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मल्टीप्लेक्स परिसर नैदानिक ​​और पर्यावरण Oligonucleotide मिलकर प्रतिदीप्त microspheres का उपयोग कर नमूने में बैक्टीरिया की जांच

Immunology and Infection

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Summary

हम oligonucleotide मिलकर फ्लोरोसेंट मनकों का उपयोग कर एक नमूना के भीतर सूक्ष्मजीवों का पता लगाने के के लिए एक मल्टीप्लेक्स विधि का वर्णन. एक नमूना के भीतर सभी जीवों से Amplicon जांच युग्मित मोती के एक पैनल को संकरित है. एक Luminex या जैव Plex साधन मनका प्रकार और संकरण संकेत के लिए प्रत्येक मनका क्वेरी के लिए प्रयोग किया जाता है.

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Dumonceaux, T. J., Town, J. R., Hill, J. E., Chaban, B. L., Hemmingsen, S. M. Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres. J. Vis. Exp. (56), e3344, doi:10.3791/3344 (2011).

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Abstract

Protocol

इस विधि Dumonceaux एट अल की रिपोर्ट में अनुसंधान के क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया था. जे क्लीन. Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

समग्र प्रक्रिया चित्रण एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में प्रस्तुत किया है.

1. मनका युग्मन

यह polystyrene Luminex मोती के लिए oligonucleotide जांच युग्मन (तालिका 2 देखें) के लिए इस्तेमाल किया जा तरीकों का वर्णन करता है. खंड थोड़ा नए कब्जा जांच के मूल्यांकन के लिए अनुकूलित कर रहे हैं एक परीक्षण के आधार पर, इन संस्करणों कोष्ठकों में संकेत कर रहे हैं.

  1. -20 डिग्री सेल्सियस dessicator से 1-एथिल-3 (3 dimethylamiopropyl) carbodiimide एचसीएल पाउडर (EDC) निकालें और यह कमरे के तापमान पर गर्म.
  2. 20 सेकंड के लिए एक waterbath sonicator में sonciation से microspheres Resuspend, तो लगभग 20 सेकंड vortexing.
  3. Eppendorf ट्यूब स्थानांतरण microspheres की 400 μl (100 μl) (6 5x10 या 1.25x मेल खातीMicrospheres 10 6). Luminex कम प्रोटीन बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूब (जैसे Eppendorf प्रोटीन LoBind ट्यूबों, सूची संख्या 0030 108.094) का उपयोग करने के लिए ट्यूबों के लिए चिपके हुए हैं और मनका वसूली के साथ हस्तक्षेप से uncoupled मोती को रोकने के पता चलता है. हम यह मानक polypropylene microcentrifuge ट्यूबों, (जैसे VWR सूची संख्या 87003-298) जो हम आम तौर पर इस्तेमाल का उपयोग करने में कोई समस्या हो नहीं पाया है.
  4. 1 मिनट के लिए 14000 XG पर गोली. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  5. (एन morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस) में पीएच 4.5 50 μl में microspheres (12.5 μl) कमरे के तापमान 2 एम 0.1 के Resuspend.
  6. EDC के 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर पानी में ताजा समाधान तैयार करें.
    1. EDC की एक विश्लेषणात्मक पैमाने पर 5-10 मिलीग्राम वजन द्वारा तैयार इस समाधान के कम से कम 1 मिलीलीटर, तो 10 मिलीग्राम / एमएल पानी जोड़ने.
  7. 5'-C12 संशोधित अमीनो कब्जा microspheres (तालिका 2) oligonucleotide और vortexing द्वारा मिश्रण का 1 nmol जोड़ें. 1 nmol 200 सुक्ष्ममापी oligo के 5 μl हैnucleotide.
  8. Microspheres और मिश्रण करने के लिए 5 सेकंड के लिए vortexing द्वारा ताजा EDC के समाधान के 2.5 μl जोड़ें.
  9. अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  10. EDC समाधान (1.6 कदम) त्यागें और पानी में ऊपर (1.6 कदम) के रूप में 10 मिलीग्राम / एमएल EDC की एक ताजा नमूना तैयार.
  11. Microspheres और 5 सेकंड के लिए भंवर ताजा EDC समाधान का एक और 2.5 μl जोड़ें.
  12. अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  13. 0.02% बीच 20 के 1 मिलीलीटर जोड़कर मोती धो लें. (वैकल्पिक रूप से 20 सेकंड के लिए के रूप में अच्छी तरह से sonicate) भंवर मोती resuspend.
  14. 14000 XG 1 मिनट अपकेंद्रित्र. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  15. 0.1% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के 1 मिलीलीटर जोड़कर मोती फिर से धो. (वैकल्पिक रूप से 20 सेकंड के लिए के रूप में अच्छी तरह से sonicate) भंवर मोती resuspend.
  16. 14000 XG 1 मिनट अपकेंद्रित्र. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  17. Tris - EDTA के 100 (25 μl) μl बफर (ते) [10 मीटर में मोती Resuspendएम Tris सीएल पीएच 8.0, 1 मिमी EDTA, पीएच 8.0].
  18. शेयर एकाग्रता का निर्धारण एक रुधिरकोशिकामापी या कल्टर काउंटर में मोतियों की गणना करें.
  19. 100 मनकों / ते बफर में μl के अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक मनका गिराए द्वारा एक Microsphere मास्टर मिक्स तैयार. पूल परख की वांछित plex (10-plex परख के लिए उदाहरण के लिए, प्रत्येक मनका के 100/μl के अंतिम एकाग्रता में 10 अलग अलग मिलकर मोती मिश्रण) करने के लिए इसी मोती युग्मित.
  20. 4 में Microsphere मास्टर मिक्स स्टोर ° C अंधेरे में. मिश्रण महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है अगर इन शर्तों के अधीन रखा है.

2. Chaperonin सार्वभौमिक 60 (cpn60 यूटी) amplicon उत्पादन और एकल किस्में के उत्पादन लक्ष्य.

  1. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन प्रत्येक नमूना के लिए उत्पाद (पीसीआर) उत्पन्न करता है. Phosphorothioate और बायोटिन संशोधित 5 'प्राइमर सेट (1 टेबल) शामिल करें. मात्रा में मिश्रण और सांद्रता के लिए 3 टेबल देखें.
  2. पीसीआर के तुरंत बाद पूरा हो गया है, T7 पूर्व के 2 μl (20 इकाइयों) जोड़नेप्रत्येक पीसीआर ट्यूब (पीसीआर बफर T7 प्रतिक्रिया के लिए पर्याप्त होगा) onuclease. कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया सेते (~ 22-25 डिग्री सेल्सियस) 40 मिनट के लिए.
  3. इस ऊष्मायन के अंत में, 0.5 एम ethylene के 12.5 μl जोड़ने tetraacetic एसिड (EDTA) पीएच 8.0 और मिश्रण diamine. यह ~ एकल असहाय पीसीआर उत्पाद के 64.5μl की कुल देता है.

3. Oligonucleotide युग्मित polystyrene मोती के लिए एकल असहाय पीसीआर उत्पाद के संकरण.

  1. Prewarm से 60 के विश्लेषण के दौरान संकरण तापमान बनाए रखने के साधन ° सी. मंच साधन सॉफ्टवेयर का उपयोग हीटर पर मुड़ें और पीतल हीटिंग ब्लॉक कि पीसीआर शैली थाली संकरित मनका मिश्रण होता है फिट बैठता है का उपयोग सुनिश्चित करें.
  2. Resuspend Microsphere मास्टर एक विंदुक के साथ मिक्स (1.20 कदम), एक Eppendorf ट्यूब में एक उचित मात्रा में बांटना, ट्यूब टोपी, और 2 मिनट के लिए एक waterbath sonicator में sonicate. वैकल्पिक रूप से, मनका resuspe में पूर्ण स्थिरता सुनिश्चित करने के लिएnsion, microsphere मास्टर मिश्रण vortexing और pipetting, तो इसके बाद के संस्करण के रूप में sonication द्वारा resuspended किया जा सकता है, तो एक polypropylene Eppendorf ट्यूब में वांछित राशि वितरण.
  3. एक कम प्रोफ़ाइल 96 अच्छी तरह Thermowell पीसीआर प्लेट (तालिका 2) के उपयुक्त कुओं में एकल असहाय पीसीआर उत्पाद के 17 μl (2.2 कदम) बग़ैर. Resuspended, sonciated मनका मिश्रण के 33 μl प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें. सिलिकॉन कवर (तालिका 2) के साथ कवर और धीरे से नल.
  4. Thermocycler के एक कार्यक्रम के साथ थाली में रख: 95 ° 5, 10 मिनट के लिए न्यूनतम 60 डिग्री सेंटीग्रेड के लिए सी 60 ° पकड़ सी, 5 मिनट के लिए 60 ° सी, अंत. प्रोग्राम प्रारंभ करें.
  5. (SA-पीई) streptavidin phycoerythrin समाधान ताजा, आप अच्छी तरह से 25 प्रति μl की जरूरत है (कई कुओं अतिरिक्त बनाने). 0.1% Sarkosyl, 50 मिमी Tris - एचसीएल, 8.0 पीएच (1 ​​मिलीग्राम / एमएल) SA पीई 1:50 करने के लिए 20 / 1x tetramethylammonium क्लोराइड (TMAC) बफर (3 एम TMAC साथ μg मिलीलीटर शेयर गिराए SA पीई समाधान 4 मिमी EDTA, पीएच 8.0).
  6. जब thermocycler 60 डिग्री सेल्सियस पकड़ कदम हो जाता हैढक्कन खोलने, हटाने सिलिकॉन कवर और एसए पीई समाधान एक अच्छी तरह से सीधे जोड़ने (thermocycler के बाहर नहीं ले प्लेट). सिलिकॉन कवर बदलें, thermocycler ढक्कन बंद करें और कार्यक्रम फिर से शुरू.
  7. जब कार्यक्रम पूरा हो गया है, थाली बाहर ले जाओ और जल्दी से इसे BioPlex मशीन के लिए स्थानांतरण को पढ़ने. प्लेट 10 मिनट के भीतर पढ़ा जाना चाहिए. 60 डिग्री सेल्सियस पर पढ़ने, यह सुनिश्चित करें कि इस तापमान को BioPlex prewarmed है. निश्चित है कि जांच ऊंचाई उपयोग थाली, के रूप में इस्तेमाल साधन के लिए उपयोगकर्ता के मैनुअल में वर्णित को समायोजित करने के लिए समायोजित किया गया है.
  8. सटीक मनका और संकेत का पता लगाने के लिए, BioPlex पर फाटक सेटिंग्स microspheres के प्रकार इस्तेमाल किया जा रहा है के अनुसार सेट किया जाना चाहिए. BioRad polystyrene मनकों 4,335-10,000 के एक गेट की स्थापना की आवश्यकता है जबकि चुंबकीय microspheres 5,000-25,000 की एक सेटिंग की आवश्यकता होती है. वहाँ भी उच्च PMT सेटिंग जो रिपोर्टर लाभ मूल्य बढ़ का उपयोग थाली चलाने का विकल्प है. यह मैं कर सकता हूँलेकिन यह महत्वपूर्ण है कम संकेतों की तीव्रता ncrease एक उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल पृष्ठभूमि संकेत भी बढ़ जाएगा.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

इस परख के विकास और कार्यान्वयन में हमारे लक्ष्यों में से एक के लिए यह सरल और संभव के रूप में सुव्यवस्थित रूप बनाने के लिए किया गया था. इसलिए हम महत्वपूर्ण बाद प्रवर्धन कदम अनुकूलित T7 exonuclease उपचार समय और संकरण समय सहित क्रम में करने के लिए एक परख है कि एक उचित समय सीमा में पूरा किया जा सकता है है विकसित. चित्रा 2A में दिखाया गया है, amplicon के T7 उपचार संकेत पीढ़ी के लिए आवश्यक है, के रूप में सबसे अधिक जांच कम या कोई T7 उपचार के साथ कम या कोई संकेत था. संकेत लगभग 40 मिनट तक रैखिक वृद्धि हुई है, जो समय पर संकेत वृद्धि धीमी हो गई. संकेत का कोई गिरावट भी T7 उपचार समय के 2 घंटे में मनाया गया, यह दर्शाता है कि प्राइमरों की phosphorothioate संशोधन अत्यधिक targe को रोकने में कारगर हैटी कतरा गिरावट के रूप में वर्णित 15. हम T7 उपचार समय के लिए 40 मिनट चुना करने के लिए समग्र प्रोटोकॉल समय कम से कम, लेकिन यह चित्रा 2A से स्पष्ट है कि T7 उपचार पर बहुत देर के लिए जा सकते हैं. हम भी संकेत पीढ़ी (चित्रा 2B) संकरण समय के प्रभाव को निर्धारित किया और पाया कि 10 मिनट अधिकतम संकेत के लिए पर्याप्त था, संकरण के 4 घंटे के बाद भी संकेत में कोई आगे बढ़ाने के रूप में मनाया गया. इसलिए, एक 10 मिनट संकरण कदम चुना था, फिर से समग्र परख समय कम से कम. मन में, और InstaGene (जैव रेड) के रूप में तेजी से डीएनए निष्कर्षण तकनीकों के साथ इन परिणामों के साथ, डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर, और Luminex विश्लेषण सहित समग्र परख 4-5 घंटे में पूरा किया जा सकता है.

एक सजग नोट पर, एक Luminex या BioPlex रन के दौरान polystyrene मोतियों की एकत्रीकरण का स्तर परख की दक्षता पर एक प्रमुख प्रभाव हो सकता है. BioPlex सॉफ्टवेयर मनका एकत्रीकरण का स्तर है, जो जब तब होता है प्रदर्शित करेगामनका एक से अधिक लेजर पथ और कुल से संकरण संकेत के अपवर्जन में परिणाम में पाया जाता है. मनका स्पष्ट एकत्रीकरण भी है कि एक एकल मनका के लिए उचित आकार नहीं है किसी भी बात कण द्वारा कारण किया जा सकता है, और भी हवाई बुलबुले की वजह से किया जा सकता है. इन घटनाओं से किसी में, मनका कुल, हवा बुलबुला, या कण से संकेत खारिज कर दिया है. ज्यादातर मामलों में, हम पाते हैं कि मनका एकत्रीकरण कम से कम है (चित्र 3A) और प्रत्येक मनका के लिए 100 की गिनती की घटनाओं के लक्षित स्तर को आसानी से प्राप्त है. कभी कभी, तथापि, मोती (3B चित्रा) उदारवादी या गंभीर एकत्रीकरण के स्तर (चित्रा 3C) दिखा. इन मामलों में, के बाद से डेटा की सबसे खारिज कर दिया है, साधन हो सकता है मुसीबत मनका प्रकार प्रति 100 घटनाओं और परिणाम तक पहुँचने संदिग्ध हो सकता है. sonication कदम (3.2 कदम) मनका एकत्रीकरण कम से कम का मतलब है. इसके अलावा, एक पतला microsphere मास्टर मिश्रण (1.20 कदम) के रूप में मोती का भंडारण मदद मिल सकती है. हम hybri से देखा है कि को छोड़कर TMACdization बफर SA पीई बजाय मंदक (3.5 कदम) को जोड़ने मनका एकत्रीकरण कम से कम करने में मदद करता है. इसके अलावा, जब तक हम इस परीक्षण नहीं किया है, नए चुंबकीय मोती Luminex या BioRad से उपलब्ध करने के लिए एक प्रवृत्ति की कुल के लिए कम प्रदर्शन लगा रहे हैं.

एक 5-plex Luminex जी लक्ष्यीकरण सरणी के आवेदन के परिणाम vaginalis ए, vaginae एल, iners, एल. crispatus, और एल इसी ग्राम दाग योनि स्मीयरों झाड़ू के साथ साथ gasseri चित्रा 4 में दिखाया जाता है. इन नमूनों कई बिंदुओं पर समय एक ही व्यक्ति से ले जाया गया. 0 समय, व्यक्ति ग्राम दाग पर आधारित BV के साथ का निदान किया गया (चित्रा -4 ए) और इस एक ही नमूना (4B चित्रा) से Luminex परिणाम है कि सरणी, जी में प्रतिनिधित्व जीवों के शो vaginalis सबसे अधिक प्रचलित था, जबकि ए vaginae और एल. iners भी सकारात्मक थे. नौ दिन बाद, व्यक्ति अभी भी था BV सकारात्मक और एसजी के लिए ignal vaginalis काफी वृद्धि हुई है, जबकिvaginae और एल. iners अभी भी सकारात्मक थे. महत्वपूर्ण बात, इस समय के बाद व्यक्ति एक सामान्य microbiota संक्रमण के रूप में शुरू किया ग्राम सकारात्मक बेसिली स्मीयरों में detectable बन गया (4A चित्रा) जी के लिए संकेत है जबकि vaginalis कम हो और एल के लिए संकेत iners वृद्धि हुई है (4B चित्रा). हमारे इस विधि 13 (जी vaginalis और / या ए vaginae के लिए सकारात्मक नमूने थे BV सकारात्मक माना) के साथ BV के मूल परिभाषा के अनुसार, इस व्यक्ति सभी समय बिंदुओं पर सकारात्मक BV था, हालांकि ग्राम जी का पता लगाने में विफल रहा दाग बाद के दो समय अंक में vaginalis. साथ Luminex विधि यहाँ वर्णित है, रुझान आसानी से अनुक्रमण आधारित विधियों के तुलना में किया जा सकता है, और Luminex परख के परिणाम आम तौर पर ग्राम दाग 13 परिपुष्ट करना, जबकि जीव पहचान और बहुतायत पर अतिरिक्त जानकारी प्रदान.

चित्रा 1 Luminex एक जटिल नैदानिक ​​या पर्यावरणीय नमूने के microbiota प्रोफ़ाइल का निर्धारण करने के लिए प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध आरेख. प्रोटोकॉल है कि ब्याज के नमूने से निकाला गया है टेम्पलेट डीएनए के साथ शुरू होता है. (1) टेम्पलेट डीएनए से पीसीआर उत्पाद का उपयोग उत्पन्न कतरा - विशिष्ट biotinylated, phosphorothioate संशोधित cpn60 केन्द्र शासित प्रदेशों पीसीआर असंशोधित cpn60 केन्द्र शासित प्रदेशों पीसीआर प्राइमरों (तालिका 1) के साथ मिलकर प्राइमरों, (2) यह एक पीसीआर उत्पाद के साथ microbiota का प्रतिनिधित्व पूल उत्पन्न बायोटिन एक कतरा पर संशोधन phosphorothioate, (3) T7 exonuclease, जो संशोधित कतरा phosphorothioate नीचा नहीं है और इसलिए एकल असहाय डीएनए कि बायोटिन के साथ 5 'अंत में संशोधित किया गया है उत्पन्न कर सकते हैं के साथ डबल असहाय पीसीआर उत्पाद डाइजेस्ट, (4) युगल प्रजातियों विशिष्ट cpn60 केन्द्र शासित प्रदेशों के जांच के लिए polystyrene मोती - प्रत्येक मनका एक अनूठा वर्णक्रमीय (मनका रंग से इंगित) पता है कि मैंLuminex या जैव - Plex साधन द्वारा discernable, (5) एकल असहाय पीसीआर प्रजातियों विशिष्ट oligonucleotide युग्मित मोतियों के सूट करने के लिए ब्याज के नमूने से उत्पन्न उत्पाद संकरण, (6) streptavidin phycoerythrin संयुग्म है कि बांध जोड़ें biotinylated एकल असहाय पीसीआर उत्पाद और संकरण का एक संकेतक के रूप में कार्य करता है, (7) वर्णक्रमीय पता (मनका पहचान) और संकरण संकेत तीव्रता एक Luminex या जैव - Plex साधन का उपयोग करते हुए निर्धारित. प्रत्येक मनका पहचान के लिए कम से कम 100 मोती गिने जाते हैं और phycoerythrin संकेत के बीच का प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) आउटपुट के रूप में सूचना दी है. को 100 विभिन्न मनका प्रकार के एक साथ मूल्यांकन किया जा सकता है लेकिन एक मनका तीन प्रकार के भेदभाव दिखा परख सचित्र है. (8) जब पीसीआर के एमएफआई ही नमूना से उत्पन्न प्रतिकृति मनका के लिए एक दिया नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में काफी अधिक है (एक पूंछ छात्र टी परीक्षण, पी <0.05), नमूना उस जीव के लिए सकारात्मक माना जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2 Luminex परख मापदंडों का अनुकूलन. पांच अलग Peptostreptococcus anaerobius लक्षित जांच एक मिश्रित टेम्पलेट से उत्पन्न amplicons के साथ प्रयोग किया गया क्लोन के cpn60 केन्द्र शासित प्रदेशों के 20 योनि के साथ जुड़े होने ज्ञात बैक्टीरिया युक्त पी. सहित plasmids शामिल anaerobius. (ए). T7 exonuclease उपचार समय का प्रभाव. ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल पीछा किया गया था लेकिन T7 exonuclease के साथ उपचार के समय संकरण और मंझला प्रतिदीप्ति (एमएफआई) तीव्रता सारे जांच के लिए निर्धारित किया गया था से पहले विभिन्न था. (बी). संकरण समय के प्रभाव. ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल संकरण समय की एक किस्म के साथ पीछा किया गया था. जांच का एक ही सेट एक ही टेम्पलेट से उत्पन्न के रूप में एक और मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) सारे जांच के लिए निर्धारित किया गया था amplicon के साथ प्रयोग किया गया.

"> चित्रा 3
चित्रा 3 मनका एकत्रीकरण का निर्धारण BioPlex सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. तीन उदाहरण BioPlex रन जिसमें मनका एकत्रीकरण के स्तर (ए) (5%) स्वीकार्य है के दिया जाता है, (बी) की सीमा रेखा (50%), और (सी) अस्वीकार्य (80%).

चित्रा 4
चित्रा 4 5-plex Luminex BV अनुक्रमिक एक ही व्यक्ति से ली गई नमूनों में निदान करने के लिए सरणी के आवेदन. (ए). ग्राम दाग पारंपरिक BV के लिए प्रत्येक नमूने का आकलन किया नैदानिक ​​दिखा स्लाइड्स. (बी). एक 5-plex Luminex सरणी के आवेदन तैयार है और इस प्रोटोकॉल के रूप में एक ही चार (ए) में दिखाया गया नमूनों को वर्णित मार डाला. बैक्टीरियल लक्ष्य एमएफआई जिसका संकेत हमारी परिभाषा (एक पूंछ छात्र के टी - परीक्षण, पी <0.05) एक तारांकन (*) द्वारा संकेत कर रहे हैं द्वारा काफी सकारात्मक था .

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Discussion

संकेत पीढ़ी की विशिष्टता के महत्व का है, आप विश्वास होना चाहिए कि संकेत मनाया वास्तव में है कि जीव से उत्पन्न amplicon का पता लगाने के को दर्शाता है. PrimerPlex (प्रीमियर Biosoft) के रूप में सॉफ्टवेयर के लिए जांच है कि कुशलतापूर्वक संकरण जाएगा डिजाइन करने में मदद कर सकते हैं, लेकिन वे या गैर लक्ष्य प्रजातियों के लिए हो सकता है नहीं पार संकरण. जब सार्वभौमिक पीसीआर प्राइमरों उपयोग किया जाता है के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, यह महत्वपूर्ण है को ध्यान में रखना है कि उत्पन्न amplicon नमूने में मौजूद जीवों के सभी का प्रतिनिधित्व करता है है. यह महत्वपूर्ण है, इसलिए जांच डिजाइन सॉफ्टवेयर द्वारा cpnDB, cpn60 केन्द्र शासित प्रदेशों के दृश्यों के एक डेटाबेस 16 सुझाव दृश्यों की तुलना द्वारा पार संकरण की संभावना के लिए संभावित जांच का विश्लेषण, जांच जो कई जीवों मैच बचा जा रहे हैं यदि संभव हो तो . इसके अलावा, जब संभावित विशिष्ट जांच की पहचान कर रहे हैं, हम एक दृष्टिकोण ले लिया है मान्यता की जांच में जो एक जटिल, कृत्रिम तेmplate क्लोन cpn60 केन्द्र शासित प्रदेशों के 13 ब्याज की microbiota के साथ जुड़े जीवों की एक संख्या के संगत तैयार है. Amplicon तो पूरा "मिश्रित पैनल" लक्ष्य टेम्पलेट सहित, से उत्पन्न है, और संकेत है कि एक दूसरे मिश्रित पैनल है कि लक्ष्य जीव cpn60 केन्द्र शासित प्रदेशों को शामिल नहीं करता है के शामिल टेम्पलेट से उत्पन्न तुलना में है. जांच है कि एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात (जहां संकेत पूरा पैनल से उत्पन्न होता है और शोर लक्ष्य टेम्पलेट बिना पैनल से उत्पन्न होता है) उत्पन्न अंतिम परख में शामिल करने के लिए चयन कर रहे हैं. हम आम तौर पर अंतिम Luminex सरणी में शामिल करने के लिए एक का चयन करने से पहले प्रत्येक लक्ष्य जीव के लिए 4-5 संभव जांच का विश्लेषण किया है.

एक सकारात्मक परिणाम की परिभाषा एक मुद्दे पर विचार किया जाना है. हमने पाया है कि अलग - अलग जांच स्वाभाविक अलग संकेत करने वाली शोर अनुपात है, तो हम एक दृष्टिकोण पर फैसला किया है जिससे एक सकारात्मक परिणाम defin हैछात्र परीक्षा टी (पूंछ): एक बहुत ही सरल सांख्यिकीय परीक्षण द्वारा एड. एक सकारात्मक परिणाम "कोई टेम्पलेट" नियंत्रण के लिए नमूने के एमएफआई की तुलना द्वारा परिभाषित किया गया है, और जब एमएफआई <0.05 पी पर नियंत्रण की तुलना में काफी अधिक है, परिणाम है कि जीव के लिए सकारात्मक माना जाता है. आम तौर पर दो स्वतंत्र रूप से उत्पन्न amplicons प्रत्येक दो प्रतियों में परीक्षण कर रहे हैं. हालांकि पीसीआर और T7 exonuclease कदम एकल असहाय पीसीआर उत्पाद के बारे में 64.5 μl (2.3 कदम) बनाने और इस का केवल 17 μl संकरण (3.2 कदम), 3 संकरण assays के लिए पर्याप्त के लिए प्रयोग किया जाता है, हम आम तौर पर दो amplifications से डुप्लिकेट विश्लेषण करने के लिए कुओं की एक अत्यधिक संख्या का उपयोग कर के बिना एक अंतर्निहित तकनीकी को दोहराने के दे.

की जांच की है कि हम इस परख का एक पहलू अपनी अर्द्ध मात्रात्मक प्रकृति है. एमएफआई किसी दिए गए जांच से संकेत किसी भी जीव के qPCR निर्धारित बहुतायत (भाला धारण करनेवाला सिपाही रैंक सहसंबंध गुणांक आर एंड को अच्छी तरह से संबद्धहो; = ०.४,६८६ <.०,००१ पी 13), लेकिन गतिशील रेंज सीमित है, संकेत करने के लिए उच्च लक्ष्य जीव के स्तर पर तर, के रूप में की उम्मीद के बाद amplicon 40 चक्र का अंत बिंदु पीसीआर के बाद विश्लेषण किया है जाता है. क्योंकि यह अर्द्ध मात्रात्मक है, जीव बहुतायत में प्रवृत्तियों और निगरानी जा सकता है पैटर्न मनाया (उच्च abundances पर संकेत संतृप्ति के बारे में मन में चेतावनी रखने). उदाहरण के लिए, चित्रा 4 सामान्य करने के लिए यह बी.वी. से परिवर्तन के रूप में समय पर एक व्यक्ति की योनि microbiota के एक प्रोफ़ाइल से पता चलता है. के रूप में यह होता है, संकेत जी को इसी vaginalis (BV-जुड़े 17 जीव) बढ़ जाती है और फिर क्षीण हो जाती है, जबकि एल के लिए संकेत पर निगरानी समय के पाठ्यक्रम iners बढ़ जाती है. अनुरूप ग्राम दाग, बी.वी. निदान के लिए वर्तमान "सोने के मानक ', एक पैटर्न है जिससे ग्राम सकारात्मक बेसिली शुरू में अनुपस्थित रहे हैं, लेकिन बाद में समय बिंदुओं पर detectable हैं दिखाने के लिए. Luminex विधि दोनों नमूने में मौजूद जीवों को पहचानती है और देता हैउनके रिश्तेदार abundances रूप ome जानकारी. इस प्रकार की जानकारी के लिए संभावित विशेष रूप से जीवों के abundances में अवांछनीय रुझान के लिए किसी भी प्रकार के नमूने की निगरानी के लिए और एक साथ जीवों की एक बड़ी संख्या के लिए इस डेटा प्रदान कर सकते हैं करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

महत्वपूर्ण बात, इस विधि योनि microbiota की रूपरेखा के लिए सीमित नहीं है और यथोचित किसी भी वातावरण में लक्ष्य जीवों की एक श्रृंखला का पता लगाने और आंशिक मात्रा का ठहराव वांछनीय है के लिए लागू किया जा सकता है. जब अन्य वातावरण के लिए विधि लागू करने, यह महत्वपूर्ण है पीसीआर निषेध घटनेवाला की संभावना पर विचार पीसीआर के inhibitors के रूप में आमतौर पर कई 18 वातावरण से डीएनए के साथ सह - शुद्ध है. कहाँ पीसीआर निषेध एक मुद्दा है, नमूना या पतला किया जा सकता है क्रम में करने के लिए इस परख के लिए पर्याप्त संकेत उत्पन्न आगे शुद्ध.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम परख विकास और इस पांडुलिपि पर महत्वपूर्ण टिप्पणी के साथ मदद के लिए अल्बर्टो Severini और वैनेसा Goleski धन्यवाद. इस काम कनाडा के जन स्वास्थ्य एजेंसी और औद्योगिक अनुसंधान सहायता कार्यक्रम (कनाडा के राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. Saskatchewan प्रकाशन फंड के विश्वविद्यालय से अतिरिक्त सहायता प्राप्त हुई थी.

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Comments

1 Comment

  1. We should prepare one about detection of phytoplasmas ! ;)

    Reply
    Posted by: Edel P.
    May 13, 2014 - 2:45 PM

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