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Oligodendrocyte संस्कृति समृद्ध और Oligodendrocyte न्यूरॉन / डाक प्रसव murine ऊतकों से सह संस्कृतियों Myelinating की व्युत्पत्ति

Neuroscience
 

Summary

इस अनुच्छेद के प्राथमिक संस्कृति में समृद्ध murine oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (OPCs) की आबादी, जो परिपक्व oligodendrocytes (OLS) उत्पादन अंतर प्राप्त करने के तरीकों का वर्णन करता है. इसके अलावा, इस रिपोर्ट तकनीक का वर्णन करने के लिए उत्पादन murine माउस पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स (DRGNs) के एक neurite बिस्तर पर माउस OPCs बोने द्वारा सह संस्कृतियों myelinating.

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O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues. J. Vis. Exp. (54), e3324, doi:10.3791/3324 (2011).

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Abstract

Protocol

आचार विवरण

इस काम में इस्तेमाल चूहों कैनेडियन परिषद (CCAC) जानवर की देखभाल पर दिशा निर्देशों के अनुसार करने के लिए परवाह थे. किए गए प्रयोगों के लिए नैतिक अनुमोदन प्रोटोकॉल संख्या OGH 119 के तहत ओटावा जानवर की देखभाल समिति के विश्वविद्यालय से प्राप्त हुई थी.

1. विच्छेदन - OPC निकासी के लिए नवजात माउस प्रांतस्था

  1. संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार P0-P2 माउस बलिदान.
  2. मस्तिष्क और ठंडा सदस्य (एंटीबायोटिक मुक्त) से युक्त एक पेट्री डिश में जगह काटना.
  3. एक विच्छेदन खुर्दबीन पकवान स्थानांतरण.
  4. मस्तिष्क पृष्ठीय पक्ष के साथ एक स्केलपेल का उपयोग, एक उथले चीरा sagittally प्रत्येक प्रांतस्था (चित्र 1a) का सबसे औसत दर्जे का बढ़त के साथ. यह चीरा केवल meningeal परत के माध्यम से गुजरती हैं क्रम में करने के लिए अपने हटाने की सुविधा के लिए चाहिए.
  5. एक पार्श्व फैशन में meninges बंद छील करने के लिए ठीक इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग करें. यदि सावधानी से किया है, इस परत एक टुकड़ा में हटाया जा सकता है. इस कदम के दौरान, घ्राण बल्ब हटा दें.
  6. मस्तिष्क ventral पक्ष के साथ, एक गहरी बाण के समान चीरा है जहां प्रांतस्था diencephalon के उदर क्षेत्र (चित्र 1b) से मिलता है.
  7. मस्तिष्क पक्ष पृष्ठीय पार्श्व फैशन (चित्र -1 सी, ग ') के लिए एक औसत दर्जे का ऊतक prying द्वारा midbrain से cortices अलग. इस कदम पर किसी भी अवशिष्ट meninges निकालें.
  8. लगभग 4 टुकड़ों में प्रत्येक प्रांतस्था पासा और धीरे से एक 15 एमएल शंक्वाकार सदस्य प्रति माउस मस्तिष्क के 350 μL युक्त ट्यूब को हस्तांतरण. बर्फ पर ट्यूब रखें जब तक सभी चूहों को संसाधित किया गया है.
  9. दोहराएँ 1.1-1.8 शेष चूहों के लिए एक कदम है.

2. मिश्रित glial संस्कृतियों के नवजात cortices और रखरखाव की हदबंदी

नोट: सेल निलंबन में बुलबुले की शुरूआत निम्नलिखित सभी चरणों के दौरान से बचा जाना चाहिए.

  1. 15 एमएल शंक्वाकार 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के लिए हौसले से dissected दिमाग युक्त ट्यूब जोड़ें.
  2. एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड दिमाग स्थानांतरण.
  3. धीरे P1000 विंदुक टिप करने के लिए छोटे टुकड़े उत्पन्न के माध्यम से diced cortices गुजरती हैं. Pipetting एक बार वहाँ कोई मस्तिष्क टुकड़े कर रहे हैं काफी बड़े विंदुक टिप के माध्यम से एक निलंबन के निर्बाध प्रवाह को बाधित करना बंद करो.
  4. OPC मस्तिष्क प्रति papain समाधान के शंक्वाकार ट्यूब में 75 μL जोड़ें. OPC papain समाधान होना चाहिए 37 पर पूर्व गरम ° पहले 20 मिनट के लिए सी का उपयोग करने के लिए.
  5. 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं. लगभग हर 2 मिनट, धीरे से ऊतक एकत्रीकरण को रोकने के लिए ट्यूब पलटना. इस समय के दौरान, प्रत्येक (पीएलएल) पाली एल lysine लेपित (1 मिलीग्राम / एमएल) T25 फ्लास्क (माउस मस्तिष्क के प्रति एक फ्लास्क), और जगह में एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में मिश्रित glial संस्कृति मीडिया के 5 एमएल जोड़ें 8.5% सीओ 2.
  6. 20 मिनट के बाद, बाँझ हुड ऊतक निलंबन वापसी और ट्यूब मिश्रित मस्तिष्क प्रति glial संस्कृति मीडिया के 2 एमएल जोड़ने. चलो कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए बैठने के लिए OPC papain समाधान की निष्क्रियता की अनुमति.
  7. विभाज्य 5 एमएल प्लास्टिक की नलियों में ऊतक निलंबन. ट्यूबों की संख्या dissected दिमाग की संख्या मैच, ट्यूब प्रति लगभग 2.5 एमएल में जिसके परिणामस्वरूप चाहिए.
  8. एक बाँझ लौ पॉलिश कांच पाश्चर विंदुक का प्रयोग, धीरे प्रत्येक ट्यूब में ऊतक triturate. धीरे धीरे पहली बार में Triturate, और धीरे - धीरे गति को बढ़ाने के रूप में टुकड़े अलग कर देना. Triturate लगभग 10-15 बार, लेकिन इस संख्या में पाचन की प्रभावकारिता के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.

नोट: के तहत trituration गरीब हदबंदी के ऊतक में परिणाम है, जबकि पर-trituration सेल व्यवहार्यता पर नकारात्मक असर होगा. यह महत्वपूर्ण है समाधान में शुरू करने के लिए नहीं बुलबुले के रूप में इस गंभीर रूप से सेल व्यवहार्यता प्रभाव होगा.

  1. एक बार वहाँ नहीं दिखाई ऊतक clumps के निलंबन में शेष रहे हैं, एक 50 एमएल शंक्वाकार मिश्रित मस्तिष्क प्रति glial संस्कृति मीडिया के 4 एमएल (यानी, 4 दिमाग = 16 एमएल मिश्रित glial संस्कृति मीडिया) युक्त ट्यूब को हस्तांतरण.
  2. धीरे 50 एमएल शंक्वाकार और शेष 5 एमएल ट्यूबों के लिए ट्यूब दोहराने पलटना.
  3. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों (लगभग 15 एमएल ट्यूब प्रति 6.5 एमएल) में जमा सेल निलंबन विभाज्य. 15 एमएल ट्यूब की संख्या dissected दिमाग की संख्या मैच चाहिए.
  4. 5 मिनट के लिए 1200 rpm (~ 300 ग्राम) पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों.
  5. ध्यान aspirate सतह पर तैरनेवाला और प्रत्येक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब गर्म मिश्रित glial संस्कृति मीडिया के 1 एमएल जोड़ने.
  6. धीरे धीरे एक P1000 विंदुक टिप के साथ गोली resuspend, बुलबुले परिचय नहीं सावधान किया जा रहा है. प्रत्येक ट्यूब से एक पूर्व equilibrated PLL लेपित T25 फ्लास्क सेल निलंबन जोड़ें, 6 एमएल संस्कृति मीडिया की कुल मात्रा प्रतिपादन.
  7. 3-4 घंटे के लिए एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में बोतल प्लेस कोशिकाओं PLL सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न करने की अनुमति है. बाहर pipetting मीडिया, और ताजा मिश्रित बोतल glial संस्कृति मीडिया के 6 एमएल जोड़ने के द्वारा एक पूर्ण मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन. इस कदम के मलबे के बहुत निकालता हैtrituration द्वारा कारण है, और संस्कृति व्यवहार्यता को बढ़ावा देता है. यदि राजभाषा / DRGN सह संस्कृतियों वांछित हैं, इस प्रोटोकॉल की धारा 3 देखें.
  8. संस्कृति के 3 दिनों के बाद, मीडिया के 4 एमएल हटाने, और ताजा मिश्रित glial संस्कृति मीडिया के 4 एमएल के साथ जगह से एक 2 / 3 मीडिया परिवर्तन करते हैं. इस बिंदु पर, एक astrocyte monolayer बोतल के आधार पर बनाने चाहिए.
  9. 6 दिवस पर प्रदर्शन, एक और 2 / 3 मीडिया को बदलने के लिए और 5 / μg एमएल इंसुलिन के अंतिम एकाग्रता के साथ बोतल पूरक. इस बिंदु पर, एक astrocyte monolayer जिनमें से शीर्ष OPCs proliferating किया जाएगा पर स्पष्ट रूप से दिखाई दे, होना चाहिए.

