. Hi Ryan,

    Is your FBS from Invitrogen decomplemented ? If so did you buy decomplemented or did you heat it at 56*C and for how long.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Ludovic D.
    February 24, 2017 - 10:40 AM
  45. Hi Ludovic,
    I've used FBS that has been heat-inactivated by the manufacturer, and I've also used FBS that I've heat inactivated myself. For the latter, if memory serves, about 30 minutes at roughly 50 degrees C should do the trick (water bath).
    Good luck, Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2017 - 11:49 AM
  46. Hi Ryan,
    I am wondering if you have any experience with adding Cre Recombinase Adenovirus to the cultures? And if you think a particular day would be best to add it? I was thinking of adding it on D8 (1 day before the full media change) but wasn't sure if adding virus and then shaking the cells would cause too much stress?
    Thanks,
    Megan

    Reply
    Posted by: Megan R.
    April 30, 2018 - 2:39 PM

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