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Derivazione di Arricchito Culture oligodendrociti e degli oligodendrociti / Neuron mielinizzanti co-culture di tessuti murini post-natale

Neuroscience
 

Summary

Questo articolo descrive i metodi per ricavare le popolazioni murine arricchito di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) in colture primarie, che differenziano per produrre oligodendrociti maturi (OLS). Inoltre, questo rapporto descrive le tecniche per produrre murino mielinizzanti co-colture da semina OPC del mouse su un letto neurite dei neuroni dei gangli spinali del mouse (DRGNs).

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O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues. J. Vis. Exp. (54), e3324, doi:10.3791/3324 (2011).

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Abstract

Identificare i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo OL non solo è fondamentale per approfondire la nostra conoscenza della biologia OL, ma ha anche implicazioni per la comprensione della patogenesi delle malattie demielinizzanti come la sclerosi multipla (SM). Sviluppo cellulare è comunemente studiate con modelli di colture cellulari primarie. Colture cellulari primarie facilita la valutazione di un dato tipo di cellula, fornendo un ambiente controllato, privo di variabili estranee che sono presenti in vivo. Mentre le culture OL derivati ​​da ratti hanno fornito una grande quantità di conoscenza nella biologia OL, iniziative analoghe a stabilire culture OL dai topi è stata accolta con grandi ostacoli. Lo sviluppo di metodi di cultura OL murino primario è indispensabile al fine di sfruttare le linee disponibili nel topo transgenico.

Diversi metodi per l'estrazione di OPC da tessuto roditori sono state descritte, che vanno dalla derivazione neurosfere, adesione purificazione differenziale e immunopurification 1-3. Mentre molti metodi offrire il successo, la maggior parte richiedono tempi di cultura vasta e / o attrezzature costose / reagenti. Per aggirare questo, purificando OPC da tessuti murini con un adattamento del metodo originariamente descritto da McCarthy & de Vellis 2 è preferito. Questo metodo comporta fisicamente OPC separazione da una coltura mista gliali derivati ​​da cortecce roditori neonatale. Il risultato è una popolazione purificata OPC che possono essere differenziati in un OL-arricchito la cultura. Questo approccio è attraente per la sua cultura tempo relativamente breve e il requisito necessario per fattori di crescita o anticorpi immunopanning.

Durante l'esplorazione dei meccanismi di sviluppo OL in una cultura purificato è informativa, non fornisce l'ambiente più fisiologicamente rilevanti per valutare la formazione di guaina mielinica. Co-coltura OLS con i neuroni darebbe comprensione delle basi molecolari che regolano OL-mediata mielinizzazione degli assoni. Per molti OL / neuroni co-coltura studi, i neuroni dei gangli della radice dorsale (DRGNs) hanno dimostrato di essere il tipo neurone di scelta. Sono ideali per co-coltura con OLS per la loro facilità di estrazione, quantità minima di cellule contaminanti, e la formazione di posti letto dei neuriti denso. Mentre gli studi utilizzando ratto / topo mielinizzanti xenocultures sono stati pubblicati 4-6, un metodo per la derivazione di tale OL / DRGN mielinizzanti co-culture post-natale dei tessuti murino non è stata descritta. Qui vi presentiamo metodi dettagliate su come produrre in modo efficace tali colture, insieme a esempi di risultati attesi. Questi metodi sono utili per affrontare questioni rilevanti per lo sviluppo OL / funzione mielinizzanti, e sono strumenti utili nel campo delle neuroscienze.

Protocol

Dichiarazione etica

I topi utilizzati in questo lavoro sono stati curati secondo il Canadian Consiglio sulla cura degli animali (CCAC) le linee guida. L'approvazione etica per gli esperimenti condotti è stato ottenuto presso l'Università di Ottawa Animal Care Comitato con il numero di protocollo OGH-119.

1. Dissezione - corteccia del mouse neonatale per l'estrazione OPC

  1. Sacrificio P0-P2 del mouse secondo le linee guida istituzionali.
  2. Sezionare il cervello e mettere in una capsula di Petri contenente ghiacciata MEM (antibiotico-free).
  3. Trasferire il piatto ad un microscopio dissezione.
  4. Usando un bisturi con la parte dorsale del cervello fino, fare una incisione superficiale sagittalmente lungo il bordo più di ogni corteccia mediale (Fig. 1a). Questa incisione deve passare attraverso lo strato meningeo al fine di facilitare la sua rimozione.
  5. Usare bene pinze punta a staccare le meningi in maniera laterale. Se fatto con attenzione, questo strato può essere rimosso in un unico pezzo. Durante questa fase, rimuovere il bulbo olfattivo.
  6. Con il cervello lato ventrale-up, fare una profonda incisione sagittale in cui la corteccia incontra l'area ventrale del diencefalo (Fig. 1b).
  7. Con il dorsale cervello side-up, separare le cortecce dal mesencefalo facendo leva il tessuto in una mediale alla moda laterale (Fig. 1c, c '). Rimuovere eventuali residui di meningi in questa fase.
  8. Dice ogni corteccia in circa 4 pezzi e delicatamente trasferimento in un tubo da 15 ml contenente 350 ml di MEM al cervello del mouse. Tenere la provetta in ghiaccio fino a quando tutti i topi sono stati elaborati.
  9. Ripetere i passaggi 1,1-1,8 per topi rimanenti.

2. Dissociazione di cortecce neonatale e la manutenzione delle culture miste gliali

Nota: L'introduzione di bolle nella sospensione cellulare dovrebbe essere evitato durante tutte le fasi seguenti.

  1. Aggiungere il tubo da 15 ml contenente il cervello sezionato appena ad un bagno d'acqua a 37 ° C per 3 minuti.
  2. Trasferimento cervello per una cappa sterile coltura di tessuti.
  3. Delicatamente passare cortecce dadini attraverso un puntale P1000 per generare frammenti più piccoli. Smettere di pipettaggio una volta non ci sono pezzi di cervello abbastanza grande per interrompere un flusso di sospensione attraverso la punta della pipetta.
  4. Aggiungere 75 ml di soluzione OPC papaina al cervello nel tubo conico. La soluzione OPC papaina devono essere pre-riscaldato a 37 ° C per 20 minuti prima dell'uso.
  5. Incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 20 min. Circa ogni 2 minuti, capovolgere delicatamente il tubo per evitare che l'aggregazione del tessuto. Durante questo tempo, aggiungere 5 ml di mixed media cultura gliali ad ogni poli-L-lisina (PLL) rivestito (1 mg / mL) T25 pallone (un pallone al cervello di topo), e mettere in un 37 ° C di coltura tissutale incubatore a 8,5% di CO 2.
  6. Dopo 20 minuti, riportare la sospensione dei tessuti alla cappa sterile e aggiungere 2 ml di mixed media cultura gliali del cervello per il tubo. Lasciate riposare per 10 minuti a temperatura ambiente per permettere l'inattivazione della soluzione OPC papaina.
  7. Aliquota della sospensione dei tessuti in provette 5 ml di plastica. Il numero di tubi deve corrispondere al numero di cervelli sezionati, un aumento di circa 2,5 ml per provetta.
  8. Usando una sterile fiamma pipetta Pasteur in vetro lucido, delicatamente triturare il tessuto in ciascun tubo. Triturare dapprima lentamente e gradualmente aumentare la velocità come pezzi dissociano. Triturare circa 10-15 volte, tuttavia questo numero può variare in base alla efficacia della digestione.

