LightSwitch luciferase परख 3'UTR संवाददाता constructs और एक microRNA का उपयोग कर प्रणाली के साथ मानव microRNAs की पहचान लक्ष्य पक्षपाती कक्ष में नकल

Biology
 

Summary

MicroRNAs (miRNAs) जीन अभिव्यक्ति की महत्वपूर्ण नियामकों हैं और कई जैविक प्रक्रियाओं में एक भूमिका निभा दिखाया गया है. बेहतर miRNA-UTR बातचीत को समझने के लिए, हम 3 UTR luciferase संवाददाताओं के एक संग्रह जीनोम चौड़ा एक उपन्यास luciferase जीन और परख अभिकर्मक, LightSwitch प्रणाली के साथ जोड़ा बनाया है.

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Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (55), e3343, doi:10.3791/3343 (2011).

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Abstract

MicroRNAs (miRNAs) जीन अभिव्यक्ति की महत्वपूर्ण नियामकों हैं और कई जैविक प्रक्रियाओं में एक भूमिका निभा. 700 से अधिक मानव miRNAs प्रत्येक अद्वितीय लक्ष्य mRNAs की सैकड़ों होने के साथ किया गया है अभी तक पहचान की. कम्प्यूटेशनल उपकरण, अभिव्यक्ति प्रोटिओमिक्स और assays, और chromatin immunoprecipitation - आधारित तकनीकों mRNAs है कि एक विशेष miRNA के प्रत्यक्ष लक्ष्य कर रहे हैं की पहचान के लिए महत्वपूर्ण सुराग प्रदान करते हैं. इसके अलावा, 3'UTR संवाददाता assays गहन miRNA लक्ष्य के अध्ययन के एक महत्वपूर्ण घटक बन गए हैं क्योंकि वे के लिए कार्यात्मक सबूत उपलब्ध कराने और एक सेल आधारित प्रणाली में विशिष्ट miRNA 3'UTR बातचीत के प्रभाव quantitate. लाभ उठाने 3'UTR संवाददाता assays के लिए और अधिक शोधकर्ताओं सक्षम और उच्च throughput स्तर तक ऐसे assays के पैमाने अप समर्थन है, हम अत्यधिक अनुकूलित LightSwitch luciferase में एक मानव 3'UTR luciferase पत्रकारों के एक संग्रह जीनोम चौड़ा बनाया है परख प्रणाली. इस प्रणाली को भी सकारात्मक नियंत्रण, विभिन्न अंतर्जात 3'UTR संवाददाता constructs, और मानकीकृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला के रूप में उपयोग के लिए सिंथेटिक miRNA लक्ष्य संवाददाता constructs शामिल हैं.

यहाँ हम एक miRNA नकल है कि कुशल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और उच्च throughput विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी है के साथ व्यक्तिगत 3'UTR संवाददाता constructs के सह अभिकर्मक के लिए एक विधि का वर्णन.

Protocol

परिचय

MicroRNAs जीन अभिव्यक्ति की महत्वपूर्ण नियामकों कि कई महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं के गतिविधि मिलाना के रूप में उभरा है. साथ 700 से अधिक मानव miRNAs 1 अभी तक पहचान, यह आश्चर्य की बात है कि परिवर्तन और miRNAs की अनुचित विनियमन जैसे कैंसर और हृदय रोग 2,3 शारीरिक विकारों की एक किस्म से जोड़ा गया है नहीं है. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि miRNA विनियामक बाध्यकारी साइटों के बहुमत 3'UTRs 4,5 में पाया जाता है, और कुछ शोधकर्ताओं का अनुमान है कि वहाँ miRNA लक्ष्य के प्रति 6 सेल में सैकड़ों रहे हैं. MiRNAs की जैविक महत्व को देखते हुए, miRNAs कि मौजूद हैं और उनमें से प्रत्येक के लिए लक्ष्य की बड़ी संख्या की एक बड़ी संख्या है, यह महत्वपूर्ण है कि शोधकर्ताओं को मज़बूती से miRNAs की उच्च throughput अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी प्लेटफार्मों पर अधिमानतः अंतर्जात लक्ष्य की पहचान करने में सक्षम हैं है.

