تعيين تباين التعبير البروتين في الأورام باستخدام المناعي الكمي

Medicine
 

Summary

نحن هنا وصف طريقة لقياس التباين الجزيئية في المقاطع النسيجية من المواد السرطانية باستخدام كمية المناعي ، وتحليل الصور ، والإحصائي لقياس عدم التجانس. ويهدف الأسلوب لاستخدامها في تطوير العلامات البيولوجية السريرية والتحليل.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Faratian, D., Christiansen, J., Gustavson, M., Jones, C., Scott, C., Um, I., Harrison, D. J. Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (56), e3334, doi:10.3791/3334 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. إعداد الأنسجة

  1. Microtomy
    1. القسم البارافين الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من كتل الورم في سماكة 4 ميكرون باستخدام مشراح الدوارة.
    2. وضع المقاطع على الشرائح المجهرية موجبة الشحنة.
    3. احتضان الشرائح في الفرن 37 درجة مئوية خلال الليل.
  2. تخزين
    1. أبواب مخزن في -18 درجة مئوية إلى -25 درجة مئوية الثلاجة ، وذلك لمنع فقدان استضداد.

2. المناعي للأقسام الأنسجة

  1. وDewaxing الإمهاء
    1. Dewax الشرائح في الزيلين مرتين لمدة 5 دقائق.
    2. ترطيب الشرائح في 99 ٪ ، 99 ٪ ، 80 ٪ ، 50 ٪ من الايثانول والمياه الجارية للاستفادة من كل دقيقة 2 بالترتيب.
  2. مستضد استرجاع
    1. نفذ استرجاع الحرارة الناجمة مستضد ، وذلك باستخدام 0.15 ملي سترات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 6.0 عازلة في طنجرة الضغط لمدة 5 دقائق في ميلcrowave.
    2. يبرد لمدة 20 دقيقة الشرائح.
    3. شطف الشرائح في PBST 0.05 ٪ لمدة 5 دقائق على الكرسي الهزاز.
  3. حظر إجراء
    1. علاج المقاطع في بيروكسيد الهيدروجين 3 ٪ لمدة 10 دقيقة.
    2. شطف الشرائح في PBST 0.05 ٪ لمدة 5 دقائق على الكرسي الهزاز.
    3. إضافة إلى أقسام رف Immunostaining Sequenza.
    4. علاج المقاطع في مصل البروتين كتلة مجانا لمدة 10 دقيقة.
  4. الأجسام المضادة الأولية الحضانة
    1. احتضان الضد الابتدائية المخفف لتخفيف الأمثل في جسم داكو مخفف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    2. في شطف 0.05 ٪ PBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  5. الظهارية القناع (Cytokeratin) حضانة
    1. احتضان الماوس المضادة للعموم cytokeratin ، 01:50 مخففة في جسم داكو مخفف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  6. الظهارية قناع التصور
    1. يعد التخفيف 1:25 من الماعز المضادة للماوس Alexa555 قالأضداد econdary في مرحلة ما قبل المخففة تصور الماعز الأرنب حل الضد HRP. احتضان الشرائح في الظلام لمدة ساعة في 1.5 درجة حرارة الغرفة.
    2. في شطف 0.05 ٪ PBST ثلاث مرات ل5min لكل منهما.
  7. هدف التصور
    1. نقل الشرائح من Sequenza إلى غرفة الرطوبة.
    2. الجمع بين مخفف الهدف تضخيم الإشارة (E HistoRx الحوض) وTyramide Cy5 (F HistoRx أنبوب) فى الساعة 1:50 التركيز. دوامة لمزيج دقيق. احتضان الشرائح في الظلام لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. في شطف 0.05 ٪ PBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    4. يذوى الشرائح في الايثانول 80 ٪ لمدة 1 دقيقة.
    5. الشرائح الهواء الجاف في الظلام.
  8. وCounterstaining coverslipping
    1. تطبيق دابي المتوسطة المتزايدة على coverslips ووضع coverslips أكثر المقاطع الأنسجة.
    2. الجافة الشرائح بين عشية وضحاها في الظلام.
    3. بعد أن جفت الشرائح ، وآمنة مع طلاء الأظافر لENبالتأكيد الحفاظ على المدى الطويل والاحتفاظ بها في الثلاجة 4 درجة مئوية.

3. التقاط الصور باستخدام المسح المقطع كله

  1. تحميل ما يصل الى خمس شرائح في الكاسيت الشريحة من الماسح الضوئي ScanScope Aperio الشريحة فلوريدا.
  2. لكل شريحة ، حدد المنطقة عامة لصورة باستخدام واجهة في وحدة تحكم ScanScope. تحديد المنطقة لتشمل جميع الأنسجة على الشريحة ، بغض النظر عن نمط تلطيخ أو جوانب أخرى يمكن ملاحظتها من العينة.
  3. باستخدام وحدة التحكم ScanScope ، لكل قناة (دابي ، وCy3 Cy5) تحديد التعرض الأمثل على النحو التالي :
    1. تحديد منطقة من الأنسجة لاستجواب -- هذا المجال ، ينبغي من الناحية المثالية ، أن تكون في المنطقة من أنسجة الورم لتقديم أفضل تمثيل.
    2. باستخدام autoexposure ScanScope ميزة وحدة التحكم ، وتقييم التعرض الوقت المقترحة لكل قناة ، جنبا إلى جنب مع تركيز الصورة.
    3. أكثر من تكرار ما يصل الى 3-5 مناطق كل عينة على التعاونnfirm استقرار القيمة.
  4. حدد منطقة إضافية (كما هو موضح من قبل الماس الأزرق على صورة وحدة ScanScope) بعيدا من الأنسجة ، وحتى الآن لا يزال داخل المنطقة coverslipped الشريحة ، لتعريف المنطقة الخلفية ، حيث سيتم الحصول على شقة تصحيح الصور حقل لكل مرشح.
  5. استعراض هذه الصور قبل الحصول على الصور. إذا كانت الصور تظهر لديها خلفية عالية أو التحف صورة أخرى ، يجب أن يتم نقل صورة المنطقة والحصول على الصور الجديدة.
  6. يتم تحميلها على الحصول على الصور الرقمية الشريحة تلقائيا في قاعدة بيانات الطيف Aperio.

4. AQUA تحليل الصور الآلي

  1. عرض الصور الرقمية الشريحة كلها في قاعدة بيانات الطيف الترددي وتعليم الورم المناطق ذات الأهمية في سياق نسيج كامل ونمط تلطيخ (ق).
  2. حدد الشريحة لتحليل باستخدام AQUAnalysis من القائمة الشريحة الرقمية في قاعدة بيانات الطيف بالنقر المزدوج الإبهاممسمار صورة (بدلا من ذلك ، حدد خانة الاختيار بجانب الصورة ، ثم حدد "عرض الصور" من القائمة في أعلى القائمة). هذا البرنامج يفتح تلقائيا ImageScope وصورة ملونة مدمجة من عينة الأنسجة.
  3. استخدام هذا البرنامج للتنقل الصورة باستخدام الأدوات المتوفرة.
  4. باستخدام المرافق H & E (سواء المادية أو الشريحة صورة المشروح) ، تعليم المنطقة ذات الاهتمام على الصورة الفلورية. مناطق متعددة من الفائدة ، وحلقت الفردية المجالات ، يمكن تحديد على عينة واحدة. هناك أيضا "السلبي" الذي هو أداة تستخدم لاستبعاد مناطق ضمن المنطقة المحددة (أي الأنسجة التالفة ، ومجالات الأنسجة الفقراء ، وغير السرطانية المناطق ، والحطام ، الخ).
  5. حفظ طبقة الشرح (صور) في الصورة.
  6. عودة إلى القائمة الرئيسية الطيف وحدد خانة الاختيار بجانب الصورة التي تم المشروح فقط. اختر "تحليل" من الشريط القائمة في أعلى القائمة.
  7. في إطار التحليل الذي سوف يأتي ، سيليط "تحليل AQUA HistoRx" من القائمة المنسدلة.
  8. إذا كان هناك طبقات متعددة من الشروح ، واستخدام خانات الاختيار لتحديد طبقة المناسب (ق) للتحليل.
  9. اضغط على "تحليل" الزر عندما تصبح جاهزة للبدء.
  10. عند هذه النقطة ، وإطار وحدة تحكم مصغر يظهر في شريط مهام Windows. هذا وسوف يعرض التقدم المحرز في نقل الصور من قاعدة البيانات الطيف بجهاز الكمبيوتر المحلي ("الجذب" العملية).
  11. حالما يتم نقل البيانات ، سوف AQUAnalysis الاطلاق. يمكن للمستخدم ثم استخدام جميع الوظائف الداخلية للبرنامج لعرض والتنقل وتحليل الصور.
  12. يتم تقسيم المنطقة مشروحة للصورة من قاعدة بيانات الطيف في صورة 512x512 بكسل البلاط -- كل من احرز التي سيتم بشكل فردي.
  13. لهذه الدراسة ، تم استخدام سجل اكوا غير خاضعة للرقابة الخوارزمية ، استنادا إلى تجميع البيانات ، 8. في هذه الخوارزمية ، يتم إنشاء عشرات AQUA على النحو التالي :
    1. صورة الاشتراكية لعموم cytokeratinهو thresholded gnal أعلاه الخلفية وتستخدم تلك بكسل لتحديد وجود ورم "القناع" الذي يستخدم بعد ذلك لإجراء العمليات الحسابية لاحقا. التعبير عالية عموم cytokeratin بكسل أيضا تحديد المناطق هيولي / غير النووية للخلايا السرطانية.
    2. ويتم تحديد بكسل مع اشارة عالية في القناة التي تقع ضمن دابي قناع الورم النووي كما في الطبيعة.
    3. الخوارزمية تجميع يدرس أيضا بكسل التي كثافة منخفضة لتلطيخ دابي أو التعبير cytokeratin ومحاولات السمة جزئيا لهم إما المقصورات النووية أو حشوية أو الخلفية.
    4. ثم تحسب مرة واحدة يتم تعيين كل خلية واحدة من المقصورات الخلفية أو ورم ، وشدة الإشارة من البروتين المستهدفة (ER أو HER2) داخل كل من المقصورات وتطبيع لحجم المقصورات ، وبالتالي إنتاج عشرات AQUA.
    5. لم احرز الصور التي لم يكن لديهم ما يكفي من التمثيل الورم (على النحو المحدد من قبل أولئك مع جنيهSS من 5 ٪ من الورم يمثل بكسل). هذه المناطق تنتج أيضا قيمة "النتيجة النهائية" ودعا "فشل" وبالتالي يمكن إزالتها في التحليلات الإحصائية اللاحقة.
    6. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان لدى استعراض ، عامل تحديد المجالات التي لم تكن مناسبة لتسجيل نتيجة العينة أو التحف التصوير (مثل مطوية الأنسجة ، والحطام) ، حجبت هذه الحقول من التسجيل وأصدر "النتيجة النهائية" ودعا "فشل".
  14. نتائج التهديف AQUA هي الجداول عشرات المرتبطة بكل 512x512 بكسل البلاط في المنطقة ذات الاهتمام ضمن عينة الأنسجة الفرع بأكمله. هذه الملفات ، في تنسيق CSV. ، يمكن عندئذ أن تستخدم لأغراض التحليل الإحصائي لاحقة.

5. الإحصائية التحليل : يتم تنفيذ كافة التحليلات الإحصائية SPSS في (IBM)

  1. حيثما أمكن ذلك ، لعمليات كبيرة ، وتوليد ملفات SPSS رمز بناء الجملة (SPS) لتأدية معالجات البيانات وخطوات التحليل. يتم توفير المثال رمز بناء الجملة كملفات التكميلية.
  2. حيث يملك المناطق "النتيجة النهائية" من "فشل" (انظر أعلاه) ، وعلامة هذه القيم كما SYSMIS ، الذي يزيل عليها من التحليلات العددية.
  3. تجميع كافة البيانات لكافة الشرائح لكل علامة (ER أو HER2) في بيانات مجموعة رئيسية واحدة في شكل SPSS. استخدام هذا الملف الرئيسي لكافة العمليات الحسابية لاحقا.
  4. استخدام ملف بناء الجملة SPSS (واحد لكل علامة : ER أو HER2 (انظر الملفات الجملة التكميلية) والتحقق من صحة البيانات وكذلك مؤشرات سمبسون التنوع تحسب على النحو التالي :
    1. إنشاء الملف الرئيسي التحليلية ، من أجل منع تعديل البيانات الرئيسية ولدت مجموعة من قبل.
    2. التحقق من صحة البيانات الرئيسية ضد مجموعة البيانات الخام والصور المولدة.
    3. إنتاج إحصاءات موجزة لعشرات AQUA لكل عينة (عدد من المجالات ، يعني درجة ، درجة وسيطة ، minimuم درجة ، الدرجة القصوى ، والانحراف المعياري لدرجات العينة).
    4. فحص عينة عشوائية من النتائج ضد الأصلي الخام الناتج الملفات والبيانات على بيانات الصورة الخام وسجل.
  5. لتوليد الحرارة خريطة الصور (كما هو موضح في الشكلين 2 و 3) :
    1. 'بن' درجة AQUA البيانات (باستخدام وظيفة "Binning المرئي" في SPSS) في ثمانية مستويات فردية. لائحة ، واستخدمت عشرات النووية ، لHER2 ، استخدمت عشرات هيولي.
    2. تستمد صناديق من هذا القبيل أن كل بن تمثل نسبة متساوية من الحالات المتاحة من مجموعة البيانات بالكامل.
    3. استخدام 'ملف سبليت' الدالة SPSS حتى يتسنى لجميع المخرجات اللاحقة ستكون على مستوى "عينة لكل شريحة /'.
    4. مؤامرة كل منطقة (المقابلة للبلاطة 512x512) بواسطة x لها ، الإحداثيات y واللون مع قيمة المقابلة لبن إلى أنه خصص منها (انظر الشكلين 2 و 3).
  6. لتوليد درجات التجانس ، وكتب لإنشاء رمز لسيمبسونمؤشر التنوع به عشرات AQUA.
    1. يتم تعريف مؤشر سمبسون التنوع ، كما هو مستخدم هنا ، على النحو التالي :
      المعادلة 1
      حيث N هو العدد الكلي للدرجات / الحقول المستخدمة لعينة معينة وn هو عدد الدرجات / الحقول في مجموعة معينة من درجات قياسية (المنتجة كما هو موضح أدناه).
  7. استخدام الملف الرئيسي التحليلية الموصوفة أعلاه لمصدر البيانات. في الأمثلة المبينة ، وتستخدم جميع الحسابات ER النتيجة AQUA النووية وHER2 الحسابات المستخدمة النتيجة AQUA هيولي. أداء العمليات الحسابية المذكورة أدناه لكل عينة / الشريحة.
  8. منذ البيانات الاستشعاع عرضة لعدم الاستقرار الفرق ، مثل خطأ بهذا الحجم مع شدة النشر ، وتطبيق لوغاريتمي (القاعدة 2) لجميع الدرجات التطبيع AQUA.
  9. تحويل مزيد من تطبيع (سجل تتحول) الى عشرات البيانات ض (قياسي).
    1. ويحسب هذا التحول Z - يسجلق يلي : Z = (AQUA نتائج -- متوسط ​​جميع الدرجات للعينة) / الانحراف المعياري لدرجات العينة. هذا يترجم توزيع الدرجات في توزيع الانحرافات حول القيمة المركزية للانحراف صفر.
  10. بن لهذه القيم Z - يسجل في ست مجموعات (<-2 ، -2 -- -1 ، -1 -- 0 ، 0-1 ، 1-2 ،> 2).
  11. حساب عدد القيم المخصصة في كل لادن ومبلغا عن كل حاوية. استخدام هذه القيمة ، إلى جانب عدد من المجالات ، لحساب قيمة لكل من صناديق الستة المستخدمة للمؤشر.
  12. مجموع هذه القيم وطرح من واحد لإنتاج مؤشر التنوع.
  13. مؤشر التنوع يوفر مؤشرا على انتشار عشرات حول الوسط لعينة معينة. وهكذا ، وارتفاع مؤشرات تدل على أوسع انتشار عشرات ، أو زيادة التباين في التعبير. على العكس ، وانخفاض مؤشرات تشير إلى درجة أقل من التباين في قياس التعبير والتعبير متجانسة في العينة. ويتضح هذا في Figurوفاق 2 و 3.

6. ممثل النتائج :

العلاج المستهدفة مع وكلاء سمية منخفضة نسبيا ، مثل عقار تاموكسيفين و تراستوزوماب ، لا مستوى الرعاية لمرضى سرطان المبيض. هناك أدلة قوية على ان البلاتين التاكسين الكيميائي الخط الأول متفوقة على غيرها من نظم العلاج الكيميائي لسرطان المبيض 13/09 ، وعلى الرغم من 70-80 ٪ من المرضى يستجيبون في البداية ، ومعظم سوف الانتكاس ويموتون من المرض. وقياس المؤشرات الحيوية التي يمكن التنبؤ بها ردا على العلاجات البديلة أن تكون مفيدة في تحديد العلاج الفردي لكل مريض ، ومنذ اختيار العلاج الكيميائي يمارس الضغط على الورم ، والخلايا السرطانية على قيد الحياة قد تكون لديهم خصائص مختلفة ، وتمثل subpopulation الورم قبل العلاج ، هذا التحديد الكمي قد يكون من المفيد تغيير. طبقنا نهجنا خرائط عدم تجانس في التعبير وER HER2 في عينات سرطان المبيض قبل وبعد العلاج الكيميائي ، في أورديr لقياس التغيرات الكمية في التعبير ، وتقييم العلاقة بين التعبير العلامات البيولوجية قبل وبعد العلاج. كلا ER HER2 تثبت عدم التجانس وضعت داخل الأورام الفردية ، وفي بعض الأورام ، والتغييرات مؤشر سمبسون بعد العلاج من مستويات مرتفعة نسبيا لعدم تجانس التباين المنخفض ، ويمثلها انخفاض مؤشر عشرات سمبسون (أنظر الشكلين 2 و 3). هذا يدعم الفكرة القائلة بأن اختيار نسيلي يحدث في الاستجابة للعلاج الكيميائي السامة للخلايا ، والأهم من ذلك ، قد يمكن استغلال هذا باستخدام العلاج الموجه ضد السكان المتبقية ، من أجل تخصيص أفضل العلاج لمرضى السرطان.

الشكل 1
الشكل 1. الهيماتوكسيلين ويوزين photomicrographs الملون من مناطق مختلفة من سرطان المبيض نفسه تبين التشكل متغير. (أ) صورة مجهرية X40 يظهر اثنين من المناطق المتاخمة للورم مع اختلاف التشكل. ينظر إلى الطاقة العالية (X200) تكشف خلايا حشوية مع المقاصة ونمط صلبة للنمو في الجزء العلوي من الورم (B) ، في حين أن الجزء السفلي من الأنسجة (C) وأكثر تجانسا السيتوبلازم اليوزيني ونمط النمو حليمي. ، فإن هذا الورم بيد أن تصنف على أنها نوع فرعي المصلي النسيجي حليمي لأغراض إدارة أخرى.

الشكل 2
الشكل 2. heatmaps تباين في التعبير عن بروتين ER cytokeratin إيجابية المبيض الأنسجة السرطانية ، وذلك قبل (اللوحة العليا) وبعد (اللوحة السفلى) العلاج.

الشكل 3
الشكل 3. heatmaps تجانس بروتين HER2 في التعبير cytokeratin إيجابية المبيض الأنسجة السرطانية ، وذلك قبل (اللوحة العليا) وبعد العلاج (اللوحة السفلى).

Discussion

وصف الأسلوب هنا تصاريح الكمي للتغايرية الجزيئية في الفورمالين القياسية الثابتة أقسام البارافين جزءا لا يتجزأ ، من مواد نسيجية الورم. الأسلوب يسمح القيمة التي سيتم تعيينها لدرجة التجانس في قسم الأنسجة ، بحيث يمكن بعد هذا أن تؤخذ بعين الاعتبار كمتغير في تنمية العلامات البيولوجية وتحليلها. بينما في العام فمن الأفضل أن المؤشرات الحيوية الأنسجة متجانسة فيما يتعلق التعبير ، بحيث يكون الفحص أقل عرضة للخطأ المعاينة أو التحيز ، قد يكون في بعض الظروف أن تكون مفيدة لقياس التباين كمعلمة. على سبيل المثال ، كما هو مبين في المثال التوضيحي لائحة وHER2 ، تظهر المؤشرات الحيوية المشتركة تجانس كبير من التعبير و هو الآن غير معروف ما إذا كان هذا يمثل عاملا مستقلا النذير أو التنبؤية فيما يتعلق بنتائج سريرية أو الاستجابة للعلاج ، على التوالي. وبالمثل ، كما يتضح ، ربما يغير العلاج نفسه حيويقد السكان المكونة للخلايا ، وبالتالي قياس تخصيب الهدف مفيدا في توجيه قرارات العلاج.

ومع ذلك ، يقتصر هذا الأسلوب من قبل نفس العوامل التي تحد من التحليلات التقليدية النسجية أو العلامات البيولوجية (مثل المناعى). قد تكون النتيجة تعتمد على نوع وحجم ونوعية الأنسجة التي يجري تحليلها ، وبالتالي قسم الأنسجة واحدة لا تكون ممثلة للورم بالكامل. في الواقع ، قد يكون مؤشر سمبسون منحازة على نحو غير ملائم من حيث الحجم من الأنسجة (عدد الإطارات الملتقطة وقياس درجات اكوا). قد استمناع من الحواتم يجري قياسه يخضع لعوامل لا يمكن السيطرة عليها قبل التحليلية التي تغير artifactually التعبير عنها عبر قسم الأنسجة (مثل وقت نقص التروية الباردة ، أو طول التثبيت ، وحافة قطعة أثرية). هذا في حد ذاته مشكلة بالنسبة الحواتم ، الفوسفات ، والتي تشتهر عطوب 14 و 15. ولذلك قد تكون في وضع أفضل تقنيةعلى العينات بدلا من استئصال الخزعات صغيرة وأجريت على مقاطع متعددة بدلا من واحدة فقط. في نهاية المطاف ، قد 3D تقنيات التصوير فرصة لتحديد أفضل هذه المعلمة.

ويمكن أيضا هذه التقنية على النحو تكون محدودة بسبب العوامل البيولوجية ، مثل التغير في التعبير عن cytokeratin حاتمة اخفاء. هذا قد يكون مصدر قلق خاص في تلك السرطانات ، بما في ذلك المبيض وسرطان الثدي ، والتي تخضع لالظهارية إلى الوسيطة الانتقالية (EMT) أو غير المخصب لالظهارية المكونات أو الخلايا الجذعية 16 ، كما تم مؤخرا أظهرت أن يحدث في العلاج الكيماوي علاج سرطان المبيض في المختبر 17 عاما ، ولدى مرضى سرطان الثدي في الاستجابة للعلاج 18. ويمكن التغلب على هذا القيد باستخدام الأجسام المضادة اخفاء البديلة (أو خليط من الأضداد) ، مثل cytokeratin vimentin زائد ، وهو upregulated في EMT 16. بالإضافة إلى ذلك ، منذ غيرها من مكونات النسيج (هيئة التصنيع العسكريكما roenvironment) ، مثل الخلايا الليفية أو خلايا بطانة الأوعية الدموية على نحو متزايد هدفا للعلاجات البيولوجية ، يمكن أيضا هذه التقنية يمكن أن تتسع لدرجة أن هذه المكونات ، وذلك باستخدام أقنعة محددة لمقصورات في المصالح ، مثل PECAM / CD31 إلى وصمة عار للخلايا بطانة الأوعية الدموية .

على الرغم من استخدام تكييف مؤشر سمبسون كمقياس لعدم تجانس في البروتوكول الحالي نظرا لبساطتها ، يمكن أن تستخدم تدابير أخرى من عدم التجانس ، مثل قياسات بسيطة النزعة المركزية (المتوسط ​​، التباين ، متوسط ​​، الخ). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل حسابات مؤشر سمبسون لتتناسب مع أفضل مجموعة من السكان اختبار معينة. استخدام التحولات - Z درجة تسمح للتسجيل لتكون أكثر قابلية للتطبيق لعلامات متعددة منذ يستند إلى الاختلاف في الانحراف نحو الوسط لمجموعة البيانات. ومع ذلك ، يمكن أن تكون محدودة النطاق الإجمالي للتسجيل في هذا النوع من التحول. قد يكون بعض التصاميم تكون في وضع أفضلبن لمجرد عشرات AQUA الفعلية لجميع العينات من مجموعة علامة خاصة. اختيار عدد من صناديق والانقطاع هو أيضا قيد في مجموعة من القيم التي يمكن أن تؤدي ويمكن أن يكون الأمثل للتصاميم التجريبية البديلة.

وقد استخدمنا ER وHER2 في الدراسة الحالية والمؤشرات الحيوية مرشح ، حيث تستخدم فعلا في العيادة ، تساعد الإجابة عن الأسئلة ذات الصلة فيما يتعلق السريرية لفعالية العلاجات المستهدفة ، ومن المعروف أن تظهر التباين الكبير والتغيير في مجال التعليم الابتدائي والبعيد مرض 19. ومع ذلك ، علامة الأمثل للتجانس ما زال يتعين تحديدها. قد تشمل الاحتمالات الأخرى علامات خلوي من قابلية التنسيل ، مثل تلك التي استخدمت سابقا في دراسات الطور البيني السمكية 20. النهج يتطلب التحقق من صحة كبيرة كذلك في الأفواج والسريرية مشروحة بشكل جيد أو تجارب سريرية من أجل إقامة مزيد من أهمية هذه المعلمة في بيولوجيا السرطان.

Disclosures

JC ، MG ، CJ ، وخدمات العملاء وموظفي HistoRx ، وشركة

Acknowledgments

وأيد هذا العمل في جزء من التمويل المقدم من المجلس الاسكتلندي (عدد المنح HR07005 ؛ http://www.sfc.ac.uk/ ) ، البحوث الطبية اسكتلندا ( http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ) ، والسرطان أبحاث السرطان التجريبية في المملكة المتحدة مركز الطب ( http://www.cancerresearchuk.org/ ) ، واختراق سرطان الثدي ( http://breakthrough.org.uk/ ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ScanScope FL Aperio Technologies ScanScope FL Used as equipped from vendor
Spectrum Aperio Technologies Spectrum Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure.
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment HistoRx V2.3 The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum.
HER2 Dako A0485 1 in 400 dilution
mouse anti-pan cytokeratin Dako M3515 1 in 50 dilution
Antibody diluent Dako S0809
Envision goat-rabbit HRP Dako K4003
Protein block Dako X0909
Goat anti-mouse Alexa555 Invitrogen A21422
DAPI mounting medium Invitrogen P36931
Cy5 Tyramide HistoRx AQ-EMR1-00001
Sequenza Immunostaining Center Thermo Fisher Scientific, Inc. 73300001 Used here for bench-top immunofluorescence staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution. Histopathology. 58, 486-497 (2011).
  2. Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
  3. Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution. Histopathology. 58, 486-497 (2011).
  4. Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
  5. Liu, J., Lau, S. K., Varma, V. A. Molecular mapping of tumor heterogeneity on clinical tissue specimens with multiplexed quantum dots. ACS Nano. 4, 2755-2765 (2010).
  6. Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nat. Med. 8, 1323-1327 (2002).
  7. Simpson, E. H. Measurement of biodiversity. Nature. 163, 688-68 (1949).
  8. Gustavson, M. D., Bourke-Martin, B., Reilly, D. M. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated Quantitative Analysis. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 17, 329-337 (2009).
  9. Paclitaxel plus carboplatin versus standard chemotherapy with either single-agent carboplatin or cyclophosphamide, doxorubicin, and cisplatin in women with ovarian cancer: the ICON3 randomised trial. Lancet. 360, 505-515 (2002).
  10. McGuire, W. P., Hoskins, W. J., Brady, M. F. Cyclophosphamide and cisplatin compared with paclitaxel and cisplatin in patients with stage III and stage IV ovarian cancer. N. Engl. J. Med. 334, 1-6 (1996).
  11. Muggia, F. M., Braly, P. S., Brady, M. F. Phase III randomized study of cisplatin versus paclitaxel versus cisplatin and paclitaxel in patients with suboptimal stage III or IV ovarian cancer: a gynecologic oncology group study. J. Clin. Oncol. 18, 106-115 (2000).
  12. Piccart, M. J., Bertelsen, K., James, K. Randomized intergroup trial of cisplatin-paclitaxel versus cisplatin-cyclophosphamide in women with advanced epithelial ovarian cancer: three-year results. J. Natl. Cancer. Inst. 92, 699-708 (2000).
  13. Cannistra, S. A. Cancer of the ovary. N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).
  14. Baker, A. F., Dragovich, T., Ihle, N. T. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer. Res. 11, 4338-4340 (2005).
  15. Espina, V., Edmiston, K. H., Heiby, M. A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process. Mol. Cell. Proteomics. 7, 1998-2018 (2008).
  16. Klymkowsky, M. W., Savagner, P. Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe. Am. J. Pathol. 174, 1588-1593 (2009).
  17. Kurrey, N. K., Jalgaonkar, S. P., Joglekar, A. V. Snail and slug mediate radioresistance and chemoresistance by antagonizing p53-mediated apoptosis and acquiring a stem-like phenotype in ovarian cancer cells. Stem. Cells. 27, 2059-2068 (2009).
  18. Creighton, C. J., Li, X., Landis, M. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13820-13825 (2009).
  19. Aitken, S. J., Thomas, J. S., Langdon, S. P., Harrison, D. J., Faratian, D. Quantitative analysis of changes in ER, PR and HER2 expression in primary breast cancer and paired nodal metastases. Ann. Oncol. 21, 1254-1261 (2010).
  20. Sayagues, J. M., Abad, M. M., Melchor, H. B. Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis. J. Pathol. 221, 308-319 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics