Анализ Магистральные нейронной клеточной миграции Crest с использованием модифицированного Zigmond пробирной палаты

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Подход к анализу миграции эксплантированных клеток (ствол клетки нервного гребня) описывается. Этот метод является недорогим, нежный, и способны различать хемотаксис с обеих хемокинез и других воздействий на миграционный полярности, таких как полученные из межклеточных взаимодействий в рамках первичного ствола нейронной клеточной культуре гребня.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay. J. Vis. Exp. (59), e3330, doi:10.3791/3330 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. День 1: Изоляция магистральных труб для нейронных ночной культуры на покровных

  1. Инкубируйте куриных яиц в течение 56 ч при 38 ° C. Удалите яйца от инкубации, мягко распылять их с 70% этанола, а затем дайте им высохнуть. Разбейте яйца в открытой УФ-стерилизованные стеклянные панели задач.
  2. Извлечение каждого эмбриона от желтка и поместить его в куриных Рингера. Для этого сначала резки вокруг своей кровью островов с изогнутыми ножницами, а затем, с тупым пинцетом, выбрать эмбриона до его внеэмбриональной мембраны и поместить его в стерильные пластиковые чашки Петри с раствором куриного Рингера.
  3. Изолируйте ствол каждого эмбриона путем обрезки лишнюю внеэмбриональной мембран, а также черепа, блуждающего и сакральное осевых уровнях с использованием вольфрамовой иглы (рис. 1). Во-первых, выберите около 9 эмбрионов, которые находятся между стадиях HH15-17 11. Для стадии HH15 и выше, переднего и заднего мозга оси образуют острый угол и, следовательно, голова кажется, наклоните каудально. Встадии HH17, почки хвоста присутствуют и наклон снизу, но еще не содержит сомитов. С вольфрамовой иглой, обрезать внеэмбриональной мембраны около 2 мм от эмбриона и отрезать любую эмбриональных тканей кпереди от сомитов 10. Кроме того, удалите все хвостового эмбриональных тканей вокруг, начиная с пятой самой новообразованной сомитов.
  4. Поместите изолированные эмбриональных стволов в диспазы (0,24 ЕД / мл DMEM) и инкубировать их в течение 1 ч 15 мин при 37 ° C и 5% CO 2. Как только стволы начинаются инкубации, начать подготовку 6 покровные (CS) для культивирования эксплантов NT (шаги 1.5-1.8).
  5. Промыть 6 CS в 70% этанола (разводят в стерильной, сверхчистой воды), а затем дайте им высохнуть. Использование лаборатории маркер, нарисуйте круг в центре каждой базовой станции, что составляет около 1 см в диаметре (этот круг позже поможет вам определить, где фибронектина пальто была применена). В то же лицо каждого CS, написать слово "быть" (или другие асимметричные слово или форма) за пределами круга (это поможет уНУ определить, является ли отмеченный сторона CS вверх или вниз).
  6. Место каждого CS в отдельном 40 х 10 мм стерильную чашку с отмеченной поверхностью вниз и позволит блюдо, чтобы сидеть под открытым бактерицидные УФ-лампы в течение 10 мин.
  7. Применяют 60 мкл фибронектина (FN; 10 мкг / мл DMEM) в немаркированных поверхность CS, следя за всю площадь в 1 см, окружность покрытием. Поместите блюд для инкубации при температуре 37 ° C в течение 30 минут, а затем тщательно аспирации фибронектина друг от CS.
  8. Добавить 250 мкл «культура» среде [DMEM с L-глютамин (2 мМ), пенициллина (100U/ml), стрептомицин (100 мкг / мл), а 8% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)], чтобы FN-покрытием области CS. Поместите блюд, содержащих каждая CS при 37 ° C и 5% CO 2, пока НТ были изолированы.
  9. Передача всех инкубационных стволы эмбриона одного 5 см стекло чашки Петри содержащие L15 среднего и начать рассекает каждую NT с использованием тонких щипцов и вольфрамовой иглы (рис. 1). Carefully нарезать вдоль границы NT и сомиты с острой иглой вольфрама в то же время осторожно, чтобы не повредить NT. Часто бывает проще начать изоляции каждого NT от хвостового-самая конце ствола.
  10. Выберите 6 из прямой и длинный НТ к культуре ночи (НТ примерно между 8 и 15 сомитов долго рекомендуется). С помощью пипетки наконечник загрунтовать культуральной среде, передавать каждую из 6 НТ своим предварительно подготовленным CS (с шагом 1,5 через 1,8). Будьте уверены, что NT не осталось плавающих на поверхности. Если NT является плавающей, капать среды на него, пока он тонет помощью микропипетки.
  11. Поместите каждое блюдо при температуре 37 ° C и 5% CO 2 в течение ночи. Будьте осторожны, чтобы гарантировать, что каждая NT находится в FN-покрытием площадь его соответствующим CS непосредственно перед размещением блюдо в инкубаторе (используя круг, нарисованный в шаге 1.5, как ссылка). Микропипетки могут быть использованы для лучшего отрегулировать положение каждой NT, если необходимо.
  12. Место вне менее 2 мл питательной среды (без сыворотки) в стерильную пробирку для центрифугирования 15 мл и инкубируют в течение ночи при 37 ° C и 5% CO 2. Оставьте крышку слегка открутить, чтобы рН среды для регулировки ночь. Предварительное инкубирование среды имеет важное значение для предотвращения образования пузырьков в камере, которая может сорвать создание молекулярных градиентов. Такие "преинкубированы" среда должна быть использована во всех дальнейших шагов. Когда не используется, эта среда должна быть инкубации при температуре 37 ° C.

2. День 2: Загрузка камеры Изменения Zigmond и покадровой анализ миграции клеток

  1. Из 6 НТ культурный, выберите 3 культур лучше всего подходит для анализа. Как правило, NCC культур, которые имеют по крайней мере один длинный, прямой край должен быть выбран (рис. 2). 3 лучшие культур будет использоваться для загрузки и пленка 3 Изменения Zigmond камерах в течение дня, каждый с разным лечения. Из 3 культурах, выбрать один для Loadinг первой камеры и вернуть остальные в инкубатор для последующего использования.
  2. С помощью ватного тампона нанесите тонким, ровным слоем вазелина окружающих водоемов и мостов одного изменения Zigmond камеры.
  3. С вольфрамовой иглой, осторожно удалите NT от CS, оставляя окружающих НКС прикреплены к поверхности CS. Отметить блюдо с ручкой, чтобы помнить ориентации самый прямой край культуре NCC.
  4. Нанесите несколько капель преинкубированы среды на мосту. Возьмите CS с тонким пинцетом, приложите край CS против Kimwipe, чтобы удалить большинство старых культуральной среде, то сразу поместить CS на изменение Zigmond камеру так, чтобы прямые края культуры, который будет снят по центру над Длина моста и примерно перпендикулярной к мосту резервуара границы (рис. 2а, б).
  5. Использование инвертированного микроскопа, двигаться прямо границу NCC, чтобы быть на стороне моста ближе к гоэлектронной резервуар, который будет содержать подозреваемых chemotactant (рис. 2В, для управления этим будет соответствовать зависимости от того, резервуар загружается секунду). Кроме того, более точно выровнять линейку культуры перпендикулярно к мосту резервуара границы.
  6. Осторожно, но надежно нажмите CS в вазелин присутствующих на камеру Zigmond, убедившись, что она полностью изолирована на камеру, а затем поместить дополнительный вазелин по краю CS для дальнейшего обеспечения будет герметичным. Точная регулировка угла границы NCC еще раз, чтобы исправить за любые движения во время процесса герметизации.
  7. Загрузите резервуар, который не будет содержать подозреваемых chemotactant первого (рис. 2В). Сделайте это путем загрузки 1 мл шприц (25 G х 1,5 дюйма прилагаемой иглы) с примерно 300 мкл инкубируют среднего и вводить среды в резервуаре до полного (будьте осторожны, чтобы не генерировать пузырьки в резервуаре). Вставьте резервуар с обеих сторон SUFFicient количество вазелина до загрузки следующей водохранилища.
  8. Повторите шаг 2.7, кроме этого времени, используя преинкубированы среде, содержащей кандидата chemotactant. Очень важно при создании молекулярных градиент через культуру всегда загружать резервуар, содержащий молекулу быть проверены после загрузки резервуара хватает испытания молекулы.
  9. Поместите загруженный камеры Zigmond при 37 ° С для инкубации в течение 1 ч до съемок. Изображение самый прямой границы культуры NCC течение 3 ч при 90 с интервалом в то время как инкубации при примерно 37 ° C (рис. 2а, б). До создания любого фильма, не забудьте выровнять камеру так, чтобы края изображения, которые будут получены приведены в соответствие с и трогательно краю моста, который граничит с последним резервуаром загруженной (рис. 2В, верхняя панель; пунктирная коробка представляет идеальную положение для работы с изображениями). Это будет способствовать последующего анализа программного обеспечения, стандартизации направленности молекулярных градиент применяется и йE Расстояние от резервуара снят в каждом фильме производства.
  10. Для элементов управления, повторите шаги 2.2-2.9 для каждой из двух других культур NCC выбран (шаг 2,1), но заполнить каждого резервуара с соответствующей среде. Для одного вида контроля заполнения резервуаров с обеих преинкубированы среде, не содержащей молекулы должны быть проверены. Для второго контроля лечения, премьер-мост с несколькими каплями преинкубированы среде, содержащей подозреваемых chemotactant до установки CS. Затем, загрузить и резервуаров с той же среде, содержащей подозреваемых chemotactant.
  11. Используйте ImageJ (NIH) Руководство слежения (rsb.info.nih.gov / ц / плагины / дорожке / track.html) и хемотаксис и Migration Tool v1.01 (www.ibidi.de / Applications / ap_chemo.html) плагины для отслеживания Миграция периферической НКС по прямой границы культуры JУсть отображаемого и анализировать различные параметры миграционной траектории, полученные (рис. 2В-C).