जबकि miRBase, TargetScan, और PicTar 1,6,7 जैसे कम्प्यूटेशनल उपकरण का उपयोग किसी भी miRNA के लिए ख्यात mRNA लक्ष्य की सूची उत्पन्न करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है, भविष्यवाणियों अभी तक काफी सटीक 8 अकेले पर भरोसा किया जा नहीं कर रहे हैं. इसलिए, शोधकर्ताओं ने यह भी प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के एक नंबर का लाभ उठाने के लिए लक्ष्य डी Novo की पहचान या भविष्यवाणी लक्ष्य को मान्य है. कई टीमों स्थिर राज्य mRNA या प्रोटीन के स्तर की उच्च throughput उपायों पर भरोसा करने के लिए जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों जिसके लिए जब miRNA गतिविधि है 4,9,10 परेशान की पहचान. इस तरह के बदलाव निस्संदेह जैविक सार्थक कर रहे हैं और एक महत्वपूर्ण पहला कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन समग्र अभिव्यक्ति में परिवर्तन को मापने के एक प्रतिलेख और अप्रत्यक्ष या नीचे की ओर संकेत प्रभाव पर एक miRNA के प्रत्यक्ष प्रभाव के बीच भेद नहीं करता नहीं है. अन्य शक्तिशाली उपकरण है कि प्रत्यक्ष miRNA mRNA बातचीत के लिए सबूत प्रदान chromatin immunoprecipitation (चिप) रणनीति है कि पार से लिंक miRNAs और mRNAs Argonaute प्रोटीन (और इस प्रकार RISC जटिल), हालांकि बातचीत भागीदारों की पहचान तुरंत कार्यात्मक प्रभाव संकेत नहीं करता है इस तरह के एक बाध्यकारी 5,11 घटना की. इस प्रकार, 3'UTR संवाददाता assays है कि एक विशेष UTR पर एक miRNA के प्रभाव के लिए कार्यात्मक सबूत उपलब्ध कराने के एक पूरी तरह से miRNA अध्ययन का एक महत्वपूर्ण घटक बन गए हैं. इस तरह के सेल आधारित परख कम्प्यूटेशनल लक्ष्य भविष्यवाणियों या अभिव्यक्ति और प्रोटिओमिक्स डेटा के साथ एक साथ लिया डेटा मजबूत सबूत है कि एक विशेष 3'UTR सीधे ब्याज की miRNA द्वारा विनियमित है प्रदान करता है.

एक 3'UTR - रिपोर्टर परख में, ब्याज की एक जीन से 3'UTR luciferase रिपोर्टर जीन के अंत करने के लिए जुड़े हुए है. यदि 3'UTR एक miRNA का एक लक्ष्य है, रिपोर्टर प्रतिलेख स्थिरता और / या इसके अनुवाद दक्षता कार्यात्मक miRNA एकाग्रता में भिन्नता के साथ बदल जाएगा. तो प्रतिलेख केवल आधारित assays के विपरीत, संवाददाता assays के दोनों स्थिर राज्य mRNA और प्रोटीन के स्तर पर प्रभाव की पहचान करने में मदद. रिपोर्टर सिस्टम भी एक 3'UTR में एक ख्यात miRNA बाध्यकारी साइट mutagenizing पुष्टि करते हैं कि यह वास्तव में interaction8 के लिए आवश्यक है की कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. और जब बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति सरणियाँ, प्रोटिओमिक्स तकनीक, और Argonaute चिप का उपयोग करते हुए अध्ययन प्रयोगात्मक शर्तों के सेल आधारित रिपोर्टर assays की एक छोटी संख्या के लिए मूल्यवान जीनोम चौड़ा डेटा प्रदान करते हैं सबसे miRNA-3 के अध्ययन के लिए स्केलिंग अप करने के लिए उत्तरदायी हैं ' के रूप में शर्तों के सैकड़ों या हजारों में UTR बातचीत छोटे अणुओं या अन्य लायब्रेरी आधारित effectors के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक हो सकता है.

कई वैज्ञानिकों miRNA-3'UTR बातचीत के अध्ययन के लिए रिपोर्टर परख प्रौद्योगिकी लागू है. हालांकि, विचार है कि कई अलग अलग टेप के प्रत्येक लक्ष्य सैकड़ों miRNAs, यह शोधकर्ताओं के लिए मुश्किल हो गया है उच्च throughput पैमाने पर इस शक्तिशाली दृष्टिकोण का उपयोग के साथ अलग से हजारों बनाने के लिए क्लोनिंग, मान्यता, और अनुकूलन कदम है क्योंकि 3'UTR रिपोर्टर वैक्टर अक्सर लागत अधिक बैठती हैं. छोटे और बड़े पैमाने पर 3'UTR रिपोर्टर किसी भी शोधकर्ता के लिए सुलभ अध्ययन करने के प्रयास में, हम एक मानव 3'UTRs पूर्व अत्यधिक अनुकूलित LightSwitch luciferase परख प्रणाली में क्लोन के एक संग्रह जीनोम चौड़ा बनाया है. संवाददाता प्रणाली को भी मान्य नियंत्रण वैक्टर, सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल के लिए 700 से अधिक सिंथेटिक miRNA लक्ष्य संवाददाता constructs का एक सेट है, और मानकीकृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला शामिल है.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, आप पूछ सकते हैं कि क्या एक विशेष मानव 3'UTR ब्याज की अपने miRNA का एक लक्ष्य है. इस वर्कफ़्लो में महत्वपूर्ण कदम प्रयोगात्मक डिजाइन, संवाददाता constructs और miRNA mimics के अभिकर्मक, luciferase संवाददाता assays, और डेटा विश्लेषण कर रहे हैं. प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए, यह महत्वपूर्ण है सोच समझकर एक transfectable सेल लाइन, प्रयोगात्मक और नियंत्रण संवाददाता constructs, और miRNA mimics और गैर - लक्ष्यीकरण नियंत्रण का चयन करें. आम अत्यधिक transfectable ADHHT1080, HepG2 तरह erent सेल लाइनों, HCT-116, Hela, 293, और दूसरों को अक्सर इस प्रोटोकॉल के साथ अच्छी तरह से काम.

प्रयोगात्मक डिजाइन पर महत्वपूर्ण नोट्स

LightSwitch luciferase परख प्रणाली पूरी तरह से अनुकूलित संवाददाता प्रणाली है कि GoClone RenSP luciferase जीन और LightSwitch luciferase परख अभिकर्मकों उपयोग constructs शामिल है. LightSwitch के रूप में इष्टतम संवाददाता परख परिणाम प्राप्त करने की सिफारिश की प्रणाली के सभी घटकों का उपयोग करें.

Switchgear GoClone संवाददाता constructs के साथ किसी भी oligos / plasmids के सह - अभिकर्मक एक गैर विशिष्ट तरीके में समग्र luciferase संकेतों को कम कर देता है. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है निम्नलिखित अभिकर्मक संयोजन प्रदर्शन: संवाददाता केवल + संवाददाता गैर लक्ष्यीकरण नियंत्रण miRNA, और रिपोर्टर + विशिष्ट miRNA.

हमारे empty_3UTR सदिश (मजबूत प्रमोटर, कोई UTR) luciferase संकेत के एक बहुत ही उच्च स्तर प्रदान करता है और अभिकर्मक दक्षता के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, और एक कृत्रिम miRNA लक्ष्य संवाददाता वेक्टर नकल गतिविधि के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकता है. इसके अतिरिक्त, हम सही अनुक्रम विशिष्ट बनाम गैर विशिष्ट प्रभाव को अलग करने के लिए GoClone 3'UTR गृह व्यवस्था नियंत्रण और यादृच्छिक नियंत्रण का उपयोग करने की सलाह देते हैं.

अध्ययन अपने प्रोटोकॉल और जब भी संभव बनाने मास्टर करने के लिए अपने डेटा में pipetting त्रुटि या वाष्पीकरण के कारण परिवर्तनशीलता में कमी घोला जा सकता है है.

इस प्रोटोकॉल DharmaFect डुओ अभिकर्मक अभिकर्मक (Dharmacon) का उपयोग करता है.

दिवस 1

महत्वपूर्ण सुझाव: अपने सेल लाइन बुद्धिमानी से चुनें. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, एक सेल लाइन है कि transfectable हो जाता है का उपयोग करें. हम यह भी पाया है कि 3 'UTR रिपोर्टर के औसत दर्जे का एक miRNA के जवाब की नकल है कि विशेष रूप से miRNA के उच्च अंतर्जात स्तर के साथ सेल लाइनों में तनु है. यदि आप कितना miRNA अपने सेल लाइन व्यक्त नहीं पता है, SGG सिंथेटिक microRNA लक्ष्य है जो अप्रत्यक्ष रूप से एक के रूप में अच्छी तरह के रूप में सेल आप अपने परख के गतिशील रेंज के रूप में बताए में एक विशेष miRNA की बहुतायत के उपाय करने की कोशिश.

1. बीज कोशिकाओं अभिकर्मक के समय में ≥ 80% संगम उपज के लिए.

  1. एक 96 - अच्छी तरह से 100μl कुल मात्रा में सफेद टीसी थाली में बीज कोशिकाओं.
  2. समानांतर बीज, में संगम के आकलन के लिए एक स्पष्ट 96 अच्छी तरह से थाली में कक्षों की उपयुक्त संख्या.

महत्वपूर्ण 1 सुझाव: संगम प्रयोग नकल में अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. इष्टतम पछाड़ना के लिए, कोशिकाओं को 100% अभिकर्मक के समय पर मिला हुआ होना चाहिए.

महत्वपूर्ण दो सुझाव: सर्वोत्तम परिणामों के लिए कम बीतने कोशिकाओं का उपयोग करें. कक्ष भी कई बार passaged गया है शोर अभिकर्मक डेटा उपज होते हैं.

2 दिन

GoClonereporter constructs और miRNAs तैयार है, तो सहधारा कोशिकाओं में transfect.

2. Constructs तैयार

  1. पिघलना कमरे के तापमान पर GoClone constructs (प्लास्मिड डीएनए). अच्छी तरह से मिलाएं.
  2. टोपी से संक्षेपण हटाने अपकेंद्रित्र.

3. माइक्रो RNAs तैयार

  1. कमरे के तापमान और टोपी से संक्षेपण हटायें अपकेंद्रित्र पिघलना microRNAs (विशिष्ट mimics और गैर लक्ष्यीकरण - नियंत्रण).
  2. RNase मुक्त पानी में 2 सुक्ष्ममापी की एकाग्रता एक काम के लिए पतला.

एक प्रयोगात्मक miRNA अलावा हमेशा एक miRNA गैर लक्ष्यीकरण नियंत्रण शामिल नकल. सह transfecting एक प्लाज्मिड और एक छोटे आरएनए oligo प्लाज्मिड अकेले transfecting से कम संकेत करने के लिए होता है.

एक या एक से अधिक सकारात्मक नियंत्रण शामिल है. SGG सूची में सिंथेटिक miRNA लक्ष्य संवाददाता वैक्टर के सैकड़ों का उपयोग पर विचार करें.

एक या एक से अधिक नकारात्मक या गैर विशिष्ट नियंत्रण शामिल है. SGG गृह व्यवस्था जीन, यादृच्छिक टुकड़े और / या खाली नियंत्रण (कोई UTR डालने) की 3 UTRs सहित नियंत्रण की एक श्रृंखला है. एक या एक से अधिक एक प्रयोगात्मक निर्माण के साथ - साथ इन नियंत्रणों के उपयोग से आप किसी भी गैर विशिष्ट अपने विशिष्ट miRNA या गैर लक्ष्यीकरण नियंत्रण की overexpression करने के लिए attributable प्रभाव के लिए मानक के अनुसार करने की अनुमति देगा.

4. Transfections तैयार

  1. प्रत्येक अभिकर्मक के लिए एक एकल परख के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों गठबंधन:

एक मिश्रण

व्यक्तिगत GoClone संवाददाता: 3.33 μL
microRNA: * भिन्न
सीरम मुक्त मीडिया: 10 μL

* MiRNA के प्रभावी एकाग्रता 10 एनएम 100 एनएम से भिन्न हो सकते हैं. उपयुक्त एकाग्रता के लिए miRNA निर्माता से परामर्श करें.

महत्वपूर्ण सुझाव: बहुत अधिक जोड़ने की नकल मत करो. नकल सांद्रता के लिए एक उचित श्रृंखला में अंतिम 100uL प्रतिक्रिया में 10-50 एनएम है.

कम से कम तीन प्रतिकृति प्रदर्शनप्रत्येक उपचार / UTR संयोजन के लिए ते transfections और त्रुटि pipetting के लिए अनुमति देने के लिए अतिरिक्त मात्रा में शामिल हैं.

उदाहरण के लिए, 3.5 से प्रतिक्रिया एकल संस्करणों गुणा 3 को दोहराने के अभिकर्मक कुओं के लिए पर्याप्त अभिकर्मक त्रुटि या वाष्पीकरण pipetting के लिए अतिरिक्त सहित मिश्रण.

प्रत्येक रिपोर्टर के लिए, सेट निम्नलिखित के लिए प्रतिकृति: संवाददाता केवल + संवाददाता गैर लक्ष्यीकरण नियंत्रण miRNA और रिपोर्टर + विशिष्ट miRNA.

एक गैर - लक्ष्यीकरण नियंत्रण के लिए उन लोगों के रूप में एक ही समय में लक्ष्यीकरण microRNA के लिए transfections सेट.

  1. अप करें DharmaFECT जोड़ी मिश्रण (Dharmacon) के रूप में प्रत्येक अभिकर्मक के लिए इस प्रकार है:

2 मिश्रण

DharmaFect डुओ: 0.15 μL
सीरम मुक्त मीडिया: 9.85 μL

DharmaFECT डुओ की राशि के लिए जोड़ा जा सेल निर्भर लाइन किया जा सकता है.

उपर्युक्त मात्रा HT1080 कोशिकाओं के लिए उपयुक्त हैं.

निर्माता प्रलेखन से परामर्श करने के लिए अपने सेल लाइन के लिए उपयुक्त राशि का निर्धारण.

युक्ति: ऊपर मात्रा पत्रकारों की संख्या से गुणा करके एक बड़े अभिकर्मक मिश्रण बनाओ, की संख्या replicates और miRNAs की संख्या में परीक्षण किया . जब अभिकर्मक मिश्रण की राशि के लिए तैयार की गणना, एक छोटे से अतिरिक्त राशि के लिए त्रुटियों और वाष्पीकरण pipetting के लिए खाते में शामिल करने के लिए सुनिश्चित हो.

  1. DharmaFECT डुओ मिश्रण कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं अनुमति दें.
  2. 5 मिनट के बाद, 10uL प्लाज्मिड और या miRNA (1 मिश्रण) / प्रत्येक तैयार ट्यूब DharmaFECT डुओ मिश्रण (2 मिश्रण) के 10μL जोड़ने. प्रत्येक ट्यूब को दोहराने के अभिकर्मक प्रति 20μL तो एक मात्रा में शामिल करना चाहिए.
  3. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए प्रत्येक मिश्रण सेते हैं.
  4. 20 मिनट के बाद, को दोहराने के अभिकर्मक के 100μL प्रति एक कुल के लिए प्रत्येक ट्यूब पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस), को दोहराने के प्रति एंटीबायोटिक मुक्त, पूरा मीडिया के 80 μL जोड़ें. गहरी अच्छी तरह से एक ब्लॉक के कई replicates और नमूने एक साथ तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा हल मिक्स.
  5. इनक्यूबेटर से वरीय थाली निकालें. सत्यापित करें कि कोशिकाओं को कम से कम 80% सहधारा हैं.
  6. प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया बंद ध्यान pipet.
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से अभिकर्मक मिश्रण (20uL डीएनए / अभिकर्मक मिश्रण + 80uL मीडिया) के 100μL जोड़ें.
  8. इनक्यूबेटर में प्लेस रातोंरात थाली.

पर-सेते नहीं करो. अधिकांश mimics सदाशयी ठिकानों पर 24 घंटे के भीतर महत्वपूर्ण परिणाम का उत्पादन होगा. 48 घंटे में औसत दर्जे का दमन का स्तर अधिक हो सकता है, लेकिन इतनी अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता के लिए अच्छी तरह से.

नकल प्रयोगों अवरोध करनेवाला प्रयोगों की तुलना में आसान कर रहे हैं. जबकि सबसे mimics 24 घंटे के भीतर काफी सही लक्ष्य, दबाने होगा de-दमन महत्वपूर्ण अवरोध करनेवाला करने के लिए attributable 48 घंटे लेने के लिए औसत दर्जे का हो सकता है और लगभग हमेशा कम नकल के प्रभाव से स्पष्ट हो जाएगा.

3 दिन

नोट: luciferase assays के तुरंत आयोजित किया जा सकता है या प्लेटें -80 में जमे हुए किया जा सकता डिग्री सेल्सियस (आम तौर पर ठंड सेल lysis और luciferase संकेत बढ़ जाती है). रुक और सर्वोत्तम परिणामों के लिए परख करने की क्रिया से पहले अपनी कोशिकाओं का पिघलना.

याद LightSwitch परख अभिकर्मक जोड़ने से पहले कमरे के तापमान पर जमी कोशिकाओं पिघलना चलो.

5. उपाय LightSwitch AssayReagents के साथ luciferase गतिविधि

  1. इनक्यूबेटर से थाली निकालें और कमरे के तापमान पर लाने के लिए.
  2. LightSwitch परख अभिकर्मकों (LS010 किट के लिए, अन्य किट आकार के प्रोटोकॉल ऑनलाइन पाया जा सकता है) तैयार करें:
    1. Reconstitute lyophilized परख सब्सट्रेट की ट्यूब के लिए सॉल्वेंट सब्सट्रेट के 100μL जोड़कर 100X सब्सट्रेट प्रकाश से रक्षा और कमरे के तापमान पर समय को कम से कम. 100X सब्सट्रेट 2 - 3weeks के लिए-20C पर भंडारित किया जा सकता है . सर्वोत्तम परिणामों के लिए, हौसले पुनर्गठन सब्सट्रेट का उपयोग करें.
    2. कमरे के तापमान पानी के स्नान में परख बफर के 10ml बोतल विगलन द्वारा परख समाधान तैयार है और पुनर्गठन 100X सब्सट्रेट के 100μL पहले जोड़ उपयोग करने के लिए. अच्छी तरह से मिलाएं.
  3. एक चैनल बहु pipettor का उपयोग करने के लिए सीधे एक अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से एक सफेद प्लेट में नमूना (100uL कोशिकाओं + मीडिया वाले) 100μL LightSwitch परख समाधान (+ बफर सब्सट्रेट) जोड़ने के. यदि कोशिकाओं दूसरे की थाली या फ्लास्क स्वरूप, हस्तांतरण नमूने में बड़े हो रहे थे 100μL कुल मात्रा (मीडिया या पीबीएस) में एक सफेद 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए.
  4. प्लेट कवर, प्रकाश से रक्षा, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं, यदि एक से अधिक थाली परख करने की क्रिया परख समाधान के अलावा ताकि प्रत्येक प्लेट पढ़ने से पहले 30 मिनट के लिए incubates डगमगाते..
  5. एक थाली lumi में 2 सेकंड के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से पढ़ेंnometer (SpectraMax एल या समकक्ष).
  6. नियंत्रण गैर लक्ष्यीकरण (luminescence = विशिष्ट miRNA / नियंत्रण गैर लक्ष्यीकरण) पर विशिष्ट miRNA के लिए प्रत्येक निर्माण के लिए luciferase संकेत अनुपात की गणना के द्वारा पछाड़ना की गणना. गृह व्यवस्था, यादृच्छिक, और खाली constructs से डेटा का उपयोग करने के लिए गैर UTR विशिष्ट उपचार के प्रभाव के लिए नियंत्रण.

प्रतिनिधि परिणाम

लक्ष्यीकरण miRNA की उपस्थिति में लक्ष्य 3'UTR luciferase पछाड़ना दिखा.

जाने 7a द्वारा 3'UTR luciferase संवाददाता गतिविधि पछाड़ना HT1080 कोशिकाओं में प्रत्येक रिपोर्टर के सह transfecting 100ng द्वारा मापा गया था 20nm जाने 7a नियंत्रण नकल या गैर - लक्ष्यीकरण के साथ निर्माण, 24 घंटे के लिए incubating, तो luminescent संवाददाता पढ़ने LightSwitch luciferase परख अभिकर्मकों का उपयोग संकेत.

चित्रा 1
चित्रा 1. Punc और ARID3B मानव 3'UTRs चलो - 7a microRNA के लक्ष्य कर रहे हैं मानव 3'UTR संवाददाताओं से Punc और ARID3B जीन के लिए सिग्नल. 7a microRNA जाने की उपस्थिति में काफी नीचे गिरा दिया नकल जबकि हाउसकीपिंग और यादृच्छिक अनुक्रम के लिए संकेत नहीं UTRs कर रहे हैं.

Discussion

हम पूर्व क्लोन मानव 3'UTR संवाददाता constructs की एक जीनोम चौड़ा संग्रह miRNA-3'UTR बातचीत के अध्ययन के लिए जीवित कोशिकाओं में सक्षम बनाया है. यहाँ हम सह - transfecting 3'UTR पत्रकारों के साथ miRNA mimics एक luciferase संवाददाता प्रणाली का उपयोग कर के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उच्च throughput विधि से पता चला है.

इस विधि शोधकर्ताओं ने एक सेल अत्यधिक transfectable लाइन का उपयोग कर और एक overexpression तकनीक के साथ miRNA गतिविधि perturbing पर निर्भर करता है. खराब transfectable सेल लाइनों का उपयोग शोधकर्ताओं हमारे साथी lentiviral 3'UTR संवाददाता सिग्मा (मिशन 3'UTR Lenti GoClones) के साथ संयोजन के रूप में बनाया संग्रह का उपयोग पर विचार कर सकते हैं. MiRNA के साथ कोशिकाओं के इलाज overexpression प्रकार एक प्रयोग में परिणाम mimics, और ऐसे किसी भी अध्ययन के साथ, शोधकर्ताओं खाते में ले कि यह प्रतिनिधित्व करते हैं या वास्तविक शारीरिक स्थितियों हो सकता है नहीं होना चाहिए. Overexpression चिंताओं को दूर करने के लिए, शोधकर्ताओं ने mimics के लिए इसके अलावा में miRNA inhibitors का उपयोग 12-14 गड़बड़ी की दो अलग अलग प्रकार के साथ बातचीत का अध्ययन कर सकते हैं.

एक बार की संभावना miRNA लक्ष्य की पहचान कर रहे हैं, शोधकर्ताओं के लिए ख्यात miRNA बाध्यकारी साइटों mutagenize के लिए तय है कि साइटों कार्यात्मक बातचीत के लिए आवश्यक हैं इच्छा हो सकती है. वे भी अलग संभावित लक्ष्य UTRs (Boutz) के सैकड़ों परीक्षण पैमाने पर करना चाहते हो सकता है. इसके अलावा, अगर शोधकर्ताओं चाहे miRNA प्रतिलेख स्थिरता या अनुवाद दक्षता प्रभावित हो रहा है के रूप में रुचि रखते हैं, luciferase संवाददाता डेटा स्थिर राज्य प्रतिलेख स्तर के उपाय करने के लिए तुलना में किया जा सकता है. Luciferase संकेत में कोई परिवर्तन है कि प्रतिलेख के स्तर में एक आनुपातिक परिवर्तन के साथ जुड़ा नहीं है अनुवाद की क्षमता पर कोई प्रभाव को इंगित करेंगे. अंत में, शोधकर्ताओं ने संवाददाता वैक्टर एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र बनाने के लिए उपयोग करने के लिए miRNA 14 एकाग्रता में परिवर्तन करने के लिए अलग UTRs के रिश्तेदार संवेदनशीलता की तुलना कर सकते हैं.

Disclosures

लेखकों switchgear जीनोमिक्स जो उपकरण और अभिकर्मकों इस लेख में प्रदर्शित होने के कर्मचारी हैं. इस लेख का उत्पादन switchgear जीनोमिक्स द्वारा प्रायोजित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
White Tissue Culture Plates (96-well solid bottom) VWR international 82050-736
Clear Tissue Culture Plates (96-well) with lid VWR international 353072
LightSwitch Luciferase Assay Reagent SwitchGear LS010
DharmaFECT Duo Transfection Reagent (0.75mL) Dharmacon T-2010-02
Foil Plate Sealing Tape E&K Scientific T592100
Breathable Plate Sealing Tape E&K Scientific T896100-S
Plate Luminometer Molecular Devices SpectraMax L

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References

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