Nota: In-triturazione si tradurrà in scarsa dissociazione del tessuto, considerando che l'eccessiva triturazione avrà un impatto negativo sulla vitalità cellulare. E 'importante non introdurre bolle nella soluzione, in quanto ciò gravi ripercussioni vitalità cellulare.

  1. Una volta non ci sono grumi di tessuto visibile rimanenti nella sospensione, trasferimento in una provetta da 50 ml contenente 4 ml di misto terreni di coltura per gliali del cervello (cioè, 4 cervelli = 16 mL tecnica mista cultura gliali).
  2. Capovolgere delicatamente la provetta 50 ml conica e ripetere per il restante 5 mL.
  3. Aliquota della sospensione cellulare raggruppati in provette da 15 ml conici (circa 6,5 ​​ml per 15 ml tubo). Il numero di provette da 15 ml deve corrispondere al numero di cervelli sezionati.
  4. Centrifugare le provette a 1200 giri al minuto (~ 300 g) per 5 min.
  5. Con attenzione aspirare il surnatante e aggiungere 1 ml di caldo mixed media cultura gliali ad ogni provetta 15 ml conica.
  6. Lentamente risospendere il pellet con una punta P1000 pipetta, facendo attenzione a non introdurre bolle. Aggiungere la sospensione cellulare da ciascun tubo per un pre-equilibrata PLL rivestite T25 fiasco, rendendo il volume totale dei terreni di coltura a 6 ml.
  7. Posizionare i contenitori in un tessuto culturale incubatore per 3-4 ore per permettere alle cellule di allegare al substrato PLL. Eseguire un cambio completo dei media pipettando i media, e l'aggiunta di 6 ml di fresca mista cultura gliali al fiaschi. Questo passaggio rimuove gran parte dei detriticausato dalla triturazione, e promuove la vitalità della cultura. Se OL / DRGN co-colture sono desiderati, fare riferimento alla sezione 3 del presente protocollo.
  8. Dopo 3 giorni di cultura, di effettuare un cambiamento di 2 / 3 dei media, rimuovendo 4 ml di media, e la sua sostituzione con 4 ml di fresca mista cultura gliali. A questo punto, un monostrato astrociti dovrebbe formarsi sulla base dei palloni.
  9. Il 6 ° giorno, eseguire un altro 2 / 3 dei media cambiamenti e completare i palloni con una concentrazione finale di 5 mcg / ml di insulina. A questo punto, un monostrato astrociti dovrebbero essere chiaramente visibile, in cima al quale OPC sarà proliferando.

3. DRGN isolamento

Nota: Per produrre OL / DRGNs co-culture, DRGNs dovrebbe essere stabilito il giorno dopo misti generazione cultura gliali. Entrambi i tipi di coltura sono cresciuti in modo indipendente, e combinati dopo 9-10 giorni.

  1. Sacrificio P5-P10 del mouse secondo le linee guida istituzionali.
  2. Estrarre la spina dorsale, e trasferirlo in una scatola di Petri pulita.
  3. Troncare i muscoli e le ossa molto dalla spina dorsale il più possibile (Fig. 1d, d '), in modo da facilitare la dissezione dei gangli delle radici dorsali (DRG).
  4. Trasferire la colonna vertebrale tagliata a una nuova piastra di Petri parte ventrale-up. Utilizzando le forbici dissezione e di partenza caudalmente, tagliare medialmente attraverso la colonna vertebrale in modo longitudinale.
  5. Utilizzando due coppie di pinze, sollevare delicatamente aprire la colonna vertebrale per esporre il midollo spinale.
  6. DRG può essere trovato al di sotto e lateralmente al midollo spinale. Utilizzando pinze a punta sottile, rimuovere delicatamente il DRG evitando danni ai gangli (Fig. 1e).
  7. Trasferire il DRG rimosso per soluzione salina tampone ghiacciata di Hank (HBSS, antibiotico-free) in un nuovo piatto di Petri. Il dissettore dovrebbe mirare ad estrarre 40 DRG per il mouse (Fig. 1f).
  8. Una volta che i DRG sono stati estratti, tagliare i DRG di radici troppo lunghi (Fig. 1 g, g ') per minimizzare l'introduzione di cellule contaminanti nella cultura (cellule gliali, fibroblasti).
  9. Trasferire il DRG di un tubo da centrifuga 1,5 ml contenente 500 ml di HBSS ghiacciata.
  10. Centrifugare a 1200 rpm (~ 300 g) per 5 minuti a 4 ° C per far sedimentare il DRG.
  11. Trasferire il provette di una cappa sterile coltura di tessuti e rimuovere il HBSS dai tubi.
  12. Aggiungere 500 ml di pre-riscaldato (20 min a 37 ° C) DRG soluzione di papaina, e incubare le provette in un bagno d'acqua a 37 ° C per 10 min. Invertire i tubi ogni 2 minuti per evitare l'aggregazione del tessuto.
  13. Ripetere il punto 3.10.
  14. Rimuovere la soluzione di papaina DRG e aggiungere 500 ml di pre-riscaldato (20 min a 37 ° C) Collagenasi Una soluzione. Incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 10 minuti, capovolgendo ogni 2 minuti.
  15. Ripetere il punto 3.10.
  16. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di DRGN media. Capovolgere diverse volte la provetta.
  17. Ripetere il punto 3.10.
  18. Ripetere il punto 3.16.
  19. Cappotto una sterile fiamma lucido vetro pipetta Pasteur con albumina sierica bovina (BSA) pipettando una soluzione di 0,25% BSA in HBSS più volte. Il rivestimento con una soluzione di BSA impedirà al DRG di aderire alle pareti della pipetta di vetro.
  20. Triturare i DRG con la BSA rivestita pipetta dolcemente in un primo momento, e con crescente intensità, una volta aggregati cominciare dissociare. Triturare circa 10-15 volte, ma questo numero dipende dal grado di digestione, e il numero di DRG per provetta.
  21. Una volta che la dissociazione è raggiunto, la sospensione passare attraverso un filtro di 50 micron in una piastra di Petri sterile contenente 7 ml di DRGN media. Filtrazione eliminerà gran parte dei detriti dalla sospensione cellulare, anche se questo passaggio non è fondamentale.
  22. Incubare la piastra Petri al 8,5% di CO 2 per circa 1,25 ore.
  23. Cappotto diversi coprioggetto 12 mm con LN2 (10 mg / ml in PBS) in un piatto ben 24 nel corso di questo tempo di incubazione.
  24. Una volta che l'incubazione è finito, osservare la piastra di Petri in campo chiaro. DRGNs sono identificati come grandi corpo, le cellule fase di buio. Agitare la piastra Petri delicatamente per sollevare qualsiasi DRGNs aderito.

Nota: Molte cellule contaminanti si hanno fortemente aderito alla capsula di Petri, arricchendo la vostra sospensione cellulare per DRGNs.

  1. Trasferire la sospensione di cellule in una provetta da 15 ml. Lavare delicatamente il piatto con 4 ml di DRGN mezzi di comunicazione per raccogliere qualsiasi DRGNs residuo. Trasferire i altri 4 ml al tubo conico.
  2. Centrifugare per 5 min a 1200 rpm (~ 300 g).
  3. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 500 ml di mezzi DRGN fresca.
  4. Calcolare il numero di DRGNs prodotto utilizzando un emocitometro. Assicurati di contare solo il DRGNs, e non altri tipi di cellule. DRGNs possono essere identificati tramite i loro corpi a grandi cellule sferiche.
  5. Seed 30.000-50.000 DRGNs ad ogni LN2 rivestite coprioggetto in 1 ml di DRGN media, e posto a 37 ° C di coltura tissutale incubatore a 8,5% di CO 2 durante la notte.
  6. La mattina seguente, eseguire un cambio completo dei media, sostituendo la DRGNmezzi di comunicazione con i media OL (meno CNTF) con una concentrazione finale di 1% Pen / Strep FuDR e 10 micron.
  7. Nei giorni 3 e 5, eseguire un cambio 3 / 4 dei media con i media stessi al punto 3.30.
  8. Giorno 7, eseguire un cambio completo dei media con i media OL (meno CNTF, Pen / Strep, FuDR).
  9. Il giorno di 9, il DRGNs avrebbe dovuto costituire un letto ampio neuriti, e ora sono pronti per essere co-coltura con OPC.

