ट्रंक तंत्रिका शिखा सेल प्रवास का विश्लेषण एक संशोधित Zigmond चैंबर परख का उपयोग

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Explanted कोशिकाओं (ट्रंक तंत्रिका शिखा कोशिकाओं) के प्रवास का विश्लेषण करने के लिए एक दृष्टिकोण वर्णित है. इस विधि सस्ती, कोमल, और प्राथमिक ट्रंक तंत्रिका शिखा सेल संस्कृति के भीतर सेल सेल बातचीत से प्राप्त उन लोगों के रूप में प्रवासी polarity पर दोनों किसी रासायनिक पदार्थ द्वारा किसी जीव की क्रियाशीलता का बढ़ जाना और अन्य प्रभावों से chemotaxis भेद करने में सक्षम है.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay. J. Vis. Exp. (59), e3330, doi:10.3791/3330 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. दिन 1: रातोंरात संस्कृति के लिए ट्रंक तंत्रिका ट्यूबों के coverslips पर अलगाव

  1. 38 में 56 घंटे के लिए लड़की अंडे सेते डिग्री सेल्सियस गर्मी से अंडे निकालें, हल्का उन्हें 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे, और फिर उन्हें शुष्क करने की अनुमति. एक यूवी निष्फल ग्लास ट्रे में खुला अंडे तोड़.
  2. अपने जर्दी से प्रत्येक भ्रूण निकालें और यह लड़की घंटी जगह. घुमावदार कैंची से अपने रक्त द्वीप के आसपास पहली काटने से यह मत करो, तो कुंद संदंश के साथ, भ्रूण लेने के लिए और अपने extraembryonic झिल्ली से यह जगह एक बाँझ प्लास्टिक पेट्री डिश में लड़की घंटी समाधान युक्त.
  3. बंद trimming अतिरिक्त extraembryonic झिल्ली के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कपाल, vagal, और त्रिक axial एक टंगस्टन सुई (1 छवि) प्रयोग के स्तर से प्रत्येक भ्रूण की ट्रंक अलग. सबसे पहले, 9 के बारे में भ्रूण का चयन करें कि HH15-17 चरणों 11 के बीच हैं. HH15 चरणों और अग्रमस्तिष्क और पश्चमस्तिष्क अक्षों एक न्यूनकोण फार्म और इसलिए सिर दुमदारी से झुकाव होता है. मेंHH17 मंच, पूंछ कली मौजूद है और tilts औदरीयता करता है, लेकिन somites अभी तक नहीं होते हैं. सुई के साथ एक टंगस्टन, बंद extraembryonic झिल्ली से भ्रूण के बारे में 2 मिमी ट्रिम कर दीजिए और किसी भी भ्रूण 10 विखंड पूर्वकाल ऊतकों में कटौती. इसके अलावा सभी लांगुलिय भ्रूण पांचवां सबसे नवगठित विखंड के आसपास से शुरू ऊतकों को हटा दें.
  4. में पृथक भ्रूण चड्डी Dispase (0.24 यू / मिलीलीटर DMEM) प्लेस और 1 घंटे 15 मिनट के लिए उन्हें 37 पर सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. एक बार चड्डी ऊष्मायन शुरू, संवर्धन NT explants के लिए 6 (सीएस) coverslips (1.5-1.8 कदम) की तैयारी शुरू.
  5. 6 70% इथेनॉल में सीएस कुल्ला (बाँझ ultrapure पानी में पतला), और फिर उन्हें शुष्क करने की अनुमति. एक प्रयोगशाला मार्कर का उपयोग करना, प्रत्येक सीएस केंद्र है कि व्यास में 1 सेमी (इस चक्र बाद में मदद की है, जहां एक fibronectin कोट लागू हो गया है की पहचान) के बारे में है एक वृत्त खींचना. प्रत्येक सीएस वही चेहरा, शब्द "" (या कुछ अन्य विषम शब्द या आकार) (y मदद करेंगे तैयार सर्कल के बाहर लिखनेकहां की पहचान है कि सीएस के रूप में चिह्नित की ओर का सामना करना पड़ रहा है या नीचे).
  6. एक अलग 40 में जगह प्रत्येक सीएस एक्स चिह्नित सतह के नीचे का सामना करना पड़ रहा है और पकवान 10 मिनट के लिए एक germicidal यूवी दीपक के नीचे खुला बैठने की अनुमति के साथ 10 मिमी बाँझ पकवान.
  7. 60 μl fibronectin (FN, 10 ग्राम / मिलीलीटर DMEM) लागू सीएस के अगोचर सतह जबकि 1 सेमी सर्कल के भीतर पूरे क्षेत्र को यकीन है कि बनाने लेपित है. व्यंजन जगह 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और फिर ध्यान से प्रत्येक सीएस से fibronectin aspirate.
  8. FN-लेपित के क्षेत्र के लिए 250 μl "संस्कृति" मध्यम [एल Glutamine साथ DMEM (2 मिमी), पेनिसिलीन (100U/ml), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 मिलीग्राम / एमएल), और 8% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)] सीएस. 37 में प्रत्येक सीएस युक्त व्यंजन प्लेस डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 फिर जब तक एनटीएस पृथक किया गया है.
  9. एक 5 सेमी गिलास पेट्री L15 मध्यम युक्त डिश के लिए सभी incubated भ्रूण चड्डी स्थानांतरण और बाहर हर ठीक संदंश और एक टंगस्टन सुई (1 छवि) का उपयोग NT विदारक शुरू. सीarefully एक तेज टंगस्टन सुई के साथ NT और somites के सीमा के साथ टुकड़ा जबकि सतर्क किया जा रहा NT नुकसान नहीं. यह अक्सर आसान दुम का सबसे ट्रंक के अंत से प्रत्येक NT अलग शुरू.
  10. 6 रातोंरात संस्कृति (एनटीएस लगभग 8 और 15 somites के बीच लंबे समय की सिफारिश कर रहे हैं) के लिए straightest और सबसे लंबे समय तक एनटीएस में से एक का चयन करें. एक micropipette मध्यम संस्कृति के साथ primed टिप का उपयोग करते हुए, अपने स्वयं के पहले तैयार सीएस 6 एनटीएस प्रत्येक हस्तांतरण (1.8 के माध्यम से 1.5 कदम से). यकीन है कि NT सतह पर चल नहीं रहना है. अगर NT चल रहा है, पर यह मध्यम ड्रिप जब तक यह एक micropipette का उपयोग डूब.
  11. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 रातोंरात प्रत्येक पकवान प्लेस. करने के लिए सुनिश्चित करें प्रत्येक NT FN-लेपित अपने संबंधित सीएस क्षेत्र के भीतर तुरंत इनक्यूबेटर में पकवान (चक्र के एक संदर्भ के रूप में 1.5 चरण में तैयार का उपयोग करके) रखने के लिए पहले है सावधान रहो. एक micropipette बेहतर प्रत्येक NT की स्थिति को समायोजित अगर जरूरत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  12. पर प्लेससंस्कृति के माध्यम से कम से कम 2 मिलीलीटर (सीरम बिना) और एक बाँझ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में रातोंरात सेते हैं. टोपी छोड़ दो थोड़ा मध्यम के पीएच के लिए रातोंरात समायोजित की अनुमति unscrewed. पूर्व incubating मध्यम के लिए अपने कक्ष में बुलबुला गठन, जो एक आणविक ढाल की स्थापना को बाधित कर सकते हैं को रोकने में मदद करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस तरह के "preincubated" मध्यम भविष्य के सभी चरणों में किया जाना चाहिए. जब इस्तेमाल नहीं किया जा रहा है, इस माध्यम 37 incubating किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस

2. 2 दिन: संशोधित Zigmond कक्ष विश्लेषण और सेल प्रवास के समय चूक लोड हो रहा है

  1. 6 सुसंस्कृत एनटीएस से, 3 संस्कृति का विश्लेषण के लिए सबसे उपयुक्त का चयन करें. आम तौर पर, एनसीसी संस्कृतियों है कि कम से कम एक लंबे, सीधे बढ़त (2A छवि) का चयन किया जाना चाहिए. 3 सर्वश्रेष्ठ संस्कृतियों लोड और फिल्म दिन भर 3 संशोधित Zigmond कक्षों, प्रत्येक एक अलग उपचार के साथ करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. 3 संस्कृतियों के बाहर, एक loadin के लिए चयनजी पहले चैम्बर और इनक्यूबेटर में बाद में उपयोग के लिए दूसरों की वापसी.
  2. एक कपास झाड़ू का प्रयोग, एक पतली, पेट्रोलियम जेली का भी परत जलाशयों और एक संशोधित Zigmond कक्ष के पुल के आसपास लागू होते हैं.
  3. सुई के साथ एक टंगस्टन, सीएस से धीरे NT निकालने के लिए, जबकि आसपास के सीएस के सतह से जुड़ी एनसीसीएस छोड़ने. एनसीसी संस्कृति का straightest बढ़त के उन्मुखीकरण याद कलम के साथ पकवान मार्क.
  4. पुल पर preincubated माध्यम की कुछ बूँदें रखें. एक पुरानी संस्कृति के माध्यम की सबसे को दूर करने के लिए Kimwipe खिलाफ ठीक संदंश के साथ सीएस, थपका सीएस के किनारे उठाओ, तो तुरंत संशोधित Zigmond कक्ष पर सीएस इतनी जगह है कि फिल्माया जा संस्कृति के सीधे बढ़त पर केन्द्रित है पुल की लंबाई और लगभग सीधा पुल जलाशय सीमा (छवि 2A, बी).
  5. एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग, सीधे एनसीसी सीमा को स्थानांतरित करने के लिए वें के लिए निकटतम पुल के किनारे पर होई जलाशय है कि संदिग्ध chemotactant शामिल (छवि 2B, नियंत्रण के लिए इस जलाशय जो भी दूसरे भरी हुई है के अनुरूप होगा). इसके अलावा, अधिक पतले संस्कृति के सीधे बढ़त align बॉर्डर पुल जलाशय खड़ा होना.
  6. ध्यान से, लेकिन सुरक्षित पेट्रोलियम जेली Zigmond कक्ष पर वर्तमान में सीएस दबाते हैं, यकीन है कि यह पूरी तरह से कक्ष पर सील तो सीएस के किनारे करने के लिए आगे सुनिश्चित करें यह airtight हो जाएगा साथ अतिरिक्त पेट्रोलियम जेली जगह बनाने. एनसीसी सीमा के कोण फिर ठीक समायोजित करने के लिए सील की प्रक्रिया के दौरान किसी भी आंदोलन के लिए सही है.
  7. लोड जलाशय है कि संदिग्ध chemotactant 1 (छवि 2B) शामिल नहीं होंगे. लगभग 300 μl preincubated मध्यम और जलाशय में पूर्ण होने तक मध्यम (जबकि सावधान किया जा रहा जलाशय में किसी भी बुलबुले उत्पन्न नहीं) इंजेक्षन के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज (संलग्न सुई अंदर 25 जी 1.5 x) लोड करके ऐसा करते हैं. एक suff के साथ दोनों पक्षों पर जलाशय प्लगपेट्रोलियम जेली का icient पहले अगले जलाशय लोड करने के लिए राशि.
  8. 2.7 कदम इस उम्मीदवार chemotactant युक्त preincubated माध्यम का उपयोग कर समय को छोड़कर, दोहराएँ. यह महत्वपूर्ण है जब संस्कृति भर में एक आणविक ढाल हमेशा परीक्षण किया अणु कमी जलाशय लोड करने के बाद परीक्षण किया जा अणु युक्त जलाशय लोड पैदा.
  9. 37 में लोड Zigmond कक्ष प्लेस डिग्री सेल्सियस 1 घंटे के लिए सेते हैं फिल्माने के लिए पहले. छवि 3 घंटे के लिए एनसीसी संस्कृति का straightest 90 के अंतराल पर सीमा जबकि लगभग सेल्सियस 37 (छवि 2A, बी) incubating. पहले किसी भी फिल्म बनाने के लिए कैमरा संरेखित करें इतना है कि छवियों के किनारे करने के लिए प्राप्त किया जा के साथ गठबंधन कर रहे हैं और पुल कि पिछले जलाशय लोड सीमाओं (छवि 2B, ऊपरी पैनल के किनारे को छू सुनिश्चित हो, धराशायी बॉक्स आदर्श का प्रतिनिधित्व करता है इमेजिंग के लिए स्थिति). यह आणविक लागू ढाल और वें के दिशात्मकता मानकीकरण के द्वारा बाद में सॉफ्टवेयर विश्लेषण की सुविधा होगीहर फिल्म में फिल्माया ई जलाशय से दूरी का उत्पादन किया.
  10. नियंत्रण के लिए, दोहराने दो अन्य एनसीसी चयनित (2.1 चरण में) संस्कृतियों में से प्रत्येक के लिए 2.2-2.9 कदम है, लेकिन एक उपयुक्त माध्यम से प्रत्येक जलाशय को भरने के. दोनों जलाशयों को भरने के नियंत्रण के एक प्रकार के लिए preincubated मध्यम के लिए परीक्षण किया जा अणु युक्त नहीं. एक दूसरे नियंत्रण के इलाज के लिए, प्रधानमंत्री संदिग्ध chemotactant युक्त सीएस बढ़ते पहले preincubated माध्यम की कुछ बूंदों के साथ पुल. फिर, एक ही संदिग्ध chemotactant युक्त मध्यम के साथ दोनों जलाशयों लोड.
  11. ImageJ (एनआईएच) मैनुअल ट्रैकिंग का उपयोग (rsb.info.nih.gov ij / / plugins / ट्रैक / track.html) और chemotaxis और प्रवासन v1.01 उपकरण (www.ibidi.de / / अनुप्रयोगों ap_chemo.html) plugins ट्रैक करने के लिए संस्कृति जम्मू के सीधे सीमा के साथ परिधीय एनसीसीएस के प्रवासउस्त imaged और प्रवासी प्राप्त trajectories (छवि 2B - सी) के विभिन्न मापदंडों का विश्लेषण.

3. प्रतिनिधि परिणाम:

एक फिल्म से जहां कई ट्रंक एनसीसीएस एक उम्मीदवार ऊपर तकनीक का उपयोग कर chemoattractant के लिए उत्तरदायी थे सेल trajectories का एक नमूना दिखाया गया है (छवि 2 डी). एक सकारात्मक प्रतिक्रिया के इस उदाहरण में ज्यादातर कोशिकाओं chemoattractant ढाल को एक शुद्ध आंदोलन (के रूप में लाल रंग में दिखाया गया है) प्रदर्शित होता है. प्रक्षेपवक्र डेटा सेल प्रवास के अन्य गुणों के रूप में अच्छी तरह से विश्लेषण किया जा सकता है.

आदेश में नेत्रहीन एक संशोधित Zigmond कक्ष, एक Alexa Fluor 488 आईजीएम संयुग्म (मेगावाट ~ 900 केडीए) में एक आवेदन ढाल का मूल्यांकन करने के लिए एक संशोधित Zigmond चैम्बर के 2 जलाशय (लगभग 40 ग्राम / एमएल एच 2 हे) में भरी हुई थी. एक ढाल 1 घंटे द्वारा स्थापित किया गया था और अभी भी कुछ हद तक 26 घंटे के बाद मौजूद है, लेकिन बहुत से 50 घंटे से कम (3 छवि). यदि परीक्षण किया जा अणु छोटा है, तो लागू ढाल वाईक्या दिखाया गया है की तुलना में तेजी से नीचा करूँगा.

चित्रा 1
चित्रा 1 fibronectin लेपित coverslips पर रातोंरात संवर्धन के लिए ट्रंक स्तर एनटीएस Explantation. क्योंकि ट्रंक पृष्ठीय NT से एनसीसीएस delaminate 8-28 somites के निकट स्थित है, NT के इस खंड microdissection और एक fibronectin लेपित सीएस पर रातोंरात सुसंस्कृत NT explant से एनसीसीएस की उत्प्रवास के लिए अनुमति देने के लिए अलग है. पृथक एनटीएस कि 8-15 somites लंबी और अपेक्षाकृत सीधे के बीच कर रहे हैं सबसे अच्छा रातोंरात संवर्धन के लिए उपयुक्त हैं के रूप में वे अब सीधे सीमाओं के साथ एनसीसी संस्कृतियों उपज होते हैं. न्यूरल ट्यूब कि अन्य तंत्रिका शिखा axial का स्तर को जन्म देने का क्षेत्र एक छोटे फ़ॉन्ट में दिखाए जाते हैं. है, कायखंड.

चित्रा 2
चित्रा 2 explanted ट्रंक एनसीसीएस के प्रवास के मूल्यांकन के लिए विधि.एक बार संशोधित Zigmond कक्ष का उपयोग. (ए) लम्बी ट्रंक एनसीसी संस्कृतियों और कम से कम एक लंबे, सीधे सीमा के साथ एनटीएस परिणामी एनसीसी संस्कृतियों के रातोंरात संवर्धन द्वारा तैयार कर रहे हैं प्रयोग के लिए चुना जाता है. चयनित संस्कृति का सबसे लंबे समय तक सीधे सीमा तो पुल जलाशय सीमा सीधा तैनात कर रहे हैं, और इसलिए भविष्य लागू ढाल के वेक्टर के समानांतर (बी) के बाद Zigmond कक्ष और सील पर एनसीसी संस्कृति की स्थिति ठीक समायोजन. चैम्बर के लिए coverslip कक्ष भरी हुई है. जब chemotaxis परीक्षण, जलाशय कि संदिग्ध chemotactant नहीं शामिल होंगे (-) 1 और सील भरी हुई है. फिर, अन्य जलाशय संदिग्ध (+) chemotactant और सील के साथ भरी हुई है. पहले से चयनित सीमा के साथ परिधीय एनसीसीएस तो imaged और किया जा सकता है ImageJ (नीचे के पैनल) के लिए मैनुअल ट्रैकिंग प्लगइन का प्रयोग करके ट्रैक (सी) के जवाब में अनेक प्रवासी विशेषताओं.करने के लिए लागू ढाल ट्रैकिंग डेटा के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक chemotaxis सूचकांक कुल दूरी चले गए है एक सेल x-अक्ष विस्थापन विभाजित करके प्राप्त किया जा सकता है (डी) एक आकर्षक प्रतिक्रिया का एक उदाहरण एक सेल प्रक्षेपवक्र शुरू chemotaxis और प्रवासन द्वारा उत्पन्न साजिश के द्वारा दिखाया गया है. ImageJ के लिए उपकरण प्लगइन. प्रत्येक प्रक्षेपवक्र के शुरुआती बिंदु के मूल (0,0) के लिए सेट कर दिया जाता है. नोट कितने कोशिकाओं को उनके अंतिम स्थिति में सभी कोशिकाओं के द्रव्यमान का chemoattractant source.The केंद्र की ओर पलायन (ब्लू क्रॉस, सभी समान रूप से भारित कोशिकाओं) भी chemoattractant स्रोत के करीब है. एनसीसीएस, तंत्रिका शिखा कोशिकाओं, लाल पटरियों, कोशिकाओं है कि के साथ भरी हुई जलाशय की ओर चले गए एक संदिग्ध chemoattractant, काले पटरियों, कोशिकाओं है कि दूर चले गए, (+), उच्च chemotactant एकाग्रता, (-), कम chemotactant एकाग्रता.

चित्रा 3
अलग एक Alexa Fluor 488 आईजीएम संयुग्म के अलावा के बाद समय पर एक संशोधित Zigmond चैम्बर के पुल के पार तीव्रता प्रोफाइल चैम्बर एक समान तरीके में मुख्य अपवादों के साथ प्रोटोकॉल में वर्णित है कि लोड किया गया था कि preincubated पानी (बजाय preincubated मध्यम) 40 ग्राम / मिलीलीटर एंटीबॉडी जलमिश्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और छोटे हवा जेब पुल के छोर (टुकड़ा है जहां ऊपर तीव्रता प्रोफाइल जहां लिया से दूर) में उपस्थित थे. प्रारंभ में, कोई ढाल पुल के सबसे भर में मौजूद था. 1 हेक्टेयर ढाल की स्थापना की थी और 26 घंटे के माध्यम से मौजूद रहे. पुल के विभिन्न क्षेत्रों में 50 घंटे के ढाल की उपस्थिति असंगत था, और जब वर्तमान ढाल के steepness काफी कम हो गया था. सभी प्रोफाइल पुल पार एक समान टुकड़ा (एक सीमा पुल - जलाशय से अन्य) AxioVision सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 4.6 से उत्पन्न किया गया. ध्यान दें कि भले जबकि हवाजेब उपस्थित थे, ढाल बाधित नहीं किया गया था. उच्च, उच्च तीव्रता, कम, कम तीव्रता, x-अक्ष पुल (2 मिमी) की पूरी चौड़ाई भर दूरी,, (+), Alexa Fluor 488 आईजीएम संयुग्म के साथ भरी हुई जलाशय, (-) संयुग्म साथ, जलाशय नहीं भरा हुआ है.

चित्रा 4
चित्रा 4 संशोधित Zigmond कक्ष विनिर्देशों दिखाया संशोधित Zigmond अपने आयामी विनिर्देशों (± 0.2 मिमी) के साथ साथ यहां इस्तेमाल किया चैम्बर के एक चित्र है. माप मध्यम क्रम में व्यक्तिगत वरीयताओं को मैच करने के लिए समायोजित कर सकते हैं.

पूरक प्रोटोकॉल: एक संशोधित Zigmond चैंबर के निर्माण

उल्लेख कृपया नीचे प्रोटोकॉल के लिए एक संदर्भ के रूप में 4 चित्रा:

  1. 3/16 "मोटी पॉलिश ऐक्रेलिक (4.45 मिमी वास्तविक मोटाई) के एक पत्रक खरीद.
  2. एक मेज का प्रयोग देखा, चैम्बर के लिए oversized कारतूस में कटौती33.25 मिमी x 64.57 मिमी के किसी न किसी आयाम. यह 3.175 मिमी मशीनिंग के लिए अतिरिक्त सामग्री की अनुमति देता है.
  3. एक शिकंजा पर कक्ष खाली सेट. 30.07 मिमी x 61.39 मिमी: एक मिलिंग मशीन और एक 6.35 मिमी (1/4 ") अंत चक्की बिट, खत्म मशीनिंग अपने सटीक आयामों के चैम्बर के पक्ष के साथ.
  4. मिलिंग मशीन पर चैम्बर खाली स्थिति और दोनों एक्स और एक किनारे खोजक साथ y अक्षों के साथ रिक्त के केंद्र का पता लगाने, तो केंद्र स्थान शून्य.
  5. ऊपर की सतह को छू अंत चक्की बिट द्वारा चैम्बर ऊंचाई (z-अक्ष) के अधिग्रहण और ऊंचाई शून्य.
  6. एक 3.91 मिमी (0.154) अंत चक्की बिट का उपयोग, 1 जलाशय के लिए x-अक्ष (सकारात्मक दिशा) के साथ बिट 3.03 मिमी ऑफसेट. 2.84 मिमी की गहराई के चेंबर में मशीनिंग शुरू जबकि अक्ष y (सकारात्मक दिशा) के साथ 7.62 मिमी (0.300) चलती है और फिर 7.62 मिमी (0.300 पार "एक पूर्ण जलाशय विपरीत दिशा (नकारात्मक) में) 15.24 मिमी (0.600) की लंबाई. ओफ़्सेटबिट अक्ष x (नकारात्मक दिशा) के साथ 3.03 मिमी (0.119) और 2 जलाशय के लिए एक ही प्रक्रिया को दोहराएँ.
  7. स्थिति अपनी बढ़त पर कक्ष और प्रत्येक (4 कुल) जलाशय है कि प्रयोग के दौरान मध्यम लोड करने के लिए चैम्बर की ओर से जलाशय के अंत जोड़ता के अंत पर एक 1.09 मिमी (0.043 इंच) ड्रिल बिट का उपयोग कर छेद ड्रिल.
  8. कक्ष अच्छी तरह से गर्म साबुन पानी में मदद करने के लिए किसी भी रासायनिक contaminants को दूर करने के लिए भिगोएँ.
  9. भिगोएँ और चैम्बर कुल्ला डबल आसुत पानी में अच्छी तरह से करने के लिए किसी भी साबुन हटाने. कक्षों अब ऊपर वर्णित के रूप में उपयोग करने के लिए तैयार कर रहे हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ट्रंक एनसीसीएस पर chemotaxis अनुसंधान का आयोजन कारणों की एक श्रृंखला के लिए चुनौती साबित हो गया है. इसलिए, ट्रंक एनसीसीएस NT ट्रंक स्तर की प्राथमिक explantation से प्राप्त किया जाना चाहिए, ट्रंक एनसीसीएस एक विषम स्टेम सेल आबादी है कि अगर लंबे समय तक अलग होगा सुसंस्कृत गठन. परम्परागत तरीकों homogenously वितरित इन विट्रो में सेल आबादी के chemotactic प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए ट्रंक एनसीसीएस पर परीक्षण के बाद से वे पहली आवश्यकता है कि कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं और chemotaxis कक्ष (जैसे, एक Boyden कक्ष 12) में replated homogenously मुश्किल कर रहे हैं. पर्याप्त एनसीसीएस अलग रूप में एनटीएस के दर्जनों की explantation ट्रंक भी एक प्रयोग के लिए पर्याप्त एनसीसीएस का एक समरूप वितरण बनाने के लिए आवश्यक हो सकता है कठिन हो सकता है. इसके अतिरिक्त, एनसीसीएस उठाया, कभी नहीं मिश्रित कर रहे हैं, और homogenously उनके प्राकृतिक संदर्भ में पुन: वितरित किए. इसलिए, एनसीसीएस व्यवहार कर सकता है कि आदेश में replated कुछ पारंपरिक chemotaxis assays प्रदर्शनप्रवासी व्यवहार के संबंध में vivo परिस्थितियों में से काफी अलग है.

यहाँ, हम एक अधिक प्राकृतिक संदर्भ में ट्रंक एनसीसी chemotaxis के मूल्यांकन के लिए एक संशोधित तकनीक का वर्णन करता है. एक बड़ी चुनौती है, जब एक समरूप वितरण बिना ट्रंक एनसीसीएस की chemotactic प्रतिक्रिया का मूल्यांकन उनकी जन्मजात विषम पहचान के अलावा मजबूत मूल explant संस्कृति के भीतर एनसीसीएस के निहित polarity है. उदाहरण के लिए, ट्रंक एनसीसीएस NT करने के लिए काफी हद तक सीधा ओर पलायन (दूर) से करते हैं जब 13 संस्कृति में. विभिन्न कारकों कि explant संस्कृति के भीतर प्रभाव ट्रंक एनसीसी polarity इतना शक्तिशाली है कि यह मुश्किल है कि अंतिम सेल polarity में परिवर्तन एक chemotactant ढाल द्वारा प्रेरित की पहचान हो सकती है. हमारे नए संशोधित Zigmond परख का उपयोग यह संभव है कि प्राकृतिक सेल संस्कृतियों और एक chemotactant ढाल द्वारा प्रेरित परिवर्तन explant निहित polarity के बीच भेद करने के लिए, जबकि अन्य प्रवासी पैरामो निगरानी दृढ़ता और गति के रूप में इस तरह के मंत्रियों. हमने देखा है कि कोण एक explanted ट्रंक एनसीसी संस्कृति के प्रत्येक सीमा के चेहरे काफी हद तक है कि सीमा पर अग्रणी बढ़त ट्रंक एनसीसीएस के निहित दिशात्मकता निर्धारित करता है. उदाहरण के लिए, अगर एक एनसीसी संस्कृति की एक सीमा उत्तर चेहरे, तो उस सीमा से एनसीसीएस का मतलब दिशात्मकता उत्तरी होगा. हमारे संशोधित परख एनसीसी सीमा के कोण से जो वे लागू chemotactant ढाल (2A छवि) के सापेक्ष ओर पलायन मानकीकरण अग्रणी बढ़त एनसीसीएस निहित दिशात्मकता की वजह से परिवर्तनशीलता कम करता है. ट्रंक एनसीसी संस्कृति की एक अपेक्षाकृत सीधे सीमा पर अग्रणी बढ़त एनसीसीएस का चयन, हमेशा लागू ढाल स्थिति है कि सीधे एनसीसी सीमा सीधा, और फिर केवल उस सीमा पर अग्रणी बढ़त कोशिकाओं के प्रवास पर नज़र रखने के लिए परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम है की ओर या दूर एक chemotactant स्रोत है कि अन्यथा नहीं चल पाता जाना होगा से ट्रंक एनसीसीएस का मतलब दिशात्मकता में.

ent "नीचे> कई उपरोक्त प्रोटोकॉल से प्राप्त लाभ का एक सारांश है:

  1. यह जीवित कोशिका प्रवास को ट्रैक करने की क्षमता प्रदान करता है.
  2. संशोधित Zigmond चैम्बर एक अपेक्षाकृत परिभाषित ढाल का उत्पादन कर सकते हैं कि एक फ्लोरोसेंट अणु (3 छवि) के साथ देखे जा सकते हैं.
  3. Zigmond कक्षों मानक Boyden पहले 10,14 दूसरों के द्वारा वर्णित परख के कुछ सीमाओं से बचने के लिए.
  4. हमारे Zigmond कक्षों संशोधित किया जा सकता है (कम से कम 1 अमरीकी डालर प्रति पुन: प्रयोज्य कक्ष में सामग्री का अनुमान है) एक बहुत कम कीमत पर घर बनाया है.
  5. क्योंकि तंत्रिका ट्यूब coverslips पर संवर्धित कर रहे हैं और बाद में पेट्रोलियम जेली के साथ बंद, एक आसानी से भविष्य लागू ढाल के सापेक्ष संस्कृति के उन्मुखीकरण का चयन कर सकते हैं.
  6. Trypsinization या सेल scraping की आवश्यकता नहीं है.
  7. NT isolations का केवल एक छोटी राशि के लिए आवश्यक हैं.
  8. एनसीसी संस्कृति जब कोशिकाओं से ट्रंक vivo में पाया एनसीसीएस के वितरण के लिए समान हैउठा लिया और एक समरूप वितरण के साथ replated.

ये लाभ भी संभावना अनुरूप अन्य प्रकार की कोशिकाओं प्राथमिक explant संस्कृतियों के लिए लागू होता है, और इसलिए, इस दृष्टिकोण प्राकृतिक अन्य explanted स्टेम कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार का मूल्यांकन में इस्तेमाल के लिए एक व्यापक वांछनीयता हो सकता है.

हालांकि संशोधित Zigmond कक्ष परख के कई फायदे हैं, यह कुछ सीमाएँ है. मानक Zigmond चैम्बर के कुछ नुकसान पहले से ही पिछले 14 शोधकर्ताओं द्वारा विचार विमर्श किया गया है. हमारे संशोधित Zigmond परख की एक सीमा सीएस बढ़ते और प्रत्येक जलाशय छेद plugging के लिए पेट्रोलियम जेली का इस्तेमाल होता है. पेट्रोलियम जेली ठीक पूरबी एक एनसीसी chemotactant ढाल के सापेक्ष संस्कृति, लेकिन सीएस और पुल है जो लागू 14 ढाल में परिवर्तनशीलता का कारण सकता है के बीच की दूरी में परिवर्तनशीलता की ओर जाता है. एक लचीलापन देता है इसके अतिरिक्त, बढ़तेसीएस और पेट्रोलियम जेली के साथ चैम्बर सील अक्सर जाल चैम्बर में हवा की छोटी जेब है जो 14 पुल पार प्रवाह की छोटी मात्रा में करने के लिए अग्रणी सेक सकता. इस तरह के प्रवाह संभवतः कुछ प्रयोगों के दौरान आणविक ढाल को बाधित कर सकता है और एक परिणाम में वृद्धि की परिवर्तनशीलता सीसा. हालांकि यह संभव है, एक गंभीर ढाल व्यवधान नहीं देखा गया था जब एक Alexa Fluor 488 आईजीएम संयुग्म (3 छवि) का उपयोग करते हुए, यहाँ तक कि जब पुल के छोर (क्षेत्र है जहां फ्लोरोसेंट तीव्रता मापा गया था से दूर) की ओर हवा जेब उपस्थित थे visualized . इसलिए, स्थिति है कि संभावित Alexa Fluor 488 आईजीएम ढाल बाधित सकता है के तहत भी, ढाल मापा (पुल के बीच के करीब) पुल के क्षेत्र में समझौता नहीं किया गया था. यदि एक लंबी अवधि के एक ढाल है कि दोनों अत्यधिक स्थिर है और पूर्वानुमान है की आवश्यकता है, तो इस परख की संभावना नहीं पर्याप्त होगा. हालांकि, ऐसी सटीक अक्सर की आवश्यकता है कुछ अन्य की तुलना में नहीं है औरआम chemotaxis assays (जैसे Boyden assays या कुछ assays chemotactant लथपथ मोती का उपयोग कर के रूप में), ढाल को और अधिक स्थिर और उम्मीद के मुताबिक होने की संभावना है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हम इस पद्धति के विकास के दौरान लिनो किम, स्टीव Guzman और Ujit सत्यार्थी इन बातों के लिए विशेष तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं. Myron Hawthorne, रिचर्ड Spengel, और रॉबर्टो Rojas machined यहां इस्तेमाल किया कक्षों और बहुत जरूरी तकनीकी सहायता प्रदान की है. विशेष रूप से, रॉबर्टो Rojas चित्रा 4 का उत्पादन किया. हम भी हैं स्कॉट फ्रेजर अमूल्य ऊपर chemotaxis परख के विकास के लिए पहले सलाह के लिए आभारी हैं. यह काम एक NIH MBRS स्कोर MEdB 5S06GM048680-13 और CSU, Northridge स्नातक थीसिस सहायता कार्यक्रम से एक CW पुरस्कार से आंशिक रूप से समर्थन किया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Omega Scientific DM-22
Penicillin Streptomycin Solution Omega Scientific PS-20 100X Stock Concentration
L-Glutamine Omega Scientific GS-60 100X Stock Concentration
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-11 Lot# 105247 (or another that is comparable)
Modified Zigmond chamber Home made N/A Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol
Cell culture dish Denville T6040 40 x 10 mm
Fibronectin BD 354008 10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM
Coverslips Fisher 12-548-B Precleaned; 22 x 22 mm
L15 medium Thermo Scientific SH30525.02
Petroleum Jelly Comforts 011110794642 100%
Centrifuge tube Biologix 10-9152 15 ml
Dispase Cell Systems 4Z0-850 10X Stock Concentration
Syringe BD 309602 1 ml
Needle BD 305127 25 G x 1.5 in.
Alexa Fluor 488-IgM Invitrogen A21042 Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM
Dissecting Forceps FST Misc. Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium
Tungsten Needle N/A N/A Home made; placed in a pin holder
Blunt Forceps Tiemann 160-18 Used for transferring embryos to Ringer's from egg yolk

Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber

Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:

  1. Purchase a sheet of 3/16" thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
  2. Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
  3. Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4") end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
  4. Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
  5. Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
  6. Using a 3.91 mm (0.154") end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300") and then traverse to 7.62 mm (0.300") in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600"). Offset the bit to 3.03 mm (0.119") along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
  7. Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
  8. Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
  9. Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
  2. Baker, C. V. Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. 4th edn, Springer. New York. (2005).
  3. Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. Division of labor during trunk neural crest development. Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).
  4. Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).
  5. Wang, H. U., Anderson, D. J. Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth. Neuron. 18, 383-396 (1997).
  6. Krull, C. E. Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration. Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).
  7. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development, Cambridge, England. 133-199 (2006).
  8. De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells. The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).
  9. Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells. J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).
  10. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
  11. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chicken embryo. J. Morph. 88, 49-52 (1951).
  12. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  13. Davis, E. M., Trinkaus, J. P. Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).
  14. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics