수정 Zigmond 회의소 분석을 사용하여 트렁크 신경 크레스트 세포 마이그레이션 분석

Neuroscience

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Summary

explanted 전지 (트렁크 신경 크레스트 세포)의 마이그레이션을 분석 접근 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은, 저렴한 부드러운, 그리고 차 트렁크 신경 크레스트 세포 배양에서 세포 세포의 상호 작용에서 파생 된 것과 같은 철새 극성에 모두 chemokinesis 및 기타 영향의 chemotaxis를 구별 할 수 있습니다.

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Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay. J. Vis. Exp. (59), e3330, doi:10.3791/3330 (2012).

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Abstract

신경 크레스트 세포는 (NCCs) 상피 - 중간 엽 전이 1,2를 진행 한 후 등쪽의 신경 튜브 (NT)에서 이민을하는 척추 동물의 개발에 존재하는 세포의 과도 인구입니다. 자신의 목표에 도달 할 때까지 EMT 따라 NCCs는 stereotypic 경로를 따라 큰 거리를 마이그레이션. NCCs는 뉴런, glia, melanocytes, 그리고 1-3 chromaffin 세포를 포함한 세포 유형의 광대 한 배열로 차별화. 자신의 적절한 타겟 위치에 도달하고 인식 NCCs의 능력 트렁크 구성 요소를 NCC-파생를 포함하는 모든 구조의 적절한 형성을위한 기초입니다. 트렁크 NCC 마이그레이션에 대한 지침의 메커니즘을 Elucidating하는 것은 큰 의미를 갖는 일이었다. 많은 분자 NCC 마이그레이션 4 안내하는 입증되었습니다. 예를 들어, 트렁크 NCCs는 이러한 Semaphorin, Ephrin, 그리고 슬릿 리간드 5-8 등의 제외지도 단서에 의해 거부 될 것으로 알려져 있습니다. 그러나,하지최근 트렁크 NCCs 9 식별 된 모든 chemoattractants이 때까지.

자기편 세포의 chemotactic 동작을 공부에 체외 접근 방법에서 기존는 불후의, homogenously 배포 세포를 가지고 가장 적합한하지만, 처음 균일 분포를 부족 빠르게 (예 : NCCs 등) 차별화 특정 기본 줄기 세포 문화에 적용 할 더 도전합니다. chemotaxis 연구 트렁크 NCCs의 분포를 균질화하는 한 접근 방식이 기본 NT의 explant 문화에서 트렁크 NCCs를 분리하는 것입니다 다음, 리프트하고는 거의 100 % 합류 할 replate. 그러나,이 도금 방식은 시간과 충분한 세포를 explant 노력의 상당한 양을 필요로 거칠고이며, 생체 조건에서 발견 할 수있는 이종 방식으로 트렁크 NCCs를 배포합니다.

여기, 우리는 requirin없이 트렁크 NCCs의 chemotaxis 및 다른 철새 반응을 평가 할 수 있습니다에서 체외 접근 방식을보고균일 한 세포 분포를 GA. 이 기술은, 기본의 시간 경과 영상을 이용하여 수정 Zigmond 챔버 (표준 Zigmond 챔버가 다른 10 설명) 내부 트렁크 NCCs을 교란되지 않은. 자신의 예측 자연 방향에 수직 인 chemotactant 그라디언트로 문화의 주변에서 트렁크 NCCs를 노출하여 적용 chemotactant 기울기에 의해 유도 철새 극성에 변경이 감지 할 수 있습니다. 이 기술은 저렴 복제 치료를 당 두 개의 NT의 explants의 배양을 필요로, 거친 셀 리프팅 (예 : trypsinization 등) 방지 생체 조건에 유사한 배포판에 트렁크 NCCs을 떠난, explantation과 실험 사이의 시간의 양 다운 컷 (이 가능성이 차별화의 위험을 감소), 그리고 수많은 철새 특성을 시간 경과 평가를 할 수 있습니다.

Protocol

1. 1 일 : coverslips에 밤 문화의 트렁크 신경 튜브의 분리

  1. 38 56 H에 대한 여자의 알을 품어 ° C.는 부화에서 알을 제거 다소 70 %의 에탄올과 함께 물을 뿌리 한 후이를 건조 할 수 있습니다. UV-소독 유리 트레이에 열려있는 알을 해봐.
  2. 의 난황에서 각 배아를 추출하고 여자는 벨소리의에 배치합니다. 곡선 가위로 그 피 섬 주변의 제 1 절삭하여이 작업을 수행 한 후, 무딘 집게와, 그 extraembryonic 막에 의해 배아를 들고 여자는 벨소리의 솔루션을 포함하는 멸균 플라스틱 페트리 접시에 배치합니다.
  3. 초과 extraembryonic 멤브레인을 트리밍뿐만 아니라 텅스텐 바늘 (그림 1)를 사용하여, 두개골 vagal, 그리고 성례의 축 수준의 각 배아의 줄기를 분리합니다. 첫째, 단계 HH15-17 11 사이에 구에 대한 배아를 선택합니다. 최대 단계 HH15와 들어, forebrain 및 hindbrain 축이 예각을 형성하고 따라서 머리 caudally 기울 나타납니다. 에무대 HH17는 꼬리 꽃 봉오리는 현재이며, 틸트 ventrally했지만 아직 somites 포함되어 있지 않습니다. 텅스텐 바늘로 배에서 약 2 mm로 extraembryonic 멤브레인을 트림과 10 체절에 앞 모든 배아 조직을 잘라. 또한 다섯 번째 가장 새로 형성된 체절 주변부터 모든 꼬리 배아 조직을 제거합니다.
  4. Dispase에서 분리 된 배아 줄기을 (0.24 U / ML DMEM) 장소 37에서 1 H 15 분에 넣어 부화 ° C 5 % CO 2. 줄기는 부화를 시작하면 배양 NT의 explants 6 coverslips (CS) (단계 1.5-1.8)를 준비 시작합니다.
  5. 70 % 에탄올 6 CS를 (살균, ultrapure 물에 희석) 헹굼 후이를 건조 할 수 있습니다. 실험실 마커를 사용 직경 1cm (fibronectin 코트가 적용된 곳이 원 나중에 확인하는 데 도움이됩니다)에 대해 각 CS의 중심부에 원을 그립니다. 각 CS 같은 얼굴에, 그 단어 (이 Y에 도움이 될 그려 원 외부 (또는 다른 비대칭 단어 나 모양) "이"을 작성ou는 CS의 표시된면이 아래로 직면하거나 여부를 확인).
  6. 별도의 40에 각 CS를 배치 표시된 표면이 아래로 직면하고 음식이 10 분의 살균 UV 램프 아래에 공개 앉아 할 수있는 X 10mm 무균 요리.
  7. 60 μl fibronectin (FN, 10 μg / ML DMEM)을 적용 1cm의 원 안에 전체 지역 확인하는 동안 CS의 해제 표면에은 코팅되어 있습니다. 30 분에 37 ° C에서 배양 한 후 조심스럽게 각 CS에서 fibronectin을 기음 위해 요리를 놓습니다.
  8. 의 FN-코팅 영역에 250 μl '문화'중간 [L-글루타민과 DMEM (2 ㎜), 페니실린 (100U/ml), 스트렙토 마이신 (100 mcg / ML) 및 8% 태아 소 혈청 (FBS)를] 추가 CS. 37 각 CS를 포함하는 요리를 놓고 ° C 5 % CO 2 다시 국세청이 분리 될 때까지.
  9. L15 매체를 포함하는 한 5cm 유리 페트리 접시에 모든 incubated 배아 줄기를 전송하고 고급 집게와 텅스텐 바늘 (그림 1)를 사용하여 각 NT를 해부 시작합니다. CNT를 손상하지 조심하면서 arefully 날카로운 텅스텐 바늘로 NT와 somites의 국경을 따라 잘라. 이 트렁크의 꼬리 - 가장 끝에서 각각 NT를 분리 시작하는 것이 더 쉽습니다.
  10. (약 8 15 somites 사이에 국세청이 오랜 추천) 밤 문화에 straightest과 긴 국세청 6을 선택합니다. 문화 매체와 중이오 micropipette 팁을 사용하여 (1.8 단계 1.5에서) 자신의 이전 준비 CS에 6 박의 각을 전송합니다. NT는 표면에 떠있는 상태로 유지되지 않습니다 있는지 확인하십시오. NT는 부동 인 경우가 micropipette를 사용하여 침몰 때까지에 매체를 똑.
  11. 37 ° C 5 % CO 2 박 각 접시를 놓습니다. 각 NT 바로 전에 보육에있는 접시를 (참조로 단계 1.5에서 그려진 원을 사용하여) 배치에 각 CS의 FN-코팅 지역 내에있는 유지를 위해주의하십시오. micropipette는 필요한 경우보다 각각 NT의 위치를​​ 조정하는 데 사용할 수 있습니다.
  12. 장소에서적어도 2는 살균 15 ML의 원심 분리기 튜브에 문화 매체의 ML (혈청없이) 37 ° C 5 % CO 2 박 품다. 뚜껑을 남겨은 약간 밤새 조정하는 매체의 pH를 허용하도록 unscrewed. 사전 잠복기 매체 것은 분자 그라디언트의 설립을 방해 할 수 있습니다 귀하의 챔버에서 거품 형성을 방지하는 것이 중요합니다. 예 : "preinc​​ubated"중간은 모든 향후 단계에 사용되어야합니다. 사용하지 않을 경우,이 매체는 37 잠복기가되어야 ° C.를

2. 일 2 : 수정 Zigmond 챔버와 셀 마이그레이션의 시간 경과 분석로드

  1. 배양 6 박을 버리고, 가장 분석에 적합 3 문화를 선택합니다. 일반적으로, 적어도 하나의 긴 직선 가장자리가 NCC 문화는 (그림 2A)을 선택해야합니다. 3 가장 문화는 다른 치료와 함께 각 하루 종일 셋 수정 Zigmond 챔버를로드 및 영화에 사용됩니다. 3 문화 중에 loadin에 대한 하나를 선택g는 첫 번째 챔버와 나중에 사용하기 위해 보육에 다른 사람들을 반환합니다.
  2. 면봉 사용하여 저수지 한 수정 Zigmond 챔버의 다리를 주변 석유 젤리의 얇은, 심지어 레이어를 적용합니다.
  3. CS의 표면에 부착 주변 NCCs을 떠나는 동안 텅스텐 바늘로 부드럽게, CS에서 NT를 제거합니다. NCC 문화의 straightest 가장자리의 방향을 기억하는 펜으로 요리를 선택합니다.
  4. 다리에 preincubated 매체의 몇 방울을 넣으십시오. 기존의 문화 매체의 대부분을 제거 할 수 Kimwipe에 대한 고급 집게와 CS, 소량 CS의 가장자리를 들고 다음, 즉시 촬영 할 문화의 직선 가장자리가 위에 중심이되도록 수정 Zigmond 챔버에 CS를 배치 다리의 길이와 거의 수직 다리 - 저수지의 국경 (그림 2A, B)로 변경합니다.
  5. 역 현미경 사용, 일에 가장 가까운 다리의 편에서는 게 바로 NCC 테두리를 이동(; 컨트롤이 두 번째로드 중 저수지에 해당합니다 그림 2B) 의심 chemotactant이 포함됩니다 전자 저수지. 또한보다 정교하게 다리 - 저수지의 국경에 수직이되도록 문화의 직선 가장자리를 맞 춥니 다.
  6. 조심스럽게,하지만 안전하게 완전히 더가 밀폐 될 수 있도록 CS의 가장자리를 따라 추가 석유 젤리를 배치 한 후, 챔버에 밀봉되어 있는지 확인하고, Zigmond 챔버에 존재 석유 젤리로 CS를 누르십시오. 밀봉 과정에서 어떤 움직임을 해결하기 위해 다시 NCC 테두리의 각도를 세밀하게 조정할 수 있습니다.
  7. 의심 chemotactant 첫 번째 (그림 2B)를 포함하지 않습니다 저수지를로드합니다. 약 300 μl preincubated 매체와 (저수지에서 거품을 생성하지 않도록주의하면서) 전체 때까지 저수지에 매체를 삽입으로 1 ML의 주사기 (첨부 바늘 인치 25 G X 1.5를)로드하여 이렇게. suff와 양쪽 저수지를 연결이전 다음 저장소를로드에 석유 젤리의 icient 금액입니다.
  8. 후보 chemotactant를 포함하는 preincubated 매체를 사용하여이 시간을 제외하고, 단계 2.7을 반복합니다. 항상 테스트 분자를 부족한 저수지를로드 한 후 테스트 할 수있는 분자를 포함하는 저장소를로드 할 수있는 문화를 통해 분자 그라디언트를 생성 할 때이 중요합니다.
  9. ° C 전에 촬영 1 H에 대한 배양하기 위해 37로드 Zigmond 챔버를 놓습니다. 이미지 90 초 간격으로 3시에 NCC 문화의 straightest 테두리는 약 37 ° C (그림 2A, B)에서 잠복기 동안. 이상적인 대표 점선 상자, 이전의 영화를 만드는, 획득 할 이미지의 가장자리가 함께하고 마지막 저수지로드를 인접 다리 (그림 2B, 상단 패널의 가장자리를 만지지 정렬되도록 카메라를 정렬해야합니다 이미지에 위치). 이것은 분자 적용 그라디언트와 일의 방향을 표준화하여 나중에 소프트웨어 분석을 용이하게합니다각 영화에서 촬영 저수지에서 전자 거리가 제작했다.
  10. 컨트롤에 대한 반복 (단계 2.1)을 선택한 두 개의 다른 NCC 문화 각각에 대해 2.2-2.9 단계를하지만, 적절한 매체를 사용하여 각 저수지를 채 웁니다. 한 가지 유형의 제어를 들어 preincubated 매체가 테스트 할 수있는 분자를 포함하지 않는과 두 저수지를 채 웁니다. 두 번째 제어 치료, 프라임 CS를 장착하기 전에 의심 chemotactant를 포함하는 preincubated 매체의 몇 방울과 다리입니다. 그런 다음, 의심 chemotactant를 포함하는 동일한 매체 모두 저수지를로드합니다.
  11. ImageJ (NIH) 수동 추적 사용 (rsb.info.nih.gov / 엘 제이 / 플러그인 / 트랙 / track.html)Chemotaxis 및 마이그레이션 도구 v1.01 (/ www.ibidi.de / 응용 프로그램 ap_chemo.html) 추적 플러그인을 문화 제이의 직선 국경을 따라 주변 NCCs의 마이그레이션이군요 이미징 및 취득 철새 궤도 (그림 2B-C)의 다양한 매개 변수를 분석 할 수 있습니다.

3. 대표 결과 :

많은 트렁크 NCCs이 위 기술을 사용하여 후보 chemoattractant에 응답했다 영화에서 셀 궤도의 샘플 (그림 2D) 표시됩니다. 긍정적 인 응답이 예에서 대부분의 세포는 chemoattractant 그라디언트 최대 순 이동을합니다 (빨간색으로 표시) 표시됩니다. 탄도 데이터는뿐만 아니라 세포 이주의 다른 속성을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

시각적으로 수정 Zigmond 챔버, 알렉사 형석 488 IgM 공액 (MW ~ 900 kDa)의 적용 기울기를 평가하기 위해 수정 Zigmond 챔버의 두 번째 저수지 (약 40 μg / ML H 2 O에서)에로드되었습니다. 기울기는 (그림 3) 1 H에 의해 설립, 26 H 후 여전히 다소 존재하지만, 크게 50 H가 감소되었습니다. 테스트 할 수있는 분자가 작은 경우에는 응용 그라디언트 부표시되는 내용보다 더 빨리 저하하겠습니다.

그림 1
그림 1. fibronectin - 코팅 coverslips에 하룻밤 배양을위한 트렁크 수준 국세청의 Explantation. 등쪽 NT에서 트렁크 NCCs의 delaminate이 somites 8-28 인접 해 있기 때문에, NT의 세그먼트는 microdissection 및 NT의 explant에서 NCCs의 이민을 허용 할 fibronectin 코팅 CS에서 하룻밤 배양에 의해 격리되어 있습니다. 사람들이 더 이상 직선 국경과 NCC 문화를 얻을하는 경향이로 8-15 somites 길고 상대적으로 직선 사이에 절연 국세청은 최고의 하루 아침에 배양에 적합합니다. 다른 신경 크레스트 축 수준을 야기 할 신경 튜브의 영역은 작은 글꼴로 표시됩니다. 초, 체절.

그림 2
그림 2. explanted 트렁크 NCCs의 마이그레이션을 평가하기위한 방법수정 Zigmond 챔버를 사용합니다. (A) 가늘고 긴 트렁크 NCC 문화는 적어도 하나의 긴 직선 테두리와 함께 국세청과 결과 NCC 문화의 밤 배양에 의해 준비가되어이 실험을 위해 선택됩니다. 선택한 문화의 가장 긴 직선 테두리가 다음 다리 - 저수지의 국경에 수직 위치, 그리고 미래를 적용 그라디언트의 벡터에 따라서 평행하다. Zigmond 챔버 및 씰링에 NCC 문화의 위치를 미세 조정 (B) 후 챔버에 coverslip은 챔버가로드됩니다. chemotaxis을 테스트를 할 때, 의심 chemotactant 포함되지 않습니다 저수지 (이 -) 첫 번째와 봉인로드됩니다. 그런 다음, 다른 저수지는 의심 chemotactant (+)와 봉인과 함께로드됩니다. 이전에 선택한 국경을 따라 주변 NCCs는 이미징 및 ImageJ (아래 패널)에 대한 수동 추적 플러그인을 사용하여 추적 할 수 있습니다. 반응 (C) 많은 철새 특성에 적용 기울기는 추적 데이터를 기준으로 평가 될 수있다. 예를 들어, chemotaxis 지수는이 마이그레이션 한 총 거리에 의해 X-축을 따라 세포의 변위를 나누어 도출 할 수 있습니다. (D) 매력 응답의 예는 처음 Chemotaxis 및 마이그레이션에 의해 생성 된 셀 궤적 플롯으로 표시됩니다 ImageJ에 대한 도구 플러그인. 각 궤도의 시작 지점은 원점 (0,0)으로 설정되어 있습니다. 또한 chemoattractant 원본에 가까운 (동일 가중치를 모든 셀 파란색 십자가)은 최종 위치에있는 모든 세포의 질량의 chemoattractant source.The 센터쪽으로 이주 얼마나 더 많은 세포합니다. NCCs, 신경 크레스트 세포, 레드 트랙과로드 저수지를 향해 마이그레이션 세포 의심 chemoattractant, 블랙 트랙, 거리에 마이그레이션 세포, (+), 높은 chemotactant 농도, (-), 낮은 chemotactant 농도.

그림 3
알렉사 형석 488 IgM의 공액의 추가에 따라 다른 시간에 수정 Zigmond 챔버의 다리 g> 그림 3. 강도 프로필이. 챔버는 메인 예외 프로토콜에 설명 된 그와 비슷한 방식으로로드 된 그 preincubated 물 (대신 preincubated 매체의) 40 μg / ML에 항체를 희석하는 데 사용하고, 작은 공기 주머니가 다리의 끝 (거리에 위의 강도 프로필 촬영 슬라이스에서)에 참석했다되었습니다. 처음에는 아무 그라디언트가 다리의 대부분에 걸쳐 존재 없었다. 로 1 하 기울기는 설립 26 H에 이르기까지 현재 남아되었다. 50 H하여 그라디언트의 존재가 다리의 서로 다른 영역에서 일관했고, 때 현재, 그라디언트의기구가 크게 감소되었습니다. 모든 프로필은 AxioVision 4.6 소프트웨어를 사용하여 다리 동일한 슬라이스 (한 다리 저수지 국경에서 다른까지)에서 생성되었습니다. 참고 동안에도 공기포켓이 존재했다, 기울기는 중단되지 않았습니다. 높은, 높은 강도, 낮은, 낮은 강도, 다리의 전체 너비 (2 ㎜)에서 X 축, 거리, (+), 알렉사 형석 488 IgM 켤레와 함께로드 저수지, (-), 저장소 켤레에로드되지 않았습니다.

그림 4
그림 4. 수정 Zigmond 챔버 사양. 표시는 차원 사양 (± 0.2 mm)과 함께 여기에 사용되는 수정 Zigmond 챔버의 다이어그램이다. 측정은 적당한 개인 환경 설정을 일치하기 위해 조정할 수 있습니다.

보충 프로토콜 : 수정일 Zigmond 상공 회의소의 제작

아래의 프로토콜에 대한 참고 자료로 4 그림 참조하십시오 :

  1. 16분의 3 "두께의 광택 아크릴 (4.45 mm 실제 두께)의 시트를 구입하십시오.
  2. 테이블을 사용하여보고에 대형 챔버 공백을 잘라33.25 mm X 64.57 mm의 거친 크기. 이 가공 3.175 mm 추가 자료를 수 있습니다.
  3. 바이스에 챔버 빈을 설정합니다. 30.07 mm X 61.39 mm : 밀링 머신 및 6.35 mm (1 / 4 ") 엔드 밀 비트, 마무리 가공 정확한 크기로 챔버의 측면이 있습니다.
  4. 밀링 머신에 챔버를 비워 놓고 x와 가장자리 찾기와 Y 축 모두 함께 빈의 중심을 찾으 한 후 중앙 위치를 제로.
  5. 상단 표면에 엔드 밀 비트를 터치하면 챔버 높이 (Z 축)을 취득하고 높이를 제로.
  6. 3.91 mm (0.154 ") 엔드 밀 비트를 사용하여 첫 번째 저수지의 X-축 (긍정적 인 방향)을 따라 비트 3.03 mm 오프셋. 2.84 mm의 깊이에 챔버로 가공을 시작 완벽한 저수지에 반대 (음수) 방향으로 "(7.62 mm 0.300)로 통과 한 후 7.62 mm (0.300)"로 y 축 (긍정적 인 방향)을 따라 이동하면서 15.24 mm (0.600 ")의 길이입니다. 오프셋X-축 (부정적인 방향)을 따라 3.03 mm (0.119 ")에 비트와 두 번째 저수지에 대해 동일한 과정을 반복합니다.
  7. 의 가장자리에있는 챔버를 놓고 실험하는 동안 미디어를로드하는 챔버의 측면에 저수지의 끝을 연결하는 각 저수지 (4 총)의 말에 1.09 mm (인치 0.043) 드릴 비트를 사용하여 구멍을 뚫는다.
  8. 어떤 화학 오염 물질을 제거하는 데 도움 따뜻한 비눗물에 잘 챔버를 적시 게.
  9. 모든 비누를 제거 두 번 증류수에 잘 챔버를 적시하고 헹굼. 방은 이제 위에서 설명한대로 사용할 수 있습니다.

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Discussion

트렁크 NCCs에 chemotaxis 조사를 실시하는 것은 이유 시리즈 도전 입증되었습니다. 따라서 트렁크 NCCs은 트렁크 수준 NT의 주 explantation에서 구할 수해야하며 간선 NCCs는 교양 장기 경우 차별화 이기종 줄기 세포 인구를 구성합니다. 체외에서 homogenously 배포 세포 인구의 chemotactic 응답을 공부하는 종래의 방법은 먼저 세포가 고립과 chemotaxis 챔버 (예를 들어, Boyden 챔버 12)의 replated homogenously 아르해야하기 때문에 트렁크 NCCs에서 테스트하기가 어렵습니다. 국세청 수십 explantation은 단 한 실험에 대한 충분한 트렁크 NCCs의 균일 한 분포를 생성해야 할 수 있으므로 충분한 NCCs을 분리하는 것은 지루한 수 있습니다. 또한, NCCs는 해제되지 혼합하고, homogenously 자연 맥락에서 재배포 않습니다. 따라서, 특정 종래의 chemotaxis의 assays을 수행하기 위해 replated 아르 NCCs가 작동 할 수 있습니다매우 다르게 철새 행동에 관해서 생체 조건에서의.

여기, 우리는 더 자연스러운 맥락에서 트렁크 NCC chemotaxis을 평가하기위한 수정 방법을 설명합니다. 동질 배포하지 않고 트렁크 NCCs의 chemotactic 응답을 평가하는 주요 과제는 타고난 이기종 정체성뿐만 아니라 원래 explant 문화에서 NCCs의 강한 고유의 극성입니다. 예를 들어, 트렁크 NCCs는 NT에서 (거리) 주로 수직 마이그레이션하는 경향이 때 문화 13인치 다양한 요소 explant 문화에서 영향을 트렁크 NCC 극성은 결론적으로 chemotactant 기울기에 의해 유도 세포 극성의 변화를 파악하기가 어렵습니다 너무 강력 할 수있다. 다른 철새 parame을 모니터링하면서 새로운 수정 Zigmond 분석을 사용하여이, 문화, chemotactant 그라디언트에 의해 유도 변경 사항을 explant에 내재 된 자연 세포 극성을 구별 할 수 있습니다 이러한 지속성과 속도로 감마선. 우리는 explanted 트렁크 NCC 문화의 각 테두리가 직면 각도가 크게 경계에서 첨단 트렁크 NCCs의 고유 방향성을 결정하는 것을 관찰했다. NCC 문화의 국경 북쪽에 직면하는 경우 예를 들어, 해당 국경에서 NCCs의 평균 방향은 북쪽으로 것입니다. 우리 수정 검정들은 적용 chemotactant 기울기 (그림 2A)에 상대적으로 마이그레이션있는 NCC 테두리의 각도를 표준화하여 첨단 NCCs의 고유 방향성으로 인한 변화를 최소화합니다. 항상 적용 그라디언트에 해당 바로 NCC 테두리 수직을 배치 한 후 해당 국경에 첨단 세포의 마이그레이션을 추적, 트렁크 NCC 문화의 상대적으로 직선 경계에 첨단 NCCs를 선택하면, 하나는 변화를 감지 할 수 있습니다 그렇지 않으면 들키지 않고 갈거야 chemotactant 소스의 방향이나 거리에 트렁크 NCCs의 평균 방향성 인치

다음 다닐 ">는 위의 프로토콜에서 파생 된 많은 혜택을 요약 한 것입니다 :

  1. 이 라이브 세포 이주를 추적 할 수있는 기능을 제공합니다.
  2. 수정 Zigmond 챔버는 형광 분자 (그림 3)과 시각화 할 수있는 상대적으로 정의 그라디언트를 생성 할 수 있습니다.
  3. Zigmond 챔버는 이전에 다른 10,14에 기술 된 표준 Boyden 분석의 특정 제한하지 마십시오.
  4. 우리 수정 Zigmond 챔버는 매우 낮은 비용 (자료 재사용 챔버 당 미만 1 달러로 추정됩니다)에서 집에서 만들 수 있습니다.
  5. 신경 튜브가 coverslips에 배양하고 나중에 석유 젤리로 봉인되어 있기 때문에, 하나는 쉽게 미래를 적용 그라디언트를 기준으로 문화의 방향을 선택할 수 있습니다.
  6. Trypsinization 또는 셀 해주세요가 필요하지 않습니다.
  7. NT의 isolations 만 작은 금액이 필요합니다.
  8. NCC 문화는 때 세포보다 생체에있는 트렁크 NCCs의 배포에 더 유사합니다해제와 동질 배포 replated 있습니다.

이러한 장점은 가능성이 다른 세포 유형의 유사 기본 explant 문화에 적용, 따라서, 이러한 방식은 다른 explanted 줄기 세포의 자연 철새 행동의 평가에 사용하기 위해 폭 넓은 적합성이있을 수 있습니다.

수정 Zigmond 챔버 분석의 이점이 많은 있지만, 어떤 제한이 없습니다. 표준 Zigmond 챔버의 단점은 이미 과거의 연구자 14 일까지 논의되었습니다. 우리 수정 Zigmond 분석 중 하나 한계는 CS를 장착하고 각 저수지의 구멍을 연결해을위한 석유 젤리를 사용하는 것입니다. 석유 젤리 한 유연성을 허용에 정확하게 방향 NCC의 chemotactant 기울기에 상대적으로 문화,하지만 CS 및 적용 그라디언트 14 변화를 일으킬 수있는 다리 사이의 거리의 변화로 연결됩니다. 또한, 장착CS, 석유 젤리와 챔버를 밀폐는 종종 함정 다리 14 전체 흐름을 소량으로 이어지는 압축 수있는 챔버에서 공기의 작은 주머니를. 이러한 흐름은 잠재적으로 어떤 실험을하는 동안 분자 기울기를 방해 한 검색 결과의 증가 다양성으로 이어질 수 있습니다. 이 가능하지만 공기 주머니를 다리의 끝 (거리에 형광 강도를 측정 한 지역에서) 방향으로 참석했다하더라도 반면, 알렉사 형석 488 IgM 공액 (그림 3)를 사용하여 시각화하면 심한 기울기 중단은 관찰되지 않았습니다 . 따라서, 심지어 잠재적 인 알렉사 형석 488 IgM 기울기를 중단 수 조건 하에서, 기울기는 (가까운 다리의 중간까지) 측정 다리의 영역에서 손상되지 않았습니다. 하나는 매우 안정적이고 예측 가능한 모두있는 장기 기울기를 요구하는 경우, 다음이 검정 가능성이 충분하지 않습니다. 그러나, 이러한 정밀도는 종종 필요하며 다른 비교하지 않습니다일반적인 chemotaxis의 assays (예 : chemotactant-불린 구슬을 사용하여 Boyden assays 또는 특정 assays 등), 그라디언트 더 안정적이고 예측이 될 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgements

우리는이 방법의 개발 기간 동안 기술 지원 리노 김, 스티브 구즈만과 Ujit Satyarthi에 특별한 감사를드립니다. 마이런 호손, 리차드 Spengel, 그리고 로베르토 로자 스 여기에 사용 된 방을 가공하고 꼭 필요한 기술 지원을 제공했습니다. 특히, 로베르토 로자 스는 그림 4를 만들었습니다. 우리는 또한 위의 chemotaxis 분석의 발전에 이전 스콧 프레이저 귀중한 조언 감사합니다. 이 작품은 부분적으로 NIH-MBRS 평가 점수 - 5S06GM048680-13 MEdB에 의해 CW의 CSU, 왕국 대학원 논문 지원 프로그램에서 수상에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Omega Scientific DM-22
Penicillin Streptomycin Solution Omega Scientific PS-20 100X Stock Concentration
L-Glutamine Omega Scientific GS-60 100X Stock Concentration
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-11 Lot# 105247 (or another that is comparable)
Modified Zigmond chamber Home made N/A Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol
Cell culture dish Denville T6040 40 x 10 mm
Fibronectin BD 354008 10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM
Coverslips Fisher 12-548-B Precleaned; 22 x 22 mm
L15 medium Thermo Scientific SH30525.02
Petroleum Jelly Comforts 011110794642 100%
Centrifuge tube Biologix 10-9152 15 ml
Dispase Cell Systems 4Z0-850 10X Stock Concentration
Syringe BD 309602 1 ml
Needle BD 305127 25 G x 1.5 in.
Alexa Fluor 488-IgM Invitrogen A21042 Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM
Dissecting Forceps FST Misc. Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium
Tungsten Needle N/A N/A Home made; placed in a pin holder
Blunt Forceps Tiemann 160-18 Used for transferring embryos to Ringer's from egg yolk

Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber

Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:

  1. Purchase a sheet of 3/16" thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
  2. Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
  3. Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4") end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
  4. Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
  5. Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
  6. Using a 3.91 mm (0.154") end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300") and then traverse to 7.62 mm (0.300") in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600"). Offset the bit to 3.03 mm (0.119") along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
  7. Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
  8. Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
  9. Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.

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References

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