4. Purificazione di OPC da culture gliali miste per l'istituzione di OL-arricchito culture o OL / DRGN co-culture

  1. In occasione della Giornata 9 della cultura misto gliali, trasferire i flaconi di un agitatore orbitale in un 5% di CO 2 di coltura tissutale incubatore. Posizionare i contenitori sulla parte superiore del T25 fiaschi vuoti per evitare il calore generato dal agitatore orbitale, incidano negativamente sugli colture miste gliali. Lasciare le culture si stabilizzi a questo nuovo incubatore per 1 ora.
  2. Una volta che i palloni sono equilibrati, agitare i flaconi a 50 giri per 45 min. Lo scopo di questa scossa è quello di rimuovere tutte le cellule debolmente aderenti contaminare dal monostrato.
  3. Spostare le celle di un cappuccio colture di tessuti e rimuovere tutti i supporti dal fiaschi. Sostituire con 4 ml di fresca mista cultura gliali integrato con 5 mcg / ml di insulina.
  4. Posizionare i contenitori indietro sulla shaker, e permettono di equilibrare per circa 3 ore.
  5. Una volta che i palloni sono in equilibrio, li fissano in modo sicuro al agitatore orbitale, e agitare le bottiglie per circa 16 ore a 220 giri al minuto (una notte).
  6. La mattina dopo, se OL devono essere coltivate in assenza di DRGNs (cioè, OL-arricchito la cultura), rivestimento diversi coprioggetto sterili 12 mm con LN2 (10 mg / ml in PBS) per 1 ora. Trasferire i coprioggetti a 24-bene i piatti, lavare con PBS seguita da un lavaggio OL media. Aggiungere 1 ml di mezzi di OL in ciascun pozzetto ed equilibrare al 8,5% di CO 2.
  7. Equilibrare 10 centimetri piatti di coltura di tessuti al 5% di CO 2 per 30 min. Un piatto sarà richiesto per ogni 2 palloni. Questi saranno utilizzati per il differenziale adesione di arricchimento della OPC sospeso.
  8. Una volta che il periodo di 30 minuti di equilibrio è passato, il trasferimento ai media di palloni scossa ai piatti. Ogni piatto dovrebbe ricevere i supporti da 2 boccette, pari a circa 8 ml di sospensione cellulare per 10 piatti cm.
  9. Incubare i piatti al 5% di CO 2 per 30 minuti, fornendo al contempo una spinta dolce alla boa 15 min. Questo nudge aiuterà a prevenire gli OPC di aderire al piatto 10 cm.
  10. Una volta che l'incubazione è completa, esaminare i piatti in campo chiaro. OPC sono identificati come piccoli ammassi di cellule, di solito di 3-5 cellule, ma a volte formano grandi aggregati simile neurosfere. Molti non OL cellule lignaggio dovrebbe essere fermamente aderito alla base del piatto. Mescolare delicatamente i piatti di staccare qualsiasi OPC liberamente aderito, e trasferire la sospensione cellulare da ogni piatto in un tubo da 15 ml.
  11. Centrifugare a 1200 rpm (~ 300 g) per 5 min.
  12. Risospendere il pellet in 1 ml di media OL con una punta P1000 pipetta, seguita da risospensione con una punta P200 pipetta.
  13. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
  14. Per arricchito-OL culture, semi di 25.000 - 50.000 OPC ad ogni mm 12 LN2 rivestite coprioggetto in un volume finale di 1 ml mezzi OL.
  15. Per OL / DRGN co-culture, eseguire un supporto completo OL (meno CNTF) cambiamento sulla DRGNs dalla sezione [3], e delicatamente aggiungere 50.000 cellule dal OPC arricchito sospensione cellulare. Fare attenzione a non disturbare il letto neurite DRGN durante l'aggiunta di OPC.
  16. Mettere le culture in un incubatore a 37 ° C al 8,5% di CO 2, e di evitare la rimozione fino fissazione. OPC murino sono sensibili ai cambiamenti di pH, e la rimozione dal termostato altererà il pH dei media OL. Da segnalare inoltre, l'aggiunta di dH 2 O per i pozzi vuoti che circondano il colture di cellule impedisce l'evaporazione dei terreni di coltura, riducendo così al minimo le fluttuazioni nella concentrazione di soluti nei media OL. Ciò fornirà un contesto più coerente per la OPC.

5. Elaborazione di culture per microscopia di immunofluorescenza

  1. Fissare le culture con 100% di metanolo a -20 ° C per 10 minuti, o 3% paraformaldeide a temperatura ambiente per 15 min.
  2. Permeabilize coprioggetto con 0,1% Triton X-100 per 10 minuti, lavare con tampone fosfato blocco salino (PBS) e per 1 ora nel siero di capra 10%.
  3. Coprioggetto incubare con anticorpi primari diluiti in blocco soluzione notte a 4 ° C.
  4. Lavare coprioggetto 3 volte con PBS e incubare con Alexa Fluor-anticorpi secondari coniugati (Invitrogen) diluito in soluzione di blocco per 45 min.
  5. Contrasto con 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e lavare coprioggetto più volte con PBS.
  6. Monte coprioggetto in DAKO fluorescenti montaggio medio.
  7. Analizzare le diapositive tramite microscopia di immunofluorescenza. In questo protocollo, le diapositive sono stati analizzati sia con un fluorescenza Zeiss Axiovert 200M invertitamicroscopio o un Zeiss LSM 510 META microscopio a scansione laser confocale.

6. Tutta la proteina estrazione di cellule da OL-arricchito culture

  1. Rimuovere 24-culture e da incubatore e raffreddare in ghiaccio per 3 min.
  2. Rimuovere con attenzione i media, e aggiungere 10-20 ml di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, sodio desossicolato 0,5%, 1% Triton X-100, con il 0,1% pepstatina, aprotinina, PMSF, leupeptina, orthovanadate di sodio) in ciascun pozzetto (un minimo di 8 pozzetti per ogni campione è suggerito).
  3. Raschiare pozzi con un ampio tunnel P1000 punta della pipetta, e trasferire il lisato in una provetta da centrifuga da 1,5 ml.
  4. Passare il lisato attraverso un mezzo a scartamento siringa da 30 a circa 15 volte, e freddo in ghiaccio per 30 min.
  5. Centrifugare i tubi a 14.000 giri al minuto (~ 20.000 g) per 15 minuti a 4 ° C.
  6. Trasferire il surnatante in provette da centrifuga nuovi, e conservare a -80 ° C.

7. SDS-PAGE analisi arricchito-OL proteina cultura

  1. Risolvere 30 mcg di proteina per campione nella riduzione del buffer mediante SDS-PAGE su standard 12% di poli-gel di acrilammide.
  2. Semi-secco gel trasferimento su membrane PVDF.
  3. Membrane blocco per 1 ora nel 5% latte scremato in polvere in TBST (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20).
  4. Incubare membrane con anticorpi primari diluiti in blocco soluzione per 1 ora.
  5. Lavare le membrane 3 volte con TBST per 10 minuti.
  6. Incubare le membrane con anticorpi secondari HRP-coniugato per 45 minuti a bloccare soluzione.
  7. Lavare le membrane più volte con TBST, e incubare con Amersham ECL Plus reagente rilevamento western blotting (GE Healthcare) per 5 min.
  8. Rileva bande proteiche con lo standard cinematografico di imaging scientifico.

8. Rappresentante dei risultati:

In questo protocollo, OPC sono espanse su un monostrato di astrociti all'interno di una cultura mista gliali. Questa cultura mista gliali è derivato da P0-P2 corteccia topo neonatale. Al giorno 1 in vitro (DIV1), la cultura contiene cellule gliali miste con morfologie diverse come si è visto al microscopio a contrasto di fase (Fig. 2a). A DIV3, un monostrato astrociti comincia a formarsi sulla base del pallone, e DIV8, OPC può essere chiaramente osservato sulla superficie monostrato. Al DIV9, la OPC proliferanti hanno raggiunto densità sufficiente per essere purificata dalla notte ad alta velocità agitazione orbitale. Una volta che il processo di purificazione è stato completato, il risultato è un OPC-arricchito popolazione di cellule. A DIV1 post purificazione, OPC hanno morfologia semplice, estendendo i processi di pochi (Figura 2b). A DIV3 purificazione dopo, le cellule hanno esteso un reticolo complesso di processi, che ricorda OL immaturi. A DIV6 purificazione messaggio, l'OL purificati hanno appiattita e proiettato volantino-come le strutture a membrana. Questo sviluppo morfologico è tipico della maturazione in vitro degli OLS.

Microscopia a immunofluorescenza indica le cellule purificate sono di OL-lignaggio (Fig. 3a). Seminato OPC inizialmente esprimere proteoglicani condroitin solfato (NG2), e si sviluppano in glicoproteina associata alla mielina (MAG) positivo OL immaturi entro tre giorni dopo la semina (Fig. 3b). A DIV6, molti OL esprimere la proteina basica della mielina (MBP), e possedere tipica morfologia maturo OL. Percentuale OL-lignaggio cellule sono state quantificate in diversi momenti per determinare la purezza della OL arricchito culture (Fig. 3c). A DIV1 purificazione post, le culture sono 50 ± 14% NG2 OPC + ve, senza ve MAG + o MBP + OL ve. Indica la purificato OL-lignaggio cellule sono in fase di precursore al momento semina, con i numeri trascurabili di OL differenziata. A DIV3, OL molti hanno differenziate in cellule MAG + ve (24 ± 5,9%), mentre alcuni conservano il fenotipo precursore, e rimangono NG2 + (13 ± 8,0%). A DIV3, una piccola percentuale di cellule MAG + ve (3,2 1,2%) sono anche esprimere MBP. A DIV6, 20 ± 5,9% del OLS sono MAG + ve mentre il 12 ± 7,3% persistere come NG2 + OPC ve. Inoltre, 21 ± 9,3% di cellule all'interno della cultura sono MBP + OL ve a questo punto del tempo. SDS-PAGE analisi mostra l'espressione graduata di 2'3'-ciclico-nucleotide 3'-fosfodiesterasi (CNP) e MBP nel periodo cultura 6 giorni, dimostrando ulteriormente la capacità di OPC nella cultura di differenziare terminali in OL maturi (Fig. 3d ). Collettivamente, questi dati definisce questo metodo come un mezzo per produrre un OL-arricchito sistema di coltura adatto per lo studio della maturazione OL da OPC.

Questo protocollo descrive anche metodi per stabilire OL / DRGN co-culture con murino sorgenti solo tessuto. Tuttavia, al fine di produrre la co-coltura, DRGNs deve prima essere coltivati ​​solo per la produzione di una adeguata rete dei neuriti. Questi post-natale culture neuroni murini sono coltivate per 9 giorni in condizioni di scarsa mezzi siero supplementazione con 10 mM FuDR per impedire la proliferazione dei fibroblasti contaminanti e gl cellule ial. Nel corso dei 9 giorni in vitro, DRGNs isolato produrre un letto denso neurite (Fig. 4a). Questo letto è neuriti immunopositive per il neurofilamenti neuronale marcatori 200 (NF) e Tuj1 (Fig. 4b). A questo punto, OPC purificati possono essere aggiunti ai letti dei neuriti, e coltivate per altri 6 giorni di tempo per produrre mielinizzanti co-culture.

A DIV6 di OL / DRGN co-coltura, MBP molti + OL ve si possono osservare tra i + ve NF DRGN neuriti (Fig. 5a). A ben guardare, OL si evidenziano per entrare in contatto con neuriti DRGN numerose, spesso li ensheathing con un MBP + ve membrana (Fig. 5b, c).

Figura 1
Figura 1. Microscopio immagini dissezione di aspetti particolari della corteccia del mouse neonatale e l'isolamento DRG. (A) vista dorsale di un cervello appena estratti del mouse neonatale. Le linee tratteggiate indicano l'area in cui incisioni deve essere fatto per facilitare la rimozione dello strato meningeo. (B) vista ventrale del cervello, le linee tratteggiate indicano l'area in cui la corteccia incontra il diencefalo ventrale. Profonde incisioni deve essere effettuata lungo le linee tratteggiate per aiutare l'isolamento della corteccia. (C-c ') rappresentazione visiva di come sollevare la corteccia lontano dal resto del cervello. (D) Un fresco isolato P5-P10 colonna vertebrale del mouse prima di tagliare via l'eccesso muscolare e osseo (d '). (e) Ubicazione della DRG all'interno della colonna vertebrale. (f) Il numero approssimativo di DRG che devono essere isolati da un topo. (g) Un DRG con radici lunghe che richiedono rifilatura prima della digestione enzimatica. La linea tratteggiata indica la regione in cui le radici devono essere tagliati. (G ') DRG dopo root-taglio.

Figura 2
Figura 2. OPC si espandono all'interno di una coltura mista gliali, purificata, e successivamente differenziato come OL-arricchito la cultura. (A) contrasto con le immagini della fase di culture miste gliali a diversi stadi di sviluppo. A DIV1, le cellule appaiono rotonda con poche cellule appiattite. Stratificazione di cultura mista gliali inizia DIV3, dove astrociti formano un monostrato uniforme alla base del pallone, sul quale proliferano OPC. OPC molti sono visti a DIV8 (frecce) aderito alla superficie del monostrato astrociti. (B) Una volta purificata dalla cultura misto gliali, DIV1 OPC hanno esteso solo alcuni processi. A DIV3, le cellule hanno esteso molti processi, che ricorda intermedio fase OLS. A DIV6, OL appiattito (asterisco) sembrano aver prodotto fogli membranosa (linea tratteggiata). Barre di scala, a 50 micron.

Figura 3
Figura 3. Caratterizzazione di OL-arricchito la cultura. (A) le immagini confocale di OL isolati a diversi stadi di sviluppo. NG2 + OPC ve hanno una morfologia semplice, mentre MAG OL + ve possedere più processi arborous. MBP + OL ve hanno esteso mielina membranose simili a fogli. Barra della scala, 50 micron. (B) purificata OL-lignaggio cellule provengono come OPC, e si differenziano in MAG + ve, MBP OL + ve oltre 6 DIV. A DIV1, tutti OPC sono NG2 + ve, mentre nessuno si MAG + ve o MBP + ve. A DIV3, MAG + ve e MBP pochi OL + ve sono ora evidenti. La maggior parte degli OLS sono MAG e MBP + ve a DIV6, con pochi rimasti NG2 + OPC ve. Barra della scala, 100 micron. (C) I valori medi ± DS della OL-lignaggio cellule per cento a diversi stadi di sviluppo oltre 6 DIV. A DIV1, tutti OL-lignaggio cellule NG2 + ve, pari al 50 ± 14% delle cellule totali all'interno della cultura. A DIV3 e DIV6, OL-lignaggio cellule rispettivamente il 36 ± 6,8% e 32 ± 8,4% di cellule totali, composto da proporzioni variabili di NG2 + ve, MAG + ve e MBP + OL ve. (D), SDS-PAGE eseguita sulle proteine ​​derivate da arricchite OL-culture, dimostrando l'espressione graduata di OL-marcatori CNP e MBP nel periodo 6 DIV cultura.

Figura 4
Figura 4. Caratterizzazione della cultura DRGN pre-semina OPC. (A) Fase immagini a contrasto di DRGNs nel periodo 9 DIV cultura pre-semina OPC. DRGNs provengono come di corporatura grossa cellule con processi di pochi, e producono una rete sempre più complessa dei neuriti. Barra della scala, 100 micron. (B) immagini confocale di culture DRGN fissato a DIV9 (pre-semina OPC) e colorate per neurone-specifici marcatori Tuj1 e NF200. DRGNs hanno prodotto una rete di neurite su cui OPC possono essere testa di serie per la produzione di OL / DRGN mielinizzanti co-culture. Scala bar, 50 micron.

ENT "> Figura 5
Figura 5. OL co-coltura con esito DRGNs in OL-mediata confezionamento dei neuriti DRGN con MBP + membrana ve. (A) A 4-campo immagine confocale montaggio di un OL / DRGN DIV6 co-coltura. Molti MBP + OL ve può essere visto interagire con il sottostante letto neuriti DRGN. Scala grafica, 100 micron. (B) Una visione ingrandita confocale di MBP + OL ve avvolgimento neuriti DRGN multipli. Barra della scala, 50 micron. (C) ingrandimento digitale della regione indicata in (b) quando una neurite DRGN viene avvolto con membrana OL. Scala grafica, 25 micron.

Discussion

Questo rapporto descrive un metodo per isolare OPC murini per la differenziazione nelle culture OL-arricchito o OL / DRGN co-culture. Quando colta da solo, il OPC differenziarsi in MBP + OL ve, la produzione di mielina come fogli membranosa. Quando aggiunto a DRGN letti neuriti, OL avvolgono i neuriti DRGN con MBP + membrana ve. Questo modello benefici l'indagine dei fondamenti complessi che regolano OL-mediata ensheathment assonale.

Anche se di grande valore, l'istituzione di tali culture è tecnicamente impegnativo. In particolare, gli aspetti impegnativi includono la digestione efficiente dei tessuti / dissociazione, il mantenimento del pH equilibrato terreni di coltura, e DRGN cambiamenti dei media. E 'importante considerare che la lunghezza della digestione, la quantità di tessuto essere digerito e la quantità di triturazione influenza il risultato efficacia e la fine della dissociazione dei tessuti. Non è insolito per i ricercatori esperti di ottenere basse rese cellulari dissociato da tessuti del sistema nervoso. Inoltre, OPC murino tendono ad essere sensibili alle variazioni del pH dei terreni di coltura, in particolare in ambiente alcalino. Il mantenimento di culture a 8,5% CO 2 mira a prevenire questo, dal momento che OPC sembrano tollerare condizioni migliori sul leggermente acido base. Per quanto riguarda DRGNs alimentazione, i cambiamenti dei media deve essere eseguita velocemente per non essiccare i neuroni, tuttavia, deve essere gentile come non perturbare il letto neuriti via di sviluppo. Bruschi cambiamenti dei media può rimuovere il letto neuriti dal substrato, e il risultato probabilmente nella sua completa dissociazione dalla coprioggetto.

Il merito potenzialità di questo sistema modello oscura notevolmente la sua natura tecnicamente impegnativo. Un vantaggio di questo sistema è l'uso di post-natale topi per la derivazione di coltura cellulare di eludere la necessità di sacrificare femmine riproduttrici per la raccolta dei tessuti embrionali. Un altro vantaggio è la mancanza di requisiti per i fattori di crescita (GF) per l'espansione della OPC. Misti culture gliali forniscono un ambiente che supporta la propagazione della OPC, presumibilmente a causa della presenza di astrociti derivati ​​da fattori trofici. Altri metodi, come la derivazione via neurosfere 7,8, si basano sulle proprietà di GF mitogenica come fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), fattore di crescita epidermico (EGF) e delle piastrine fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) per l'espansione OPC. Allo stesso modo, usando postnatale (P5-10) per topi DRGNs evita la necessità di integrare i terreni di coltura con fattore di crescita nervosa (NGF), un fattore neurotrofico necessario per la sopravvivenza in vitro di embrioni DRGNs 9, 10. E 'di interesse per evitare l'uso di NGF poichè influenza negativamente la capacità di mielinizzanti OL quando coltivate con DRGNs 4. Evitare l'uso di GF-integrato dei media ha anche benefici economici, in quanto questi reagenti diventare costoso se utilizzato su larga scala.

Forse il vantaggio più importante di questo modello la cultura è la sua derivazione da mouse solo tessuti, fornendo così l'opportunità di derivare sia OPC e DRGNs dalla grande varietà di linee di topi transgenici. Questo permette per lo studio di entrambi e DRGN / o OPC proprietà specifiche che regolano la mielinizzazione. Questo sarà particolarmente importante per chiarire il recettore / ligando che regolano le interazioni OL-mediata mielinizzazione degli assoni. In tutto, questa tecnica è di grande valore per quanto riguarda la ricerca delle neuroscienze per le sue applicazioni verso la comprensione i segnali molecolari alla base della mielinizzazione.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo progetto è stato finanziato da una sovvenzione della Multiple Sclerosis Society of Canada a RKRWO è un destinatario di una borsa di studio dalla Multiple Sclerosis Society of Canada. SDR è un destinatario di Post-Doctoral Fellowships dalla Multiple Sclerosis Society of Canada e Canadian Institutes of Health Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Multicell 319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170-112
Minimum Essential Media (MEM) GIBCO, by Life Technologies 12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
GlutaMAX Invitrogen 35050-061
Poly-l-lysine Sigma-Aldrich P2636
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Human merosin purified protein (LN2) EMD Millipore CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF) PeproTech Inc 450-50
L-thyroxine Biochemika 89430
Holo-transferrin Sigma-Aldrich T0665
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 0080085-SA
Bovine insulin Sigma-Aldrich I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich I6634
Progesterone Sigma-Aldrich P8783
Putrescine Sigma-Aldrich P7505
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR) Sigma-Aldrich F0503
Papain solution Worthington Biochemical LS003126
DNaseI Roche Group 1010159001
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
24-well tissue culture dishes Cellstar 662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap Corning 430639
10 cm tissue culture dishes Corning 430167
10 cm petri dish Fisher Scientific 0875713
Collagenase A Roche Group 103578
CellTrics 50 μm filter (optional) PARTEC 04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody AbD Serotec MCA409S
NG2 antibody EMD Millipore AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody EMD Millipore MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody Covance SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody Fitzgerald 10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody Sigma-Aldrich N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody EMD Millipore MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody Invitrogen A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Bio-Rad 170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542

Media Recipes

100X OL-Supplement*

IngredientAmount to add
DMEM100 mL
BSA1.02 g
Progesterone0.6 mg
Putrescine161 mg
Sodium Selenite0.05 mg
3,3',5-Triiodo-L-thyronine4 mg

*Store at -80 °C in 250 μL aliquots

OL media

IngredientAmount to add
DMEM23.75 mL
100X OL-Supplement250 μL
Bovine insulin (from 1 mg/mL stock)125 μL
GlutaMAX250 μL
Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock)37.5 μL
B27 Supplement500 μL
FBS125 μL
CNTF (from 50 ng/μL stock)25 μL

Mixed glial culture media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (0.33% from stock)33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin
GlutaMAX1%

DRGN media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (1% from stock)100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin

Digestion Solution Recipes:

OPC papain solution (made up in MEM)

IngredientFinal concentration
Papain solution1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL
DNaseI60 μg/mL

DRG papain solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Papain1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL

DRG Collagenase A solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Collagenase A4 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avellana-Adalid, V. Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential. J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).
  2. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  3. Barres, B. A. Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage. Cell. 70, 31-46 (1992).
  4. Chan, J. R. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43, 183-1891 (2004).
  5. Camara, J. Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system. J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).
  6. Ishibashi, T. Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses. Neuron. 49, 823-832 (2006).
  7. Chen, Y. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  8. Pedraza, C. E. Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors. Glia. 56, 1339-1352 (2008).
  9. Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors. J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).
  10. Greene, L. A. Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons. Dev Biol. 58, 106-113 (1977).

Comments

46 Comments

  1. very nice video and presentation....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 28, 2011 - 12:44 PM
  2. Nice explanation. I have been carrying out this procedure for some time now and find that it works quite well.

    How many OPCs you generally obtain from a single mouse brain?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 26, 2012 - 4:35 PM
  3. Hi - thanks for your comment, typically I yield about ²00,000 OPCs per mouse brain (on average).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:04 AM
  4. Excellent. I am using B6 mice, usually P4-5 (because we also take cerebellar neurons from these same pups). I usually yield between 100-130,000 cells/brain. I see some differences in our protocols (I seed three brains/T75, use trypsin instead of papain, etc.). What steps have you found to dramatically increase your OPC yield post shake-off?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 12:17 PM
  5. The largest factor in OPC yield is the efficiency of your digestion (ie. minimal cell death). In addition, the age of the mice from which you isolate the mixed glial cultures is a factor. I think if you go too far past P², many OPCs will be postmitotic, and therefore limit their proliferation capacity. I usually try to go as young as possible (P0) as this seems to work best. If you absolutely need to use P4-P5, maybe try to culture your monolayers longer than 9 days - try waiting ² weeks prior to shake off. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:06 PM
  6. Thanks for the great info. That is interesting, as many of the protocols for the "DeVellis-method" use different enzymatic preparations (trypsin +/- EDTA, +/- DNAase, papain, etc.). I had basically adapted my rat OPC protocol for mice, but am realizing that they are just not the same. I will trip your papain method and let you know how things pan out. Also, is there a reason you use T²5 flasks instead of combining brains into a T75?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 4:55 PM
  7. No there is no specific reason for using T²5, simply this is what I have always been using. I would imagine combining 3 mice into a T75 flask would roughly be the same thing. Good Luck!

    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 12:00 PM
  8. Hi Ryan, nice video and explanation. Do you do lectin panning to further get rid of microglia or do you find that a 30 min incubation at 37 degrees is enough? Also, how do you know cells are ready to shake? are they always ready at day 9? what do you look for specifically?
    thank you

    Reply
    Posted by: luisa t.
    April 10, 2013 - 12:39 PM
  9. hello...I have gone through this video...very nicely presented...but I have one doubt that if I put the flasks on shaker which only maintains temp and speed but not CO² level, the pH will change...would it not allow the OPCs to survive at all??? and can I use HEPES in medium to solve this problem???
    M willingly waiting for your reply....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 4, 2012 - 12:35 PM
  10. Thank you for your comment, you are correct in that it will not work without CO² buffering. HEPES buffer will likely not solve this problem either. I'm afraid you will absolutely need to have CO² buffering for this isolation to work.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 11:56 AM
  11. Hi, very INFORMATIVE video, I zalak parikh working on glial cells. In your protocol you are not using any filter after papain digestion but I am facing one problem of Fibroblasts contamination. What could be the possible solution for this problem?
    thank you
    Zalak.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 7:59 AM
  12. Hi Zalak, thanks for your comment. What glial cell type are you trying to culture? Oligodendrocytes, astrocytes or microglia? I have never experienced fibroblast contamination.. are you sure they are fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 10:47 AM
  13. Hi there. Excellent video, very informative. I was just wondering if you can incubate the flasks in 5% CO² instead of 8% CO²?
    Thanks
    Matt

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 12:48 PM
  14. Hi Matt, Actually no, you need to have these at at least 8.5% CO² - otherwise you will have trouble establishing your mixed glial cultures - Good luck

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 10:22 PM
  15. Hi Ryan. Very nice video and presentation.
    I have to establish a DRG neuronal culture. Majority of all the papers I've read are using a embryonic source of DRG unlike you using post-natal mouse. What do you think will be the major difference between the cultures of the two??

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 1, 2012 - 12:23 PM
  16. Hi Lipi,
    You're right most papers use embryonic DRGs. The benefit of using post-natal DRGs is that you don't have to sacrifice the mother, and if you use P5-P10 mice, there is no need to use nerve growth factor (in my hands). Embryonic DRG neurons require NGF supplementation to the media for their survival. In terms of the difference between cultures, embryonic dervied ones may have a bit more contaminating cells, since I find they divide pretty quickly. Otherwise I imagine they would be the same as post-natal derived cultures. Good luck!

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    October 1, 2012 - 4:37 PM
  17. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:39 AM
  18. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:51 AM
  19. Great article Ryan. I had a question for you. Our lab generates mixed glial cell cultures by isolating NPCs from P1 mouse pup brains,expanding the NPCs via neurospheres in the presence of GFs, and then plating the spheres on matrigel for subsequent differentiation without GFs. My main goal in using the neurosphere protocol is to obtain OPCs, but I routinely get only ²0-30% O1+ OPCs following 8 days of differentiation on matrigel. GFAP+ astrocytes seem to dominate the whole culture, with OPCs growing on top of them. I wanted to try to incorporate your protocol into the neurosphere protocol by dissociating the spheres using TrypLE or Accutase, plating them on Poly-D-Lysine, letting the astrocytes grow to confluency while having OPCs proliferate on top, and then use the shaking technique to isolate OPCs. Do you think this is possible? When we perform in vitro studies with the NPCs, we usually plate the neurospheres on matrigel for a day and then trypsinize the cells for seeding into new dishes. Not only do I think the trypsin digest kills many OPCs, but I also remove astrocytes from the matrigel that then contaminate my cultures. Thanks for the help!

    Reply
    Posted by: Brett M.
    November 3, 2012 - 7:37 PM
  20. Hi Brett - To answer your question, yes I think it would be possible to do what you are suggesting. However, it seems to be a pretty roundabout approach. I think the more streamlined approach would be to simply seed your dissociated P1 neural cells onto PLL substrate to generate a monolayer. That way you would avoid having to generate neurospheres (which I imagine takes about 10 days) and then subsequently generating an astrocyte monolayer with the spheres (which would take another 10+ days). In my experience, OPCs don't like trypsin. If you wanted, you could try 0.05% Trypsin instead of 0.²5% and that seems to be more gentle. And if you don't incubate for too long, most astrocytes should remain on the plate. Hope this helps! -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    November 5, 2012 - 12:14 PM
  21. Ryan, thanks for the help! I tried your protocol and everything appeared to go well. However, one issue I ran into occurred during the overnight shaking step and subsequent differential adhesion assay to isolate a more pure population of OPCs. What I noticed was that after the overnight shaking I had many large oligospheres (maybe 10-²0 cells in size). These spheres did not stick down during the 30 minute plate incubation and I had difficulties trying to dissociate them as you described using the P1000 and P²00 tips. When I took the cells counts and plated the cells onto chamber slides, many smaller clumps remained and stuck down to the matrix. However, the clumps did not flatten out on the gel matrix very well (like neurospheres do) and eventually flaked off after about 5 days of cultures, leaving only sparse population of OPCs. Have you ever encountered this problem? I was thinking of seeding at a higher cells density than what you describe in the protocol.

    Reply
    Posted by: Brett M.
    December 2, 2012 - 10:21 PM
  22. Hi Brett - sounds like you're doing everything right. Normally I see lots of these "oligospheres" as a result of the overnight shaking protocol. However, I find that these are not the majority of OPCs, as there are many single cells and cells in clumps of ²-4. The oligospheres are difficult to dissociate, and due to this, I generally do not go out of my way to try and break them up. In my hands, these spheres spread out very nicely after about ²4hrs on Laminin-² substrate. You can try to seed at higher densities if you like, but the seeding density should be determined based on the experiment you want to conduct. For example, if you want to perform immunocytochemistry, it may not be ideal to have a very dense cell culture. Also, it's possible the clumps aren't super compatible with your matrix substrate - I always use Laminin. I hope this helps :)

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 3, 2012 - 11:42 AM
  23. HI Ryan, very informative and nice presentation. I have tried your protocol and everything seem to work fine except at the overnight shaking. There were very few OPCs isolated and it seems there are still many OPCs adhere to the astrocytes. Have you encounter this issue?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 13, 2012 - 3:25 AM
  24. Hi Esther, Thanks for your comment. How many OPCs are you yielding per mouse? I usually yield on average ²00,000 OPCs per mouse brain, but this is quite variable. At times I have yielded 500,000 or 50,000 per brain, and I'm not sure what accounts for this variability. In any case, you will never dissociate 100% of the OPCs from the monolayer, I've noticed a lot remain stuck. My advice would be to simply give it another shot and see if your yields are a bit higher next time. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 16, 2012 - 5:35 PM
  25. Thanks Ryan for your advice. My yield is definitely much lower than yours. I will definitely try another round. :)

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 16, 2012 - 8:24 PM
  26. HI Ryan, I face the problem of getting immature OPC instead of mature OPC after 6 days of OL-enriched culture. What is your view?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 2:51 AM
  27. Hi Esther, you should always expect to have some OPCs that don't differentiate during the timecourse. However, the majority of OLs should at least be expressing MAG, if not MBP at DIV6. My guess would be that your media is not exactly correct. Make sure that all the ingredients are at the correct concentration in your 100x OL-supplement stock - especially tri-iodothyronine and L-thyroxine (4mg per 100mL). I hope this helps, let me know if you still have problems.

    Posted by: Ryan O.
    January 23, 2013 - 12:56 PM
  28. Thanks Ryan for replying. I have added tri-iodothyronine only as there is no mentioned of L-thyronine in the 100x OL-supp recipe. Can i still add L-thyronine when the OL-enriched is on DIV5?

    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 8:05 PM
  29. Thanks for notifying me of this mistake, I'll notify the editorial team ASAP. Yes you can try to add it on DIV5, but no guarantees this will drive them any farther since they are aleady 5 days in. Give the protocol a second try, and let me know if the lack of differentiation still occurs. -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    January 24, 2013 - 12:47 AM
  30. Hi Luisa thanks for your comment :) I don't do lectin panning, as I find that incubation on the culture plates is enough to get rid of most of them, but if you're having a problem with microglia that is an additional option. I usually shake on day 9, but I've found you can shake anywhere from 9 to 1² days, but any longer than that you will get less OPCs. Generally if you see a lot of cells on top of the astrocyte monolayer, they are ready to go. However in my experience this dŒsn't really happen before day 9. Hope this helps RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    April 10, 2013 - 2:28 PM
  31. Hi Ryan.Thanks for this protocol. I did exactly what you have described in this protocol, except the shaking step. I did it without CO2, but the caps are tightly sealed, how is it possible that CO2 will effect pH of tightly sealed flask? My yield was very low, besides I had fibroblast contamination as well. I used uncoated flasks as well, because once during the shaking all the layer came off the bottom of the flask, what do you think would be the reason for this?.And in my experience when FBS is used in OPC culture media it made OPC's to differentiate to astrocytes rather then oligodendrocytes.Overall I couldnt replicate this procedure unfortunately and trying to find other methods..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 20, 2014 - 5:33 PM
  32. Hi Aysel - from what you describe in your message, you didn't follow my protocol.

    1) So you didn't shake the flasks? Or you didn't use the same method of shaking?

    2) As far as I know, all standard tissue culture incubators have some level of CO2 buffering (usually 5%). Strictly speaking, if you tighten the cap of your flasks, there will be no gas exchange between the incubator and the flask, if you are using plugged caps. I use vent-capped flasks (0.22um pore), so gas exchange occurs between the flask and the incubator when the caps are tight. To answer your question, CO2 buffering will have little-to-no effect on the pH of the media if you are using tightly-screwed plugged flask caps.

    3) I haven't experienced fibroblast contamination in my cultures, I imagine this would be a dissection issue. The only source of fibroblasts I can imagine would be from the meninges, so be sure to fully remove this prior to dissociation of the cortex. Unless you are confusing fibroblasts for astrocytes. Too many astrocytes is a result of too much agitation at the differential adhesion step.

    4) I have always used coated flasks, in my experience OPCs will not adhere to uncoated surfaces. I am willing to bet you'll get almost no OPCs if you continue to use uncoated flasks. If you want you can try to use other substrates such as PDL, poly-O-ornithine, collagen etc.

    5) I haven't noticed any significant transformation of OPCs into astrocytes in the presence of FBS. I imagine this might occur more frequently in immortalized OPC cell lines. Perhaps that's what you are thinking of.

    I hope this helps, otherwise best of luck in your research.

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 20, 2014 - 8:52 PM
  33. Hi Ryan, thank you ver much for detailed answer. Sorry for my english, i couldnt explain good.
    I did the shaking of course but without putting shaker inside the CO2 incubator, I did shaking at 37 degree incubation only and at 180 rpm. Because the flasks are uncoated(I have used uncoated flasks for rat OPC"s without problem, that is why I tried this way with mouse as well) I hesitated to increase rpm to 240 or so, to prevent astrocyte detachment, and I also think that fibroblast contamination is because of the meninges. Second time I will prevent it.
    It is good to know that I must use coated flasks, I will try again, if you say so.
    Thank you so much, good luck to too..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 21, 2014 - 6:22 AM
  34. Hi Again,
    Alright - I strongly suggest to put the shaker in the incubator for the overnight shake, as I have found this to be a crucial step in maintaining pH balance. The media on your cells should always be a rich red colour (indicative of a balanced pH) all the time. Mouse OPCs are very sensitive to pH, and will die with too much fluctuation. If during your shaking, the media becomes at all purple-ish or yellow-ish, your OPC yield will drastically reduce. I wouldn't be surprised either if this was a contributing factor to the monolayer detachment you experienced previously. There is a significant difference in the in vitro behaviour/viability of mouse OPCs as compared to rat, hence the generation of this protocol. Your best bet is to simply follow this protocol exactly as is.

    Thanks for your comment, and good luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 21, 2014 - 12:25 PM
  35. Hi.
    One more question Ryan, about amount of the brains seeded, I was seeding 2 rat brains/ T75 flask , in the mouse case to obtain same amount of cells seeded I was using 6 brains per flask. Would you suggest to use 3-4 instead of six? and if i seed 6 animals should I increase concentration of insulin added to mixed culture media? Overall what would be optimum amount of brains per T75 flask in your opinion? Does it matter to much? Because here you use 1 brainper T25 flask.
    Thanks again..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 26, 2014 - 4:20 PM
  36. Hi Aysel,
    Again, your best bet for success is to follow the protocol exactly as is - T25 flasks are what this method has been optimized for. I suppose T75 flasks have 3 times the surface area, so in theory 3 mice would have to be seeded to a T75 to yield the same cell density. I've never tried this protocol with T75 flasks, and I know that different culture vessels have different impact on growth and survival of OLs.
    Best - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 27, 2014 - 10:47 AM
  37. Hi Ryan . I want to say that I replicated the procedure exactly as here, and have got very good yield, but I have 1 more question to you, majority of OPCs die in the differentiation media after 6-7 days of incubation. You indicated that it is important not to distrub them until fixation, but how do you do the medium chage, I put 1 ml media first day and did 2/3 media change each 3 days, I seeded all cells to one 24 well format plate, at each time points(3 d, 6 d, 9 d) I transfer the slides to new plate and fix them there and do medium change for rest of the slides. By the way I culture OPCs at 5% CO2, becaue I have only 2 options 5% and 10%, i cant adjust ph of the incubators at this time point. Is it the contributing factor for death of the cells after 4-5 days of incubation?

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 2:43 PM
  38. Hi Aysel - I'm glad to hear things are looking up -

    1. I don't suggest differentiating the OLs for longer than 6 days. If you're finding they are not differentiating fast enough, you can add 4 mg of L-Thyroxine to the 100X OL-supplement (see the media recipe list above).

    2. It is normal to lose OLs over the time course of differentiation. That being said, you don't want to encourage death by moving the cells or culturing at low pH. You should not be changing the media of the purified OL cultures at any point - they do not require media changes. The protocol also says to culture the OLs at 8.5% CO2. Since you have access to both 5 and 10% CO2 incubators, and 8.5 is closer to 10 than it is to 5, I suggest culturing them at 10%.

    3. Rather than culturing all of your time points in one dish, use 3 dishes (one for 3 days, one for 6 etc). That way, you won't have to disturb your other time points.

    4. Do not remove the coverslips from the wells of your 24 well dish during fixation - simply add concentrated PFA directly into the media and allow to fix for about 15 mins at room temp.

    Sounds like you're almost there, Best of luck - Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 3:58 PM
  39. Let me write it again to see if I have understood you correct, you say dont do any media change ever, neither at 3 days or 6 days or further? The other things I will try what you suggest, culturing and seeding in different plates at 10% CO2
    I want to thank you a lot for your help and all of the explanations.
    Thanks ..
    Best,
    Aysel

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 4:22 PM
  40. Thats correct :)
    You're very welcome,

    Ryan

    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 5:49 PM
  41. Hi Ryan,

    Thanks for sharing this protocol, looks really good and will try it out. I have a couple of questions regarding your protocol and was hoping you could shed some light on some problem I am experiencing at the moment.

    With regards to what you have just described, we actually perform a very similar mixed glial culture on P0-P3 rat brains. Our isolation stages are very similar with the exception we use DNAse1 and L-cysteine along with Papain. Upon plating our cell suspensions the flasks are densely populated with microglia on top, then opc's below and then astrocytes. We basically shake off our microglia before doing the overnight shake for the OPC's.

    My question is how do you get rid/ not see any microglia in your mouse cultures? Is it also possible to obtain microglia from your method?

    We are currently experiencing problems with obtaining OPC's from our overnight shake (in rat). The cells look healthy when in culture with the microglia but once the microglia are removed and we perform the steps required to plate the OPC's we have a lot of contaminants in with the cells, almost like long fibrous structures that are stained by trypan blue. We still obtain + 5 million OPC's but the cells do not look healthy and the morphology is not consistent with OPC's. Upon plating these cells they fail to show characteristics of OPCs and a lot die off. I will mention we do not shake in an incubator but in an orbital shaker at 250rpm with the caps sealed tight and parafilm. Have you ever encountered this?

    Many thanks .

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    February 9, 2015 - 1:06 PM
  42. Hi Graeme, thanks for your question.
    We do in fact get microglia in our mixed cultures, but we remove them prior to the overnight shake with a slow short shake (as in the rat method). These shaken off microglia are a very pure population, and can be cultured separately if desired.
    With regard to the problems you’re encountering shaking your rat cultures, I can’t say I’ve experienced anything quite like what you’re describing. It almost sounds like your cultures are suffering from contamination (maybe yeast?). We’ve experienced contamination a couple of times, and it resulted in much of the monolayer dissociating from the base of the flask during the overnight shake. If you like, you can send me a pic of the fibrous structures in the hopes that I could recognize what they are (romea077@uottawa.ca).
    We have never had luck shaking flasks in an orbital shaker – we exclusively use tissue culture incubators with vented caps. One risk of using an orbital shaker is they pose a threat for contamination, as they are often used for bacterial cultures.
    I hope this helps and best of luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2015 - 11:12 AM
  43. Hi Ryan,

    Thanks for your reply.

    I tried the protocol and achieved very nice OPC's so everything seems ok there.

    With regards to what I was seeing after my rat OPC shake, I believe it not to be of any contamination but more something coming out of solution in our media. As a test I shook DMEM10% in a T75 flask, 37 degrees, 250rpm overnight. The next day I took an aliquot and looked at it with trypan blue. To my surprise I saw the same fibrous clumps that I was seeing after the OPC shake

    . My DMEM only contains FBS and pen-step so this has to be something in FBS. My most recent shake off I decided to shake off 5 flasks with DMEM 10% and 5 flasks with OPC media (our OPC media contains 2.5ml FBS vs 50ml in DMEM). The next day after following normal protocol I counted the cells from both conditions. The OPC media flasks had almost none of the fibrous clumps whereas the DMEM flasks had alot. I can now partially get round this problem by filtering with 40uM strainer but have you ever heard or seen this kind of thing. We have used several batches if FBS so it cannot be that every batch has precipitated proteins in it but perhaps what were doing is causing precipitation of FBS proteins that are affecting the OPC's?

    Thanks

    Graeme

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    March 15, 2015 - 4:16 PM
  44. Hi Ryan,

    Is your FBS from Invitrogen decomplemented ? If so did you buy decomplemented or did you heat it at 56*C and for how long.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Ludovic D.
    February 24, 2017 - 10:40 AM
  45. Hi Ludovic,
    I've used FBS that has been heat-inactivated by the manufacturer, and I've also used FBS that I've heat inactivated myself. For the latter, if memory serves, about 30 minutes at roughly 50 degrees C should do the trick (water bath).
    Good luck, Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2017 - 11:49 AM
  46. Hi Ryan,
    I am wondering if you have any experience with adding Cre Recombinase Adenovirus to the cultures? And if you think a particular day would be best to add it? I was thinking of adding it on D8 (1 day before the full media change) but wasn't sure if adding virus and then shaking the cells would cause too much stress?
    Thanks,
    Megan

    Reply
    Posted by: Megan R.
    April 30, 2018 - 2:39 PM

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