3. DRGN अलगाव

नोट: यह उत्पादन करने के लिए राजभाषा / DRGNs सह संस्कृतियों, DRGNs दिन मिश्रित glial संस्कृति पीढ़ी के बाद स्थापित किया जाना चाहिए. दोनों संस्कृति प्रकार स्वतंत्र रूप से बड़े हो रहे हैं, और 9-10 दिनों के बाद संयुक्त.

  1. बलिदान P5-P10 माउस संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार.
  2. रीढ़ की हड्डी निकालें, और एक साफ पेट्री डिश को हस्तांतरण.
  3. बहुत और मांसपेशियों, हड्डियों के रूप में संभव के रूप में रीढ़ की हड्डी (चित्र 1d, घ ') से दूर छाँटो, है के रूप में इस पृष्ठीय रूट ganglia (DRGs) के विच्छेदन आसानी होगी.
  4. एक नया पेट्री डिश ventral पक्ष अप करने के लिए छंटनी की रीढ़ स्थानांतरण. विच्छेदन कैंची का प्रयोग और caudally शुरू, स्पाइनल कॉलम के माध्यम से medially एक अनुदैर्ध्य फैशन में कटौती.
  5. संदंश के दो जोड़े का प्रयोग, धीरे जिज्ञासा रीढ़ की रीढ़ की हड्डी को बेनकाब स्तंभ खुला.
  6. DRGs के नीचे पाया जा सकता है और रीढ़ की हड्डी पार्श्व. ठीक इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग, धीरे DRGs को दूर करते हुए ganglia (चित्र 1e) को नुकसान से बचने.
  7. बर्फ के ठंडे हांक एक नया पेट्री डिश में नमक समाधान बफर (HBSS, एंटीबायोटिक मुक्त) को हटा दिया DRGs स्थानांतरण. चीड़फाड़ करनेवाला माउस 40 प्रति DRGs (चित्र 1f) निकालने के उद्देश्य होना चाहिए.
  8. एक बार DRGs निकाला गया है, किसी भी जरूरत से ज्यादा लंबी जड़ों (चित्र 1g, छ ') के DRGs ट्रिम contaminating कोशिकाओं की संस्कृति में परिचय (glial कोशिकाओं, fibroblasts) कम से कम.
  9. एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब बर्फ के ठंडे HBSS 500 μL युक्त DRGs स्थानांतरण.
  10. 4 में 5 मिनट के लिए 1200 rpm (~ 300 छ) ° सी DRGs गोली अपकेंद्रित्र.
  11. एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड अपकेंद्रित्र ट्यूबों स्थानांतरण और ट्यूब से HBSS हटाने के.
  12. पूर्व गर्म 500 μL जोड़ें (37 में 20 मिनट ° सी) DRG papain समाधान है, और एक 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूबों को सेते हैं. ट्यूब हर 2 मिनट ऊतक एकत्रीकरण को रोकने के उलटें.
  13. 3.10 कदम दोहराएँ.
  14. DRG papain समाधान निकालें और पूर्व गर्म Collagenase एक समाधान (37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट) के 500 μL जोड़ें. 10 मिनट, inverting के हर 2 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं.
  15. 3.10 कदम दोहराएँ.
  16. सतह पर तैरनेवाला निकालें और DRGN मीडिया के 1 एमएल जोड़ने. ट्यूब कई बार उलटें.
  17. 3.10 कदम दोहराएँ.
  18. 3.16 कदम दोहराएँ.
  19. एक बाँझ लौ पॉलिश HBSS कई बार में 0.25% BSA के समाधान pipetting द्वारा गोजातीय सीरम albumin (BSA) के साथ कांच पाश्चर विंदुक कोट. BSA समाधान के साथ कोटिंग ग्लास विंदुक दीवारों का पालन से DRGs रोकने जाएगा.
  20. BSA लेपित विंदुक के साथ DRGs धीरे पहली बार में, Triturate और बढ़ती तीव्रता के साथ एक बार clumps अलग शुरू. लगभग 10-15 बार Triturate, लेकिन इस संख्या में पाचन की डिग्री पर निर्भर है, और ट्यूब प्रति DRGs की संख्या है.
  21. एक बार हदबंदी हासिल की है, एक 50 सुक्ष्ममापी एक बाँझ पेट्री DRGN मीडिया के 7 एमएल युक्त पकवान में फिल्टर के माध्यम से निलंबन गुजरती हैं. निस्पंदन सेल निलंबन से मलबे के बहुत समाप्त करने, हालांकि यह कदम महत्वपूर्ण नहीं है.
  22. लगभग 1.25 घंटे के लिए 8.5% सीओ 2 में पेट्री डिश सेते हैं .
  23. कोट कई LN2 (10 / पीबीएस में μg एमएल) के साथ 24 अच्छी तरह से एक डिश में 12 मिमी इस ऊष्मायन समय के दौरान coverslips.
  24. एक बार ऊष्मायन समाप्त हो गया है, उज्ज्वल क्षेत्र के तहत पेट्री डिश निरीक्षण करते हैं. DRGNs बड़े शरीर, चरण अंधेरे कोशिकाओं के रूप में पहचाने जाते हैं. भंवर धीरे पेट्री डिश के लिए किसी भी पालन DRGNs लिफ्ट.

नोट: कई contaminating कोशिकाओं पेट्री डिश के लिए दृढ़ता से पालन होगा, जिससे DRGNs के लिए अपने सेल निलंबन समृद्ध.

  1. एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण. धीरे DRGN मीडिया के 4 एमएल के साथ पकवान कुल्ला किसी भी अवशिष्ट DRGNs इकट्ठा. शंक्वाकार ट्यूब करने के लिए अतिरिक्त 4 एमएल स्थानांतरण.
  2. 1200 rpm (~ 300 ग्राम) पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
  3. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और ताजा DRGN मीडिया के 500 μL में गोली resuspend.
  4. झुकेंगे एक hemocytometer का उपयोग DRGNs की संख्या की गणना. केवल DRGNs, और नहीं अन्य प्रकार की कोशिकाओं की गिनती करने के लिए सुनिश्चित करें. DRGNs उनके बड़े गोलाकार सेल निकायों द्वारा पहचाना जा सकता है है.
  5. DRGN मीडिया के 1 एमएल में प्रत्येक coverslip LN2 लेपित, और एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में जगह के लिए 8.5% 2 रातोंरात सीओ पर 30,000-50,000 DRGNs बीज .
  6. अगली सुबह, DRGN की जगह के द्वारा एक पूर्ण मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन1% पेन / Strep और 10 सुक्ष्ममापी FuDR के अंतिम एकाग्रता के साथ राजभाषा मीडिया (शून्य CNTF) के साथ मीडिया.
  7. दिन 3 और 5 पर, 3.30 चरण में के रूप में एक ही मीडिया के साथ एक 3 / 4 मीडिया परिवर्तन करते हैं.
  8. 7 दिन में राजभाषा मीडिया (ऋण CNTF, पेन / Strep, FuDR) के साथ एक पूर्ण मीडिया परिवर्तन करते हैं.
  9. दिन 9 DRGNs एक व्यापक neurite बिस्तर का गठन होना चाहिए, और अब OPCs के साथ सह सुसंस्कृत होने के लिए तैयार हैं.

4. OPCs की राजभाषा समृद्ध संस्कृतियों या राजभाषा DRGN / सह संस्कृतियों की स्थापना के लिए मिश्रित glial संस्कृतियों से शोधन

  1. मिश्रित glial संस्कृति के 9 दिन, एक 5% सीओ 2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में एक कक्षीय हिलनेवाला बोतल हस्तांतरण. खाली T25 बोतल के शीर्ष पर बोतल प्लेस प्रतिकूल मिश्रित glial संस्कृतियों को प्रभावित करने से किसी भी कक्षीय हिलनेवाला से उत्पन्न गर्मी को रोकने के लिए. संस्कृतियों 1 घंटे के लिए इस नए इनक्यूबेटर संतुलित करने के लिए अनुमति दें.
  2. एक बार बोतल equilibrated है, 45 मिनट के लिए 50 rpm पर बोतल हिला. इस शेक के उद्देश्य monolayer से किसी भी शिथिल पक्षपाती contaminating कोशिकाओं को हटाने है.
  3. एक टिशू कल्चर हुड के लिए कोशिकाओं को ले जाएँ और बोतल से सभी मीडिया हटायें. ताजा मिश्रित glial संस्कृति 5 μg / एमएल इंसुलिन के साथ पूरक मीडिया के 4 एमएल के साथ बदलें.
  4. बोतल हिलनेवाला पर वापस प्लेस, और संतुलित करने के लिए लगभग 3 घंटे के लिए अनुमति देने के.
  5. एक बार बोतल equilibrated हैं, उन्हें सुरक्षित कक्षीय प्रकार के बरतन, जकड़ना और 220 rpm (रातोंरात) में लगभग 16 घंटे के लिए बोतल हिला.
  6. अगली सुबह, अगर ols DRGNs के अभाव (यानी, राजभाषा समृद्ध संस्कृति), कोट कई बाँझ LN2 1 घंटे के लिए (10 / पीबीएस में μg एमएल) के साथ 12 मिमी coverslips में उगाया जा रहे हैं. 24 अच्छी तरह व्यंजन के लिए coverslips स्थानांतरण, Pbs के साथ धोने राजभाषा मीडिया धोने के द्वारा पीछा किया. हर अच्छी तरह से राजभाषा मीडिया के 1 एमएल जोड़ें और 8.5% सीओ 2 पर संतुलित.
  7. 5% से कम 10 सेमी टिशू कल्चर व्यंजन संतुलित 30 मिनट के लिए सीओ 2. एक पकवान हर 2 बोतल के लिए आवश्यक हो जाएगा. इन निलंबित OPCs के अंतर आसंजन के संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  8. एक बार 30 मिनट संतुलन अवधि बीत चुका है, हिल बोतल से मीडिया बर्तन को हस्तांतरण. प्रत्येक पकवान 2 बोतल से मीडिया को प्राप्त करते हैं, लगभग 10 सेमी पकवान प्रति सेल निलंबन के 8 एमएल बराबर चाहिए.
  9. 5% 30 मिनट के लिए सीओ 2 में बर्तन सेते हैं, जबकि 15 मिनट के निशान पर एक सौम्य कुहनी से हलका धक्का प्रदान. यह कुहनी से हलका धक्का के पालन से 10 सेमी पकवान OPCs को रोकने में मदद मिलेगी.
  10. एक बार ऊष्मायन पूरा हो गया है, उज्ज्वल क्षेत्र के अंतर्गत व्यंजन जांच. OPCs आमतौर पर 3-5 कोशिकाओं के छोटे सेल clumps, के रूप में पहचाने जाते हैं लेकिन कभी कभी बड़े neurospheres जैसी समुच्चय के रूप में. कई गैर राजभाषा वंश कोशिकाओं मजबूती प्लेट के आधार पर पालन किया जाना चाहिए. धीरे ज़ुल्फ़ प्लेटें किसी भी शिथिल पालन OPCs अलग करने के लिए, और प्रत्येक थाली से एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण.
  11. 5 मिनट के लिए 1200 rpm (~ 300 ग्राम) पर अपकेंद्रित्र.
  12. 1 राजभाषा मीडिया की एमएल में P1000 पिपेट टिप, P200 विंदुक टिप के साथ resuspension द्वारा पीछा के साथ गोली Resuspend.
  13. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं को गिन लो.
  14. समृद्ध राजभाषा संस्कृतियों, बीज 25,000 - 1 एमएल राजभाषा मीडिया के अंतिम मात्रा में प्रत्येक 12 मिमी LN2 लेपित coverslip 50,000 OPCs.
  15. राजभाषा / DRGN सह संस्कृतियों, अनुभाग से DRGNs पर एक पूर्ण राजभाषा (शून्य CNTF) मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन [3], और धीरे OPC समृद्ध सेल निलंबन से 50,000 कोशिकाओं को जोड़ने. OPCs के अलावा दौरान बाधित करने के लिए नहीं DRGN neurite बिस्तर ख्याल रखना.
  16. 8.5% सीओ 2 पर प्लेस एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में, संस्कृतियों और निर्धारण जब तक हटाने से बचने के. Murine OPCs pH में परिवर्तन, और इनक्यूबेटर से हटाने के प्रति संवेदनशील हैं राजभाषा मीडिया के पीएच बदल जाएगा. नोट के अलावा, DH 2 हे खाली सेल संस्कृतियों आसपास के कुओं के अलावा संस्कृति मीडिया के वाष्पीकरण को रोकने, इस प्रकार राजभाषा मीडिया के भीतर कम से कम सांद्रता विलेय में उतार चढ़ाव होगा. यह OPCs के लिए एक और अधिक सुसंगत वातावरण प्रदान करेगा.

5. Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए संस्कृतियों के प्रसंस्करण

  1. -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, या 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 3% paraformaldehyde के लिए 100% मेथनॉल के साथ संस्कृतियों को ठीक करें.
  2. 0.1% 10 मिनट के लिए ट्राइटन-X-100 के साथ coverslips Permeabilize, 1 घंटे के लिए फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) और ब्लॉक के साथ 10% बकरी सीरम में धो.
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते coverslips 4 बजे समाधान रातोंरात अवरुद्ध में पतला डिग्री सेल्सियस
  4. Coverslips पीबीएस के साथ 3 बार धो, और Alexa fluor संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (Invitrogen) 45 मिनट के लिए समाधान को रोकने में पतला के साथ सेते हैं.
  5. 4 ',6-diamidino-2 - phenylindole (DAPI) के साथ Counterstain और coverslips पीबीएस के साथ कई बार धोने.
  6. DAKO फ्लोरोसेंट में माउंट coverslips बढ़ते मध्यम.
  7. Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के माध्यम से स्लाइड्स का विश्लेषण करें. इस प्रोटोकॉल में, स्लाइड या तो एक Zeiss Axiovert 200M औंधा प्रतिदीप्ति के साथ विश्लेषण किया गयामाइक्रोस्कोप या एक Zeiss LSM 510 मेटा confocal खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर.

6. राजभाषा समृद्ध संस्कृतियों से पूरे सेल प्रोटीन निष्कर्षण

  1. इनक्यूबेटर और शांत से 3 मिनट के लिए बर्फ पर 24 अच्छी तरह से संस्कृतियों निकालें.
  2. ध्यान से मीडिया को निकालने के लिए, और lysis बफर का 10-20 μL (50 मिमी Tris - एचसीएल, 150 मिमी NaCl, 0.1% एसडीएस, 0.5% सोडियम deoxycholate, 1% Triton एक्स 100, 0.1% pepstatin के साथ, aprotinin, PMSF जोड़ने के लिए, leupeptin, सोडियम orthovanadate प्रत्येक अच्छी तरह से) (8 नमूना प्रति कुओं की एक न्यूनतम का सुझाव दिया है).
  3. एक विस्तृत बोर P1000 विंदुक टिप का उपयोग कुओं परिमार्जन, और एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब lysate हस्तांतरण.
  4. एक 30 साढ़े गेज सिरिंज के माध्यम से lysate लगभग 15 बार, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा दर्रा.
  5. +१४००० आरपीएम (~ 20,000 छ) में 15 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र
  6. -80 में नया अपकेंद्रित्र ट्यूबों, और स्टोर करने के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस

7. एसडीएस पृष्ठ समृद्ध राजभाषा संस्कृति प्रोटीन पर विश्लेषण

  1. एसडीएस पृष्ठ से मानक 12% पाली acrylamide जैल पर बफर को कम करने में नमूना प्रति प्रोटीन की 30 μg संकल्प.
  2. अर्ध - शुष्क PVDF झिल्ली पर हस्तांतरण जैल.
  3. 1 घंटे के लिए 5% में ब्लॉक झिल्ली TBST में दूध पाउडर मलाई उतारा (10 मिमी Tris - एचसीएल 8.0 पीएच, 150 मिमी NaCl, 0.1% बीच - 20).
  4. 1 घंटे के लिए समाधान अवरुद्ध में प्राथमिक पतला एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं.
  5. झिल्ली 10 मिनट के लिए TBST के साथ 3 बार धोएं.
  6. एचआरपी संयुग्मित अवरुद्ध समाधान में 45 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं.
  7. झिल्ली TBST के साथ कई बार धो, और 5 मिनट के लिए Amersham ईसीएल प्लस पश्चिमी सोख्ता पता लगाने अभिकर्मक (जीई हेल्थकेयर) के साथ सेते हैं.
  8. मानक वैज्ञानिक इमेजिंग फिल्म के साथ प्रोटीन बैंड का पता लगाएँ.

8. प्रतिनिधि परिणाम:

इस प्रोटोकॉल में, OPCs एक मिश्रित glial संस्कृति के भीतर एक astrocyte monolayer पर विस्तार कर रहे हैं. इस मिश्रित संस्कृति glial P0-P2 नवजात माउस प्रांतस्था से ली गई है. इन विट्रो (DIV1) में 1 दिन, मिश्रित संस्कृति glial अलग morphologies के साथ कोशिकाओं चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी (चित्र 2a) के द्वारा देखा के रूप में शामिल हैं. DIV3 में, एक astrocyte monolayer फ्लास्क के आधार पर फार्म शुरू होता है, और DIV8 पर OPCs monolayer की सतह पर स्पष्ट रूप से मनाया जा सकते हैं. DIV9, proliferating OPCs पर्याप्त घनत्व तक पहुँच चुके हैं रातोंरात उच्च गति कक्षीय झटकों से शुद्ध हो. एक बार शुद्धिकरण की प्रक्रिया पूर्ण हो गया है, परिणाम एक सेल OPC समृद्ध आबादी है. DIV1 - पोस्ट शुद्धि, OPCs सरल आकारिकी है, कुछ प्रक्रियाओं (चित्र 2b) का विस्तार. DIV3 पोस्ट शुद्धि में, कोशिकाओं में प्रक्रियाओं के एक जटिल meshwork, अपरिपक्व ols की याद ताजा बढ़ाया है. DIV6 पोस्ट शुद्धि, शुद्ध ols चपटा है और पत्रक झिल्ली संरचनाओं की तरह का अनुमान है. इस morphological विकास ols के इन विट्रो परिपक्वता में विशिष्ट है.

Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी यह संकेत करता है कि शुद्ध कोशिकाओं की राजभाषा वंश (चित्र 3a) हैं. वरीयता प्राप्त शुरू OPCs व्यक्त chondroitin सल्फेट proteoglycan (NG2), और तीन दिन पोस्ट बोने (चित्र 3b) के भीतर माइलिन जुड़े (पत्रिका) ग्लाइकोप्रोटीन सकारात्मक अपरिपक्व ols में विकसित. DIV6 कम, कई ols व्यक्त माइलिन बुनियादी (MBP), प्रोटीन और अधिकारी ठेठ परिपक्व राजभाषा आकारिकी. राजभाषा समृद्ध संस्कृतियों (चित्र -3 सी) की पवित्रता निर्धारित प्रतिशत राजभाषा वंश कोशिकाओं को अलग अलग समय बिंदुओं पर मात्रा निर्धारित किया गया. DIV1 पोस्ट शुद्धि, संस्कृतियों 50 कर रहे हैं ± 14% NG2 + ve OPCs कोई पत्रिका + ve या MBP + ve ols. यह संकेत करता है कि शुद्ध राजभाषा वंश कोशिकाओं बोने के समय में अग्रदूत चरण में विभेदित ols की नगण्य संख्या के साथ कर रहे हैं. DIV3, कई ols पत्रिका + ve कोशिकाओं (24 ± 5.9%) में विभेदित किया है जबकि कुछ अग्रदूत phenotype बनाए रखने के लिए, और रहना NG2 + (± 8.0% 13) . DIV3 में, पत्रिका + ve कोशिकाओं (3.2 1.2%) के एक छोटे से अनुपात भी MBP व्यक्त कर रहे हैं. DIV6 में, 20 ± ols के 5.9% पत्रिका + ve जबकि 12 ± 7.3% NG2 + ve OPCs रूप में जारी रहती है. इसके अलावा, 21 ± संस्कृति के भीतर कोशिकाओं के 9.3% MBP + इस समय बिंदु पर किया है ols. एसडीएस पृष्ठ 2'3' चक्रीय nucleotide 3'phosphodiesterase (CNP) और 6 दिन की संस्कृति अवधि में MBP वर्गीकृत अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चलता है, आगे संस्कृति में OPCs टर्मिनली परिपक्व ols में अंतर (चित्र 3 डी की क्षमता का प्रदर्शन ). सामूहिक, इन डेटा एक राजभाषा समृद्ध संस्कृति OPCs से राजभाषा परिपक्वता के अध्ययन के लिए उपयुक्त प्रणाली का निर्माण करने का एक साधन के रूप में में इस विधि स्थापित करता है.

इस प्रोटोकॉल / राजभाषा DRGN murine केवल ऊतक स्रोतों का उपयोग कर सह संस्कृतियों को स्थापित करने के तरीकों का वर्णन करता है. हालांकि, क्रम में सह संस्कृति का उत्पादन करने के लिए, DRGNs पहली बार अकेले सुसंस्कृत होना चाहिए पर्याप्त neurite नेटवर्क का उत्पादन. ये प्रसवोत्तर murine न्यूरॉन संस्कृतियों कम सीरम मीडिया में 9 दिनों के लिए 10 सुक्ष्ममापी FuDR अनुपूरण के साथ बड़े हो रहे हैं fibroblasts और जीएल contaminating के प्रसार को रोकने के ial कोशिकाओं. इन विट्रो में 9 दिनों के दौरान, पृथक DRGNs एक घने neurite बिस्तर (चित्र 4a) का उत्पादन. इस neurite बिस्तर neuronal मार्कर 200 neurofilament (NF) और Tuj1 (चित्र 4b) के लिए immunopositive है. इस बिंदु पर, शुद्ध OPCs neurite बेड को जोड़ा जा सकता है, और एक अतिरिक्त 6 दिनों सह संस्कृतियों myelinating उत्पादन के लिए सभ्य.

DIV6 राजभाषा / DRGN सह संस्कृति, कई MBP + ve ols NF + ve DRGN neurites (चित्र 5a) के बीच मनाया जा सकता है . करीब परीक्षा पर, ols करने के लिए कई DRGN neurites के साथ संपर्क बनाने के लिए, अक्सर उन्हें एक MBP + ve झिल्ली (चित्र 5 ब, ग) के साथ ensheathing सबूत हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. नवजात माउस प्रांतस्था और DRG अलगाव के विशेष पहलुओं के विच्छेदन माइक्रोस्कोप छवियों. (क) एक हौसले से निकाला नवजात माउस मस्तिष्क के पृष्ठीय दृश्य. बिंदीदार लाइनों क्षेत्र है जहां चीरों meningeal परत को हटाने की सुविधा के लिए किया जाना चाहिए संकेत मिलता है (ख) मस्तिष्क के ventral दृश्य, बिंदीदार लाइनों क्षेत्र है जहां प्रांतस्था वेंट्रल diencephalon मिलता संकेत मिलता है. दीप चीरों के रूप में बिंदीदार लाइनों के साथ बनाया जाना चाहिए cortices के अलगाव सहायता (सी ग ') कैसे जिज्ञासा प्रांतस्था मस्तिष्क के शेष से दूर के दृश्य चित्रण (घ) एक हौसले से अलग P5 -P10 माउस रीढ़ पहले दूर अतिरिक्त मांसपेशियों और हड्डियों (घ) trimming (ई) DRGs के स्थान स्पाइनल कॉलम के अंदर. (च) DRGs है कि एक माउस से अलग किया जाना चाहिए की अनुमानित संख्या (छ) एक DRG लंबे जड़ों की आवश्यकता है कि साथ enzymatic पाचन से पहले trimming के. बिंदीदार रेखा क्षेत्र जहाँ जड़ों छंटनी होना चाहिए इंगित करता है (छ) जड़ - trimming पोस्ट DRG.

चित्रा 2
चित्रा 2. OPCs एक मिश्रित glial संस्कृति के भीतर का विस्तार कर रहे हैं, शुद्ध, और बाद में एक समृद्ध संस्कृति राजभाषा के रूप में विभेदित. (क) विकास के विभिन्न चरणों को चरण मिश्रित glial संस्कृतियों के विपरीत छवियाँ. DIV1, कुछ चपटा कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं दौर दिखाई देते हैं. मिश्रित glial संस्कृति के स्तरीकरण DIV3, जहां astrocytes फ्लास्क, जिस पर OPCs पैदा के आधार पर एक समान monolayer फार्म पर शुरू होता है. कई OPCs DIV8 (तीर) astrocyte monolayer की सतह का पालन पर देखा जाता है (ख) एक बार मिश्रित glial संस्कृति से शुद्ध. DIV1 OPCs केवल कुछ प्रक्रियाओं को बढ़ाया है. DIV3 में, कोशिकाओं को कई प्रक्रियाओं, मध्यवर्ती चरण ols की याद ताजा बढ़ाया है. DIV6, चपटा ols (तारांकन) झिल्लीदार शीट का उत्पादन किया है (डैश्ड लाइन) दिखाई देते हैं. स्केल सलाखों, 50 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 3
चित्रा 3. राजभाषा - समृद्ध संस्कृति की विशेषता है . (क) विकास के विभिन्न चरणों में पृथक ols के Confocal छवियों. NG2 + ve OPCs सरल आकारिकी है, जबकि पत्रिका + ve ols कई arborous प्रक्रियाओं अधिकारी. MBP + ve ols झिल्लीदार माइलिन तरह चादरें बढ़ाया है. स्केल पट्टी, 50 सुक्ष्ममापी. (ख) शुद्ध राजभाषा वंश कोशिकाओं OPCs के रूप में उत्पन्न है, और 6 DIV अधिक पत्रिका + ve, MBP + ve ols में अंतर है . DIV1, सभी OPCs NG2 + ve हैं, जबकि कोई भी पत्रिका + ve या + MBP किया है. DIV3 में, पत्रिका + किया है और कुछ MBP + ve ols अब स्पष्ट हैं. ols के बहुमत DIV6 में पत्रिका और MBP + ve कुछ शेष + NG2 किया है OPCs के साथ कर रहे हैं. स्केल बार, 100 सुक्ष्ममापी (ग) ± 6 DIV से अधिक विकास के विभिन्न चरणों में राजभाषा - वंश प्रतिशत कोशिकाओं के मूल्यों एसडी मीन. DIV1 में, सभी राजभाषा वंश कोशिकाओं NG2 + 50 के लिए किया है लेखांकन, ± संस्कृति के भीतर कुल कोशिकाओं के 14% हैं. DIV3 और DIV6 कम, राजभाषा वंश कोशिकाओं को क्रमश: 36 के लिए खाते ± 6.8% और 32 ± कुल कोशिकाओं के 8.4%, NG2 के अनुपात अलग से मिलकर + ve, पत्रिका + ve और MBP + ve ols. (घ) एसडीएस पृष्ठ प्रदर्शन प्रोटीन पर समृद्ध 6 DIV संस्कृति अवधि में राजभाषा-मार्करों CNP MBP और वर्गीकृत अभिव्यक्ति का प्रदर्शन राजभाषा संस्कृतियों से निकाली गई.

चित्रा 4
चित्रा 4. DRGN संस्कृति पूर्व OPC बोने की विशेषता. (क) 9 DIV संस्कृति पूर्व OPC के बोने की अवधि से अधिक DRGNs छवियों के विपरीत चरण . DRGNs कुछ प्रक्रियाओं के साथ बड़े शरीर की कोशिकाओं के रूप में उत्पन्न है, और एक तेजी से जटिल neurite नेटवर्क का उत्पादन. स्केल बार, 100 सुक्ष्ममापी. (ख) DRGN DIV9 में तय (पूर्व OPC बोने) और न्यूरॉन विशेष Tuj1 और NF200 मार्करों के लिए दाग संस्कृतियों की छवियों Confocal . DRGNs neurite नेटवर्क पर जो OPCs / राजभाषा DRGN सह संस्कृतियों myelinating उत्पादन वरीयता प्राप्त हो सकता है का उत्पादन किया है. स्केल बार, 50 सुक्ष्ममापी.

"ent> चित्रा 5
चित्रा 5. OLS राजभाषा के साथ DRGN neurites MBP + ve झिल्ली की लपेटन की मध्यस्थता में DRGNs परिणाम के साथ सह - सुसंस्कृत. (क) एक 4 - क्षेत्र confocal DIV6 / राजभाषा DRGN सह संस्कृति के असेंबल छवि. कई MBP + ve ols अंतर्निहित DRGN neurite बिस्तर के साथ बातचीत देखा जा सकता है है. स्केल बार, 100 सुक्ष्ममापी. (ख) एक बढ़ाया MBP के confocal दृश्य + ve कई DRGN neurites लपेटकर ols. स्केल पट्टी, 50 सुक्ष्ममापी. (ग) क्षेत्र के डिजिटल बढ़ाई (ख) जहां एक DRGN neurite राजभाषा झिल्ली के साथ किया जा रहा लपेटा जाता है में चिह्नित. स्केल बार, 25 सुक्ष्ममापी

Discussion

यह रिपोर्ट राजभाषा समृद्ध संस्कृतियों या राजभाषा DRGN / सह संस्कृतियों में भेदभाव के लिए murine OPCs अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. जब अकेले सुसंस्कृत, OPCs MBP में अंतर + ve ols, myelin की तरह झिल्लीदार शीट उत्पादन. जब neurite बेड DRGN जोड़ी ols MBP साथ DRGN neurites लपेटना + ve झिल्ली. यह मॉडल जटिल राजभाषा की मध्यस्थता axonal ensheathment शासी आधार की जांच लाभ है.

जबकि महान मूल्य का है, ऐसे संस्कृतियों की स्थापना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है. विशेष रूप से, मांग पहलुओं कुशल पाचन ऊतक / पृथक्करण, संतुलित संस्कृति मीडिया पीएच के रखरखाव, और DRGN मीडिया परिवर्तन शामिल हैं. यह महत्वपूर्ण है कि पाचन की लंबाई, ऊतक की मात्रा को पचा जा रहा है trituration की राशि ऊतक पृथक्करण की प्रभावकारिता और अंतिम परिणाम को प्रभावित करता है पर विचार करने के लिए के लिए. यह अनुभवी शोधकर्ताओं के लिए असामान्य नहीं है dissociated तंत्रिका तंत्र के ऊतकों से कम सेलुलर पैदावार प्राप्त करने के लिए. इसके अलावा, murine OPCs alkaline शर्तों के तहत विशेष रूप से, संस्कृति मीडिया के पीएच में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हो जाते हैं. 8.5% सीओ 2 में संस्कृतियों के रखरखाव के इस रोकने के लिए, क्योंकि OPCs करने के लिए बेहतर बुनियादी पर थोड़ा अम्लीय परिस्थितियों को बर्दाश्त प्रकट करना. खिला DRGNs संबंध के साथ, मीडिया परिवर्तन जल्दी से प्रदर्शन किया जाना चाहिए के रूप में न्यूरॉन्स नहीं कुम्हलाना, तथापि, कोमल के रूप में विकसित neurite बिस्तर बाधित नहीं होना चाहिए. अचानक मीडिया परिवर्तन सब्सट्रेट से neurite बिस्तर, और अपने coverslip से पूरा पृथक्करण में होने की संभावना परिणाम बेदखल हो सकता है.

इस मॉडल प्रणाली के संभावित योग्यता बहुत अपनी तकनीकी मांग प्रकृति overshadows. इस प्रणाली का एक लाभ यह सेल संस्कृति व्युत्पत्ति के लिए प्रसवोत्तर चूहों का उपयोग है, प्रजनन मादा भ्रूण ऊतक फसल के बलिदान की जरूरत circumventing. एक और लाभ यह वृद्धि कारकों के लिए आवश्यकता के OPCs के विस्तार के लिए (GFS) कमी है. मिश्रित glial संस्कृतियों एक वातावरण है कि OPCs, संभाव्यतः astrocyte व्युत्पन्न पौष्टिकता संबंधी कारकों की उपस्थिति के कारण के प्रसार का समर्थन करता है प्रदान करते हैं. व्युत्पत्ति के माध्यम से 7,8 neurospheres जैसे अन्य तरीकों, जैसे बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF), epidermal वृद्धि कारक (EGF) और OPC के विस्तार के लिए प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF) GFS का mitogenic गुणों पर निर्भर हैं . इसी तरह, प्रसवोत्तर (P5-10) DRGNs के लिए चूहों का उपयोग तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF), एक neurotrophic इन विट्रो भ्रूण DRGNs 9, 10 के अस्तित्व के लिए आवश्यक कारक के साथ संस्कृति मीडिया का सप्लीमेंट की आवश्यकता टाल. यह NGF का उपयोग कर के रूप में यह नकारात्मक ols के myelinating क्षमता को प्रभावित करती है जब 4 DRGNs साथ सुसंस्कृत से बचने के लिए ब्याज की है. के प्रयोग से परहेज GF पूरक मीडिया भी आर्थिक लाभ है, के रूप में इन अभिकर्मकों महंगा हो गया है जब बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया.

शायद इस संस्कृति मॉडल की सबसे महत्वपूर्ण लाभ माउस केवल ऊतकों से इसकी व्युत्पत्ति है, इस प्रकार ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की एक विस्तृत विविधता से दोनों OPCs और DRGNs प्राप्त अवसरों को उपलब्ध कराने. यह दोनों DRGN और / या OPC के विशेष गुण है कि myelination सरकार के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. यह रिसेप्टर ligand / बातचीत axons की राजभाषा की मध्यस्थता myelination विनियमन elucidating के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाएगा. सभी में, इस तकनीक आणविक myelination अंतर्निहित cues को समझने की दिशा में अपने आवेदन करने के लिए कारण तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के संबंध के साथ महान मूल्य का है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस परियोजना कनाडा के मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी से RKRWO एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था कनाडा के मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी से एक छात्रावस्था के एक प्राप्तकर्ता है. एसडीआर कनाडा और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान के मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी से पोस्ट डॉक्टरेट फैलोशिप के एक प्राप्तकर्ता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Multicell 319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170-112
Minimum Essential Media (MEM) GIBCO, by Life Technologies 12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
GlutaMAX Invitrogen 35050-061
Poly-l-lysine Sigma-Aldrich P2636
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Human merosin purified protein (LN2) EMD Millipore CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF) PeproTech Inc 450-50
L-thyroxine Biochemika 89430
Holo-transferrin Sigma-Aldrich T0665
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 0080085-SA
Bovine insulin Sigma-Aldrich I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich I6634
Progesterone Sigma-Aldrich P8783
Putrescine Sigma-Aldrich P7505
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR) Sigma-Aldrich F0503
Papain solution Worthington Biochemical LS003126
DNaseI Roche Group 1010159001
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
24-well tissue culture dishes Cellstar 662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap Corning 430639
10 cm tissue culture dishes Corning 430167
10 cm petri dish Fisher Scientific 0875713
Collagenase A Roche Group 103578
CellTrics 50 μm filter (optional) PARTEC 04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody AbD Serotec MCA409S
NG2 antibody EMD Millipore AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody EMD Millipore MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody Covance SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody Fitzgerald 10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody Sigma-Aldrich N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody EMD Millipore MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody Invitrogen A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Bio-Rad 170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542

Media Recipes

100X OL-Supplement*

IngredientAmount to add
DMEM100 mL
BSA1.02 g
Progesterone0.6 mg
Putrescine161 mg
Sodium Selenite0.05 mg
3,3',5-Triiodo-L-thyronine4 mg

*Store at -80 °C in 250 μL aliquots

OL media

IngredientAmount to add
DMEM23.75 mL
100X OL-Supplement250 μL
Bovine insulin (from 1 mg/mL stock)125 μL
GlutaMAX250 μL
Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock)37.5 μL
B27 Supplement500 μL
FBS125 μL
CNTF (from 50 ng/μL stock)25 μL

Mixed glial culture media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (0.33% from stock)33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin
GlutaMAX1%

DRGN media (made up in DMEM)

IngredientFinal concentration
FBS10%
Pen/Strep (1% from stock)100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin

Digestion Solution Recipes:

OPC papain solution (made up in MEM)

IngredientFinal concentration
Papain solution1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL
DNaseI60 μg/mL

DRG papain solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Papain1.54 mg/mL
L-cysteine360 μg/mL

DRG Collagenase A solution (made up in HBSS)

IngredientFinal concentration
Collagenase A4 mg/mL

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References

  1. Avellana-Adalid, V. Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential. J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).
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  4. Chan, J. R. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43, 183-1891 (2004).
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  7. Chen, Y. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  8. Pedraza, C. E. Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors. Glia. 56, 1339-1352 (2008).
  9. Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors. J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).
  10. Greene, L. A. Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons. Dev Biol. 58, 106-113 (1977).

Comments

46 Comments

  1. very nice video and presentation....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 28, 2011 - 12:44 PM
  2. Nice explanation. I have been carrying out this procedure for some time now and find that it works quite well.

    How many OPCs you generally obtain from a single mouse brain?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 26, 2012 - 4:35 PM
  3. Hi - thanks for your comment, typically I yield about ²00,000 OPCs per mouse brain (on average).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:04 AM
  4. Excellent. I am using B6 mice, usually P4-5 (because we also take cerebellar neurons from these same pups). I usually yield between 100-130,000 cells/brain. I see some differences in our protocols (I seed three brains/T75, use trypsin instead of papain, etc.). What steps have you found to dramatically increase your OPC yield post shake-off?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 12:17 PM
  5. The largest factor in OPC yield is the efficiency of your digestion (ie. minimal cell death). In addition, the age of the mice from which you isolate the mixed glial cultures is a factor. I think if you go too far past P², many OPCs will be postmitotic, and therefore limit their proliferation capacity. I usually try to go as young as possible (P0) as this seems to work best. If you absolutely need to use P4-P5, maybe try to culture your monolayers longer than 9 days - try waiting ² weeks prior to shake off. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 1:06 PM
  6. Thanks for the great info. That is interesting, as many of the protocols for the "DeVellis-method" use different enzymatic preparations (trypsin +/- EDTA, +/- DNAase, papain, etc.). I had basically adapted my rat OPC protocol for mice, but am realizing that they are just not the same. I will trip your papain method and let you know how things pan out. Also, is there a reason you use T²5 flasks instead of combining brains into a T75?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 2, 2012 - 4:55 PM
  7. No there is no specific reason for using T²5, simply this is what I have always been using. I would imagine combining 3 mice into a T75 flask would roughly be the same thing. Good Luck!

    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 12:00 PM
  8. Hi Ryan, nice video and explanation. Do you do lectin panning to further get rid of microglia or do you find that a 30 min incubation at 37 degrees is enough? Also, how do you know cells are ready to shake? are they always ready at day 9? what do you look for specifically?
    thank you

    Reply
    Posted by: luisa t.
    April 10, 2013 - 12:39 PM
  9. hello...I have gone through this video...very nicely presented...but I have one doubt that if I put the flasks on shaker which only maintains temp and speed but not CO² level, the pH will change...would it not allow the OPCs to survive at all??? and can I use HEPES in medium to solve this problem???
    M willingly waiting for your reply....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 4, 2012 - 12:35 PM
  10. Thank you for your comment, you are correct in that it will not work without CO² buffering. HEPES buffer will likely not solve this problem either. I'm afraid you will absolutely need to have CO² buffering for this isolation to work.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 11:56 AM
  11. Hi, very INFORMATIVE video, I zalak parikh working on glial cells. In your protocol you are not using any filter after papain digestion but I am facing one problem of Fibroblasts contamination. What could be the possible solution for this problem?
    thank you
    Zalak.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 7:59 AM
  12. Hi Zalak, thanks for your comment. What glial cell type are you trying to culture? Oligodendrocytes, astrocytes or microglia? I have never experienced fibroblast contamination.. are you sure they are fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 10:47 AM
  13. Hi there. Excellent video, very informative. I was just wondering if you can incubate the flasks in 5% CO² instead of 8% CO²?
    Thanks
    Matt

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 12:48 PM
  14. Hi Matt, Actually no, you need to have these at at least 8.5% CO² - otherwise you will have trouble establishing your mixed glial cultures - Good luck

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 11, 2012 - 10:22 PM
  15. Hi Ryan. Very nice video and presentation.
    I have to establish a DRG neuronal culture. Majority of all the papers I've read are using a embryonic source of DRG unlike you using post-natal mouse. What do you think will be the major difference between the cultures of the two??

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 1, 2012 - 12:23 PM
  16. Hi Lipi,
    You're right most papers use embryonic DRGs. The benefit of using post-natal DRGs is that you don't have to sacrifice the mother, and if you use P5-P10 mice, there is no need to use nerve growth factor (in my hands). Embryonic DRG neurons require NGF supplementation to the media for their survival. In terms of the difference between cultures, embryonic dervied ones may have a bit more contaminating cells, since I find they divide pretty quickly. Otherwise I imagine they would be the same as post-natal derived cultures. Good luck!

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    October 1, 2012 - 4:37 PM
  17. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:39 AM
  18. Thank you Ryan.

    Reply
    Posted by: Lipi B.
    October 3, 2012 - 2:51 AM
  19. Great article Ryan. I had a question for you. Our lab generates mixed glial cell cultures by isolating NPCs from P1 mouse pup brains,expanding the NPCs via neurospheres in the presence of GFs, and then plating the spheres on matrigel for subsequent differentiation without GFs. My main goal in using the neurosphere protocol is to obtain OPCs, but I routinely get only ²0-30% O1+ OPCs following 8 days of differentiation on matrigel. GFAP+ astrocytes seem to dominate the whole culture, with OPCs growing on top of them. I wanted to try to incorporate your protocol into the neurosphere protocol by dissociating the spheres using TrypLE or Accutase, plating them on Poly-D-Lysine, letting the astrocytes grow to confluency while having OPCs proliferate on top, and then use the shaking technique to isolate OPCs. Do you think this is possible? When we perform in vitro studies with the NPCs, we usually plate the neurospheres on matrigel for a day and then trypsinize the cells for seeding into new dishes. Not only do I think the trypsin digest kills many OPCs, but I also remove astrocytes from the matrigel that then contaminate my cultures. Thanks for the help!

    Reply
    Posted by: Brett M.
    November 3, 2012 - 7:37 PM
  20. Hi Brett - To answer your question, yes I think it would be possible to do what you are suggesting. However, it seems to be a pretty roundabout approach. I think the more streamlined approach would be to simply seed your dissociated P1 neural cells onto PLL substrate to generate a monolayer. That way you would avoid having to generate neurospheres (which I imagine takes about 10 days) and then subsequently generating an astrocyte monolayer with the spheres (which would take another 10+ days). In my experience, OPCs don't like trypsin. If you wanted, you could try 0.05% Trypsin instead of 0.²5% and that seems to be more gentle. And if you don't incubate for too long, most astrocytes should remain on the plate. Hope this helps! -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    November 5, 2012 - 12:14 PM
  21. Ryan, thanks for the help! I tried your protocol and everything appeared to go well. However, one issue I ran into occurred during the overnight shaking step and subsequent differential adhesion assay to isolate a more pure population of OPCs. What I noticed was that after the overnight shaking I had many large oligospheres (maybe 10-²0 cells in size). These spheres did not stick down during the 30 minute plate incubation and I had difficulties trying to dissociate them as you described using the P1000 and P²00 tips. When I took the cells counts and plated the cells onto chamber slides, many smaller clumps remained and stuck down to the matrix. However, the clumps did not flatten out on the gel matrix very well (like neurospheres do) and eventually flaked off after about 5 days of cultures, leaving only sparse population of OPCs. Have you ever encountered this problem? I was thinking of seeding at a higher cells density than what you describe in the protocol.

    Reply
    Posted by: Brett M.
    December 2, 2012 - 10:21 PM
  22. Hi Brett - sounds like you're doing everything right. Normally I see lots of these "oligospheres" as a result of the overnight shaking protocol. However, I find that these are not the majority of OPCs, as there are many single cells and cells in clumps of ²-4. The oligospheres are difficult to dissociate, and due to this, I generally do not go out of my way to try and break them up. In my hands, these spheres spread out very nicely after about ²4hrs on Laminin-² substrate. You can try to seed at higher densities if you like, but the seeding density should be determined based on the experiment you want to conduct. For example, if you want to perform immunocytochemistry, it may not be ideal to have a very dense cell culture. Also, it's possible the clumps aren't super compatible with your matrix substrate - I always use Laminin. I hope this helps :)

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 3, 2012 - 11:42 AM
  23. HI Ryan, very informative and nice presentation. I have tried your protocol and everything seem to work fine except at the overnight shaking. There were very few OPCs isolated and it seems there are still many OPCs adhere to the astrocytes. Have you encounter this issue?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 13, 2012 - 3:25 AM
  24. Hi Esther, Thanks for your comment. How many OPCs are you yielding per mouse? I usually yield on average ²00,000 OPCs per mouse brain, but this is quite variable. At times I have yielded 500,000 or 50,000 per brain, and I'm not sure what accounts for this variability. In any case, you will never dissociate 100% of the OPCs from the monolayer, I've noticed a lot remain stuck. My advice would be to simply give it another shot and see if your yields are a bit higher next time. Hope this helps - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    December 16, 2012 - 5:35 PM
  25. Thanks Ryan for your advice. My yield is definitely much lower than yours. I will definitely try another round. :)

    Reply
    Posted by: Esther W.
    December 16, 2012 - 8:24 PM
  26. HI Ryan, I face the problem of getting immature OPC instead of mature OPC after 6 days of OL-enriched culture. What is your view?

    Reply
    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 2:51 AM
  27. Hi Esther, you should always expect to have some OPCs that don't differentiate during the timecourse. However, the majority of OLs should at least be expressing MAG, if not MBP at DIV6. My guess would be that your media is not exactly correct. Make sure that all the ingredients are at the correct concentration in your 100x OL-supplement stock - especially tri-iodothyronine and L-thyroxine (4mg per 100mL). I hope this helps, let me know if you still have problems.

    Posted by: Ryan O.
    January 23, 2013 - 12:56 PM
  28. Thanks Ryan for replying. I have added tri-iodothyronine only as there is no mentioned of L-thyronine in the 100x OL-supp recipe. Can i still add L-thyronine when the OL-enriched is on DIV5?

    Posted by: Esther W.
    January 23, 2013 - 8:05 PM
  29. Thanks for notifying me of this mistake, I'll notify the editorial team ASAP. Yes you can try to add it on DIV5, but no guarantees this will drive them any farther since they are aleady 5 days in. Give the protocol a second try, and let me know if the lack of differentiation still occurs. -Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    January 24, 2013 - 12:47 AM
  30. Hi Luisa thanks for your comment :) I don't do lectin panning, as I find that incubation on the culture plates is enough to get rid of most of them, but if you're having a problem with microglia that is an additional option. I usually shake on day 9, but I've found you can shake anywhere from 9 to 1² days, but any longer than that you will get less OPCs. Generally if you see a lot of cells on top of the astrocyte monolayer, they are ready to go. However in my experience this dŒsn't really happen before day 9. Hope this helps RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    April 10, 2013 - 2:28 PM
  31. Hi Ryan.Thanks for this protocol. I did exactly what you have described in this protocol, except the shaking step. I did it without CO2, but the caps are tightly sealed, how is it possible that CO2 will effect pH of tightly sealed flask? My yield was very low, besides I had fibroblast contamination as well. I used uncoated flasks as well, because once during the shaking all the layer came off the bottom of the flask, what do you think would be the reason for this?.And in my experience when FBS is used in OPC culture media it made OPC's to differentiate to astrocytes rather then oligodendrocytes.Overall I couldnt replicate this procedure unfortunately and trying to find other methods..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 20, 2014 - 5:33 PM
  32. Hi Aysel - from what you describe in your message, you didn't follow my protocol.

    1) So you didn't shake the flasks? Or you didn't use the same method of shaking?

    2) As far as I know, all standard tissue culture incubators have some level of CO2 buffering (usually 5%). Strictly speaking, if you tighten the cap of your flasks, there will be no gas exchange between the incubator and the flask, if you are using plugged caps. I use vent-capped flasks (0.22um pore), so gas exchange occurs between the flask and the incubator when the caps are tight. To answer your question, CO2 buffering will have little-to-no effect on the pH of the media if you are using tightly-screwed plugged flask caps.

    3) I haven't experienced fibroblast contamination in my cultures, I imagine this would be a dissection issue. The only source of fibroblasts I can imagine would be from the meninges, so be sure to fully remove this prior to dissociation of the cortex. Unless you are confusing fibroblasts for astrocytes. Too many astrocytes is a result of too much agitation at the differential adhesion step.

    4) I have always used coated flasks, in my experience OPCs will not adhere to uncoated surfaces. I am willing to bet you'll get almost no OPCs if you continue to use uncoated flasks. If you want you can try to use other substrates such as PDL, poly-O-ornithine, collagen etc.

    5) I haven't noticed any significant transformation of OPCs into astrocytes in the presence of FBS. I imagine this might occur more frequently in immortalized OPC cell lines. Perhaps that's what you are thinking of.

    I hope this helps, otherwise best of luck in your research.

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 20, 2014 - 8:52 PM
  33. Hi Ryan, thank you ver much for detailed answer. Sorry for my english, i couldnt explain good.
    I did the shaking of course but without putting shaker inside the CO2 incubator, I did shaking at 37 degree incubation only and at 180 rpm. Because the flasks are uncoated(I have used uncoated flasks for rat OPC"s without problem, that is why I tried this way with mouse as well) I hesitated to increase rpm to 240 or so, to prevent astrocyte detachment, and I also think that fibroblast contamination is because of the meninges. Second time I will prevent it.
    It is good to know that I must use coated flasks, I will try again, if you say so.
    Thank you so much, good luck to too..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 21, 2014 - 6:22 AM
  34. Hi Again,
    Alright - I strongly suggest to put the shaker in the incubator for the overnight shake, as I have found this to be a crucial step in maintaining pH balance. The media on your cells should always be a rich red colour (indicative of a balanced pH) all the time. Mouse OPCs are very sensitive to pH, and will die with too much fluctuation. If during your shaking, the media becomes at all purple-ish or yellow-ish, your OPC yield will drastically reduce. I wouldn't be surprised either if this was a contributing factor to the monolayer detachment you experienced previously. There is a significant difference in the in vitro behaviour/viability of mouse OPCs as compared to rat, hence the generation of this protocol. Your best bet is to simply follow this protocol exactly as is.

    Thanks for your comment, and good luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 21, 2014 - 12:25 PM
  35. Hi.
    One more question Ryan, about amount of the brains seeded, I was seeding 2 rat brains/ T75 flask , in the mouse case to obtain same amount of cells seeded I was using 6 brains per flask. Would you suggest to use 3-4 instead of six? and if i seed 6 animals should I increase concentration of insulin added to mixed culture media? Overall what would be optimum amount of brains per T75 flask in your opinion? Does it matter to much? Because here you use 1 brainper T25 flask.
    Thanks again..

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    February 26, 2014 - 4:20 PM
  36. Hi Aysel,
    Again, your best bet for success is to follow the protocol exactly as is - T25 flasks are what this method has been optimized for. I suppose T75 flasks have 3 times the surface area, so in theory 3 mice would have to be seeded to a T75 to yield the same cell density. I've never tried this protocol with T75 flasks, and I know that different culture vessels have different impact on growth and survival of OLs.
    Best - RO

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    February 27, 2014 - 10:47 AM
  37. Hi Ryan . I want to say that I replicated the procedure exactly as here, and have got very good yield, but I have 1 more question to you, majority of OPCs die in the differentiation media after 6-7 days of incubation. You indicated that it is important not to distrub them until fixation, but how do you do the medium chage, I put 1 ml media first day and did 2/3 media change each 3 days, I seeded all cells to one 24 well format plate, at each time points(3 d, 6 d, 9 d) I transfer the slides to new plate and fix them there and do medium change for rest of the slides. By the way I culture OPCs at 5% CO2, becaue I have only 2 options 5% and 10%, i cant adjust ph of the incubators at this time point. Is it the contributing factor for death of the cells after 4-5 days of incubation?

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 2:43 PM
  38. Hi Aysel - I'm glad to hear things are looking up -

    1. I don't suggest differentiating the OLs for longer than 6 days. If you're finding they are not differentiating fast enough, you can add 4 mg of L-Thyroxine to the 100X OL-supplement (see the media recipe list above).

    2. It is normal to lose OLs over the time course of differentiation. That being said, you don't want to encourage death by moving the cells or culturing at low pH. You should not be changing the media of the purified OL cultures at any point - they do not require media changes. The protocol also says to culture the OLs at 8.5% CO2. Since you have access to both 5 and 10% CO2 incubators, and 8.5 is closer to 10 than it is to 5, I suggest culturing them at 10%.

    3. Rather than culturing all of your time points in one dish, use 3 dishes (one for 3 days, one for 6 etc). That way, you won't have to disturb your other time points.

    4. Do not remove the coverslips from the wells of your 24 well dish during fixation - simply add concentrated PFA directly into the media and allow to fix for about 15 mins at room temp.

    Sounds like you're almost there, Best of luck - Ryan

    Reply
    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 3:58 PM
  39. Let me write it again to see if I have understood you correct, you say dont do any media change ever, neither at 3 days or 6 days or further? The other things I will try what you suggest, culturing and seeding in different plates at 10% CO2
    I want to thank you a lot for your help and all of the explanations.
    Thanks ..
    Best,
    Aysel

    Reply
    Posted by: Aysel J.
    March 19, 2014 - 4:22 PM
  40. Thats correct :)
    You're very welcome,

    Ryan

    Posted by: Ryan O.
    March 19, 2014 - 5:49 PM
  41. Hi Ryan,

    Thanks for sharing this protocol, looks really good and will try it out. I have a couple of questions regarding your protocol and was hoping you could shed some light on some problem I am experiencing at the moment.

    With regards to what you have just described, we actually perform a very similar mixed glial culture on P0-P3 rat brains. Our isolation stages are very similar with the exception we use DNAse1 and L-cysteine along with Papain. Upon plating our cell suspensions the flasks are densely populated with microglia on top, then opc's below and then astrocytes. We basically shake off our microglia before doing the overnight shake for the OPC's.

    My question is how do you get rid/ not see any microglia in your mouse cultures? Is it also possible to obtain microglia from your method?

    We are currently experiencing problems with obtaining OPC's from our overnight shake (in rat). The cells look healthy when in culture with the microglia but once the microglia are removed and we perform the steps required to plate the OPC's we have a lot of contaminants in with the cells, almost like long fibrous structures that are stained by trypan blue. We still obtain + 5 million OPC's but the cells do not look healthy and the morphology is not consistent with OPC's. Upon plating these cells they fail to show characteristics of OPCs and a lot die off. I will mention we do not shake in an incubator but in an orbital shaker at 250rpm with the caps sealed tight and parafilm. Have you ever encountered this?

    Many thanks .

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    February 9, 2015 - 1:06 PM
  42. Hi Graeme, thanks for your question.
    We do in fact get microglia in our mixed cultures, but we remove them prior to the overnight shake with a slow short shake (as in the rat method). These shaken off microglia are a very pure population, and can be cultured separately if desired.
    With regard to the problems you’re encountering shaking your rat cultures, I can’t say I’ve experienced anything quite like what you’re describing. It almost sounds like your cultures are suffering from contamination (maybe yeast?). We’ve experienced contamination a couple of times, and it resulted in much of the monolayer dissociating from the base of the flask during the overnight shake. If you like, you can send me a pic of the fibrous structures in the hopes that I could recognize what they are (romea077@uottawa.ca).
    We have never had luck shaking flasks in an orbital shaker – we exclusively use tissue culture incubators with vented caps. One risk of using an orbital shaker is they pose a threat for contamination, as they are often used for bacterial cultures.
    I hope this helps and best of luck,
    Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2015 - 11:12 AM
  43. Hi Ryan,

    Thanks for your reply.

    I tried the protocol and achieved very nice OPC's so everything seems ok there.

    With regards to what I was seeing after my rat OPC shake, I believe it not to be of any contamination but more something coming out of solution in our media. As a test I shook DMEM10% in a T75 flask, 37 degrees, 250rpm overnight. The next day I took an aliquot and looked at it with trypan blue. To my surprise I saw the same fibrous clumps that I was seeing after the OPC shake

    . My DMEM only contains FBS and pen-step so this has to be something in FBS. My most recent shake off I decided to shake off 5 flasks with DMEM 10% and 5 flasks with OPC media (our OPC media contains 2.5ml FBS vs 50ml in DMEM). The next day after following normal protocol I counted the cells from both conditions. The OPC media flasks had almost none of the fibrous clumps whereas the DMEM flasks had alot. I can now partially get round this problem by filtering with 40uM strainer but have you ever heard or seen this kind of thing. We have used several batches if FBS so it cannot be that every batch has precipitated proteins in it but perhaps what were doing is causing precipitation of FBS proteins that are affecting the OPC's?

    Thanks

    Graeme

    Reply
    Posted by: Graeme I.
    March 15, 2015 - 4:16 PM
  44. Hi Ryan,

    Is your FBS from Invitrogen decomplemented ? If so did you buy decomplemented or did you heat it at 56*C and for how long.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Ludovic D.
    February 24, 2017 - 10:40 AM
  45. Hi Ludovic,
    I've used FBS that has been heat-inactivated by the manufacturer, and I've also used FBS that I've heat inactivated myself. For the latter, if memory serves, about 30 minutes at roughly 50 degrees C should do the trick (water bath).
    Good luck, Ryan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2017 - 11:49 AM
  46. Hi Ryan,
    I am wondering if you have any experience with adding Cre Recombinase Adenovirus to the cultures? And if you think a particular day would be best to add it? I was thinking of adding it on D8 (1 day before the full media change) but wasn't sure if adding virus and then shaking the cells would cause too much stress?
    Thanks,
    Megan

    Reply
    Posted by: Megan R.
    April 30, 2018 - 2:39 PM

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