3. Представитель Результаты:

Образец ячейки траектории из фильма, где много НКС ствола были отзывчивы к кандидату хемоаттрактанта помощью техники выше показано (рис. 2D). Большинство клеток в данном случае положительного ответа отображается чистая движение вверх хемоаттрактанта градиент (как показано на рисунке красным цветом). Траектория данные могут быть использованы для анализа других свойств клеточной миграции, а также.

Для того, чтобы визуально оценить применяется градиент изменения Zigmond камеры, Alexa Fluor 488 IgM сопряженное (MW ~ 900 кДа) была загружена во второй резервуар изменения Zigmond камеры (примерно 40 мкг / мл H 2 O). Градиент был создан 1 ч и еще несколько настоящему после 26 ч, но значительно уменьшилось на 50 ч (рис. 3). Если молекула быть проверены меньше, то прикладная градиент Wiбудем деградировать быстрее, чем то, что показано на рисунке.

Рисунок 1
Рисунок 1. Эксплантации магистрального уровня НТ в течение ночи на культивирование фибронектина покрытием покровные. Потому что ствол НКС расслаиваться от спинного NT расположены рядом с сомитов 8-28, данный сегмент NT выделяют микродиссекции и культивировали в течение ночи на покрытой фибронектином CS, чтобы обеспечить эмиграцию НКС от эксплантов NT. Изолированные НТ, которые находятся между 8-15 сомитов долго и относительно прямой лучше всего подходит для культивирования в течение ночи, поскольку они, как правило, дают NCC культур с более длинными прямыми границами. Регионы нервной трубки, которые порождают другие нейронные уровни осевого гребня показаны более мелким шрифтом. с, сомитов.

Рисунок 2
Рисунок 2. Метод оценки миграции эксплантированных НКС стволапомощью камеры изменение Zigmond. (A) Удлиненный ствол NCC культуры готовят в течение ночи культивирования НТ и, как следствие культур NCC, по крайней мере один длинный, прямой границы выбранных для эксперимента. Самая длинная прямая граница выбранной культуры, затем расположены перпендикулярно к мосту резервуара границ, и поэтому параллельно вектору будущем применять градиент. (B) после точной регулировки положения культуры NCC на Zigmond камеры и уплотнение покровное к камере, камеру загружен. При тестировании хемотаксис, резервуар, который не будет содержать подозреваемых chemotactant (-) загружена первая и опечатаны. Тогда, другой резервуар загружается с подозреваемым chemotactant (+) и запечатанный. Периферийные НКС по ранее выбранной границы могут быть отображены и отслеживается с помощью ручного отслеживания плагин для ImageJ (нижняя панель). (C) многочисленные миграционные характеристики в ответприложенного градиента может быть оценена на основе отслеживания данных. Например, индекс хемотаксис может быть получена путем деления смещения ячейки вдоль оси х на общее расстояние оно переносится. (D) пример привлекательного ответ показан сюжет ячейки траектории первоначально порожденных хемотаксиса и миграции Инструмент плагин для ImageJ. Отправной точкой для каждой траектории устанавливается на происхождение (0,0). Обратите внимание, как многие другие клетки мигрируют к центру хемоаттрактанта source.The масс всех клеток при их окончательной позиции (синий крест, все клетки одинаковый вес) также ближе к хемоаттрактанта источник. НКС, клетки нервного гребня; Красной дорожки, клеток, которые мигрировали в сторону водохранилища загружаются с подозрением на хемоаттрактанта, черный треков, клеток, которые мигрировали далеко; (+), более высокие концентрации chemotactant; (-), нижняя chemotactant концентрации.

Рисунок 3
Распределение интенсивности по мосту из камеры Изменения Zigmond в разное время после добавления Alexa Fluor 488 сопряженной IgM. камере был загружен в подобной манере, описанной в протоколе с основными исключениями, которые инкубируют воды (вместо преинкубированы среде) был использован для разбавления антител до 40 мкг / мл, и небольшие воздушные карманы присутствовали на концах моста (от среза, где выше профилей интенсивности, где принимаются). Первоначально, не градиент присутствовал на большей части моста. По состоянию на 1 га градиент был создан и остался настоящим до 26 часов. К 50 ч наличии градиента был непоследователен в разных областях мосту, и когда он присутствует, крутизна градиента значительно уменьшилось. Все профили были получены из идентичных срез через мост (мост из одного резервуара границы до другой) с помощью AxioVision 4,6 программного обеспечения. Отметим, что даже в то время как воздухкарманы присутствовали, градиент не был нарушен. Высокая, высокая интенсивность, низкая, низкая интенсивность; оси х, расстояние по всей ширине моста (2 мм); (+), резервуар загружается с Alexa Fluor 488 IgM сопряжены; (-), водохранилище не загружались с сопряженными.

Рисунок 4
Рисунок 4. Изменение Zigmond камеры спецификаций. Показана схема модифицированного Zigmond камере используется здесь вместе со своим Габаритные размеры (± 0,2 мм). Измерения могут быть умеренно корректируется при заказе в соответствии с индивидуальными предпочтениями.

Дополнительный протокол: Изготовление изменения Zigmond палата

Пожалуйста, обратитесь к рисунку 4 в качестве справочника по протоколу ниже:

  1. Покупка лист 3/16 "толстый полированный акриловый (4,45 мм фактической толщины).
  2. Используя таблицу увидел, вырезать заготовки камере негабаритных кгрубые размеры 33,25 х 64,57 мм мм. Это позволяет 3,175 мм дополнительный материал для обработки.
  3. Установите камеру пустой на тиски. С фрезерный станок и 6,35 мм (1/4 ") немного фрезы, чистовую обработку стороны камеры, чтобы их точные размеры: 30,07 мм х 61,39 мм.
  4. Установите камеру пустую на фрезерном станке и найдите в центре пустого вдоль обеих осей х и у с краю поиска, а затем нулю центре города.
  5. Приобретать камеры высоте (оси), касаясь немного концевой фрезы на верхней поверхности и нулевой высоте.
  6. Использование 3,91 мм (0,154 ") немного фрезы, смещение немного 3,03 мм вдоль оси х (положительное направление) для первого резервуара. Начать обработку в камеру на глубине до 2,84 мм при перемещении вдоль оси у (положительное направление) до 7,62 мм (0,300 "), а затем пройти до 7,62 мм (0,300") в противоположном (отрицательном) направлении до полного резервуара длина 15,24 мм (0,600 "). Смещениенемного до 3,03 мм (0,119 ") вдоль оси х (отрицательное направление) и повторите ту же процедуру для второго резервуара.
  7. Установите камеру на ее краю и просверлить отверстие с помощью 1,09 мм (0,043 дюйма) сверлом на конце каждого резервуара (4 общего числа), который соединяется конце резервуара в сторону камеры для загрузки среды в процессе экспериментов.
  8. Замочите камеры и в теплой мыльной воде, чтобы помочь устранить любые химические загрязняющие вещества.
  9. Замочить и промыть камеру и в дважды дистиллированной воде, чтобы удалить мыло. Камеры готов к работе, как описано выше.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Проведение исследования хемотаксиса на магистральных НКС оказалось сложным для ряда причин. Магистральные НКС представляют собой гетерогенную популяцию стволовых клеток, что будет отличать, если культурный долгосрочные, поэтому ствол НКС должно быть получено от первичного эксплантации ствола на уровне NT. Обычные методы для изучения хемотаксиса реакции однородно распределенных популяций клеток в пробирке трудно проверить на магистральных НКС, поскольку они впервые требуют, чтобы клетки являются изолированными и однородно replated в хемотаксиса камеры (например, камера Boyden 12). Изоляция достаточно НКС может быть утомительно, как эксплантации десятки НТ могут быть необходимы для создания равномерного распределения магистральных НКС достаточным для еще одного эксперимента. Кроме того, НКС никогда не поднял, смешанных и однородно перераспределяются в их естественном контексте. Таким образом, НКС, которые replated для того, чтобы выполнять определенные обычных анализов хемотаксиса может вести себясовершенно иначе, чем в естественных условиях в отношении миграционного поведения.

Здесь мы описываем модифицированной методики для оценки ствол NCC хемотаксис в более естественном контексте. Одна из основных задач при оценке хемотаксиса ответ магистральных НКС без равномерного распределения является сильная полярность присуща НКС в самобытную культуру эксплантов в дополнение к своей врожденной гетерогенной личности. Например, ствол НКС имеют тенденцию мигрировать в значительной степени перпендикулярно (на выезде) из NT, когда в культуре 13. Различных факторов, влияющих на стволе NCC полярности в эксплантов культура может быть настолько сильным, что трудно окончательно определить изменения в клеточной полярности индуцированных chemotactant градиента. Используя наши новые изменения Zigmond анализ можно провести разграничение между естественной клеточной полярности присущие эксплантов культуры и изменения, вызванные chemotactant градиента, а также мониторинг других миграционных параметров TERS, такие как упорство и скорость. Мы заметили, что угол каждой границе эксплантированных культуры ствола NCC сталкивается во многом определяет направленность присуща передовым ствола НКС на этой границе. Например, если граница культуры NCC выходит на север, то среднее направленности НКС от границы будет северный. Наш анализ изменения минимизирует изменчивость вызвана присуща направленность передовых НКС по стандартизации угла границы NCC, из которой они мигрируют по отношению к прикладной chemotactant градиента (рис. 2). При выборе передовых НКС на относительно прямой границы культуры ствола NCC, всегда позиционирования, которые прямо границу NCC перпендикулярно приложенной градиента, а затем только для отслеживания миграции передовые клеток на этой границе, один в состоянии обнаружить сдвиги в среднем направленности ствола НКС к себе или от источника chemotactant, которые могли бы остаться незамеченными.

ных "> Ниже приводится краткая информация о многочисленных выгод, получаемых от вышеуказанных протоколов:

  1. Это дает возможность отслеживать живой миграции клеток.
  2. Изменения Zigmond камера может производить относительно определен градиент, которые могут быть визуализированы с флуоресцентной молекулы (рис. 3).
  3. Зигмунд камер избежать определенных ограничений стандартного анализа Boyden ранее описанных другими 10,14.
  4. Наши изменение Zigmond камеры могут быть самодельными по очень низкой стоимости (материалы оцениваются в менее чем 1 долл. США за многоразовые камеры).
  5. Потому что нейронные трубы культивировали на покровных, а затем запечатал с вазелином, можно легко выбрать ориентацию культуры по отношению к будущему применяется градиент.
  6. Трипсинизации или сотовый соскоб не требуется.
  7. Только небольшое количество выделений NT являются необходимыми.
  8. Культуры NCC больше похожа на распределение магистрального НКС найдены в естественных условиях, чем когда клеткиподнимаются и replated с однородным распределением.

Эти преимущества также, вероятно, относится к аналогичной первичных культур эксплантов других типов клеток, и, следовательно, такой подход может иметь более широкое желательности для использования в оценке природных миграционное поведение других эксплантированных стволовых клеток.

Хотя преимущества анализа изменения Zigmond камеры много, у него есть некоторые ограничения. Некоторые недостатки стандартной камере Zigmond уже обсуждалось прошлое исследователей 14. Одним из ограничений наш модифицированный тест Zigmond является использование вазелина для крепления CS и подключить каждого резервуара отверстия. Вазелин позволяет гибко ориентироваться именно культура NCC по отношению к chemotactant градиент, но приводит к изменчивости расстояние между CS и мост, который может привести к изменчивости применяется градиент 14. Кроме того, монтажCS и герметизация камеры с вазелином часто ловушки маленькие карманы воздуха в камере, которая может сжимать, ведущие к небольшим количеством потока через мост 14. Такой поток может потенциально нарушить молекулярную градиент в течение некоторого эксперимента и привести к увеличению изменчивости в результатах своего. Хотя это возможно, серьезные нарушения градиента не наблюдалось, когда визуализированы с помощью Alexa Fluor 488 IgM конъюгат (рис. 3), даже тогда, когда воздушные карманы были представлены к концам моста (от области, где интенсивность флуоресценции измеряли) . Таким образом, даже в условиях, которые могли бы потенциально нарушена Alexa Fluor 488 IgM градиент, градиент не была скомпрометирована в районе моста измеряется (ближе к середине моста). Если требуется долгосрочная градиент, который является одновременно очень стабильным и предсказуемым, то этот анализ, скорее всего, не хватит. Тем не менее, такой точности часто не требуется, и по сравнению с некоторыми другимиобщие анализы хемотаксиса (таких, как Boyden анализы или определенных анализов с использованием chemotactant пропитанные шарики), градиент, вероятно, будет более стабильной и предсказуемой.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Мы даем особую благодарность Lino Ким, Стив Гусман и Ujit Satyarthi для оказания технической помощи в ходе разработки этого метода. Мирон Hawthorne, Ричард Spengel, и Роберто Рохас обрабатывается камеры, используемые здесь, и при условии, столь необходимую техническую помощь. Примечательно, что Роберто Рохас производится Рисунок 4. Мы также благодарны за ценные советы Скотт Фрейзер до развития выше анализ хемотаксиса. Эта работа была частично поддержана NIH-МУРЗ SCORE-5S06GM048680-13, Медб и награды от ХСС, Northridge Graduate Program Support Диссертация на CW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Omega Scientific DM-22
Penicillin Streptomycin Solution Omega Scientific PS-20 100X Stock Concentration
L-Glutamine Omega Scientific GS-60 100X Stock Concentration
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-11 Lot# 105247 (or another that is comparable)
Modified Zigmond chamber Home made N/A Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol
Cell culture dish Denville T6040 40 x 10 mm
Fibronectin BD 354008 10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM
Coverslips Fisher 12-548-B Precleaned; 22 x 22 mm
L15 medium Thermo Scientific SH30525.02
Petroleum Jelly Comforts 011110794642 100%
Centrifuge tube Biologix 10-9152 15 ml
Dispase Cell Systems 4Z0-850 10X Stock Concentration
Syringe BD 309602 1 ml
Needle BD 305127 25 G x 1.5 in.
Alexa Fluor 488-IgM Invitrogen A21042 Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM
Dissecting Forceps FST Misc. Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium
Tungsten Needle N/A N/A Home made; placed in a pin holder
Blunt Forceps Tiemann 160-18 Used for transferring embryos to Ringer's from egg yolk

Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber

Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:

  1. Purchase a sheet of 3/16" thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
  2. Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
  3. Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4") end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
  4. Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
  5. Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
  6. Using a 3.91 mm (0.154") end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300") and then traverse to 7.62 mm (0.300") in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600"). Offset the bit to 3.03 mm (0.119") along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
  7. Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
  8. Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
  9. Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
  2. Baker, C. V. Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. 4th edn, Springer. New York. (2005).
  3. Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. Division of labor during trunk neural crest development. Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).
  4. Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).
  5. Wang, H. U., Anderson, D. J. Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth. Neuron. 18, 383-396 (1997).
  6. Krull, C. E. Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration. Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).
  7. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development, Cambridge, England. 133-199 (2006).
  8. De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells. The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).
  9. Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells. J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).
  10. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
  11. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chicken embryo. J. Morph. 88, 49-52 (1951).
  12. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  13. Davis, E. M., Trinkaus, J. P. Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).
  14. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics