Author Produced

Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אנו מתארים שיטה זמנית לצורך זיהוי של מיקרואורגניזמים בתוך מדגם באמצעות חרוזי ניאון oligonucleotide מצמידים. Amplicon מכל האורגניזמים בתוך מדגם הוא הכלאה בפני פאנל של בדיקה, בשילוב חרוזים. מכשיר Luminex או Bio-Plex משמש עבור כל שאילתת חרוז חרוז סוג האות הכלאה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Dumonceaux, T. J., Town, J. R., Hill, J. E., Chaban, B. L., Hemmingsen, S. M. Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres. J. Vis. Exp. (56), e3344, doi:10.3791/3344 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

וגינוזיס בקטריאלי (BV) היא תסמונת polymicrobial חוזרת מאופיין בשינוי החיידקים "נורמלי" של לקטובצילוס הנשלטת על החיידקים הנשלט על ידי מספר מינים חיידקי, כולל vaginalis Gardnerella, Atopobium vaginae ועוד 1-3. מצב זה קשור עם מגוון של תוצאות בריאותיות שליליות, כולל איידס רכישת 4, וזה יכול להיות קשה לנהל קלינית 5. יתר על כן, האבחנה של BV הסתמכה על השימוש גראם כתמים של מריחות משטח וגינאלי, כי הם ציונים מספריים על קריטריונים שונים 6,7. בעוד אבחון זה הוא פשוט, לא יקר, מתאים גם משאב מוגבל הגדרות, זה יכול סובלים מבעיות הקשורות פרשנויות סובייקטיביות זה לא נותן פרופיל מפורט של הרכב החיידקים הנרתיק 8. מאמצים אחרונים רצף עמוק חשפו החיידקים עשיר, מגוון עם הנרתיקהבדלים ברורים בין דגימות שנלקחו מאנשים אשר מאובחנים עם BV לעומת אותם אנשים שנחשבים 9,10 נורמלי, אשר הביאה לזיהוי של מספר יעדים פוטנציאליים לאבחון מולקולרי של BV 11,12. מחקרים אלו סיפקו שפע של מידע שימושי, אבל רצף עמוק עדיין לא מעשית כשיטת אבחון בסביבה קלינית. תיארנו לאחרונה שיטה מהירה לאפיון החיידקים בנרתיק במתכונת זמנית באמצעות oligonucleotide מצמידים חרוזי ניאון עם זיהוי על פלטפורמה Luminex 13. שיטה זו, כמו כתם הנוכחי מבוסס שיטות סבתא, היא מהירה ופשוטה אבל מוסיפה את יתרון נוסף של ניצול הידע המולקולרי הנובעים רצף לימודי עיצוב בדיקה. שיטה זו ולכן מספק דרך הפרופיל מיקרואורגניזמים העיקריים נמצאים מקלון הנרתיק שניתן להשתמש בהם כדי לאבחן BV עם סגוליות גבוהה comp רגישותared כדי גראם כתם תוך מתן מידע נוסף על נוכחות מינים ושפע באופן חצי כמותי ומהיר. שיטה זו זמנית ניתן להרחבה גם מעבר לטווח של PCR כמותי מבחני הנוכחי של אורגניזמים מסוימים, אשר כרגע מוגבל ל 5 או 6 מבחני שונים יחיד מדגם 14. חשוב לציין כי השיטה אינה מוגבלת לזיהוי דגימות של חיידקים בנרתיק ניתן להתאים בקלות במהירות פרופיל כמעט כל הקהילה מיקרוביאלי של עניין. לדוגמה, יש לנו לאחרונה החל ליישם מתודולוגיה לפיתוח של כלי אבחון לשימוש בצמחים וטיפול בשפכים.

Protocol

שיטה זו שימשה במחקר דיווחו Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

תרשים סכמטי המתאר את הליך הכולל מוצג באיור 1.

1. ביד צימוד

זה מתאר את שיטות לשמש צימוד בדיקות oligonucleotide כדי חרוזי פוליסטירן Luminex (ראה טבלה 2). כרכים מותאמים מעט על בסיס ניסיוני להערכת בדיקות ללכוד חדשים; כרכים אלה מסומנים בסוגריים.

  1. הסר 1-אתיל-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) אבקת dessicator מ -20 ° C וחם אותו בטמפרטורת החדר.
  2. Resuspend microspheres ידי sonciation ב sonicator waterbath למשך 20 שניות, ואז vortexing כ 20 שניות.
  3. העברת 400 μl (100 μl) של microspheres אל צינור Eppendorf (זה מתאים 5x10 6 או 1.25x10 6 microspheres). Luminex מציע את השימוש נמוך מחייב חלבון צינורות microcentrifuge (למשל LoBind Eppendorf צינורות חלבון, מספר קטלוג 0030 108.094) כדי למנוע את החרוזים מנותקים דבק צינורות מפריעה להחלמה חרוז. לא מצאנו את זה כדי להיות בעיה באמצעות תקן microcentrifuge צינורות פוליפרופילן, אשר אנו משתמשים בדרך כלל (למשל מספר VWR קטלוג 87003-298).
  4. גלולה ב XG 14000 דקה 1. הסר להתעלמות supernatant.
  5. Resuspend microspheres ב μl 50 (12.5 μl) של בטמפרטורת החדר 0.1 מ '2 - (N-Morpholino) ethanesulfonic חומצה (MES) pH 4.5.
  6. הכן פתרון חדש של EDC ב 10 מ"ג / מ"ל ​​מים.
    1. הכן פחות מ 1 מ"ל של פתרון זה על ידי במשקל של 5-10 מ"ג EDC בקנה מידה אנליטית, ואז הוספת מים ל -10 מ"ג / מ"ל.
  7. הוסף 1 nmol של oligonucleotide 5'-amino-C12 ללכוד שונה (טבלה 2) כדי microspheres ומערבבים ידי vortexing. 1 nmol הוא 5 μl של 200 מיקרומטר אוליגונוקלאוטיד.
  8. הוספת 2.5 μl של פתרון EDC טריים microspheres ומערבבים ידי vortexing למשך 5 שניות.
  9. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.
  10. מחק את הפתרון EDC (שלב 1.6) ולהכין מדגם חדש של EDC 10 מ"ג / מ"ל ​​במים לעיל (שלב 1.6).
  11. הוסף μl 2.5 של פתרון EDC טריים microspheres ו מערבולת למשך 5 שניות.
  12. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.
  13. שטפו את החרוזים על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.02% Tween 20. וורטקס (אופציונלי sonicate למשך 20 שניות גם כן) כדי resuspend את החרוזים.
  14. צנטריפוגה 14,000 1 דקה XG. הסר להתעלמות supernatant.
  15. שטפו את החרוזים שוב על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.1% נתרן סולפט dodecyl (SDS). וורטקס (אופציונלי sonicate למשך 20 שניות גם כן) כדי resuspend את החרוזים.
  16. צנטריפוגה 14,000 1 דקה XG. הסר להתעלמות supernatant.
  17. Resuspend את החרוזים μl 100 (25 μl) של טריס-EDTA (TE) חוצץ [10 מ 'טריס M-Cl-pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0].
  18. ספירת את החרוזים haemocytometer או קולטר מונה כדי לקבוע את ריכוז המניות.
  19. הכן Mix Master microsphere על ידי דילול כל חרוז לריכוז סופי של 100 חרוזים / μl ב TE חיץ. בריכת בשילוב חרוזים המתאים Plex הרצוי של assay (למשל עבור assay 10-Plex, לערבב יחד 10 חרוזים שונים בריכוז הסופי של 100/μl של כל חרוז).
  20. חנות מיקס מאסטר microsphere ב 4 ° C בחושך. התערובת ניתן לאחסן במשך חודשים אם כל הזמן בתנאים אלה.

2. Chaperonin 60 אוניברסלי היעד (cpn60 UT) ייצור amplicon הדור של גדילי יחיד.

  1. יצירת שרשרת פולימראז התגובה (PCR) מוצר עבור כל דגימה. כלול את phosphorothioate-ולהגדיר פריימר ביוטין, שונה '5 (טבלה 1). ראה לוח 3 עבור כרכים לערבב ריכוזי.
  2. מיד לאחר ה-PCR היא להשלים, להוסיף 2 μl (20 יחידות) של T7 לשעברonuclease על צינור אחד PCR (PCR החיץ יספיק עבור התגובה T7). דגירה התגובה בטמפרטורת החדר (~ 22-25 מעלות צלזיוס) במשך 40 דקות.
  3. בסוף הדגירה זה, להוסיף 12.5 μl של אתילן M 0.5 diamine חומצה tetraacetic (EDTA) pH 8.0 ומערבבים. זה נותן סך של ~ 64.5μl של מוצר ה-PCR חד גדילי.

3. הכלאה של מוצר ה-PCR חד גדילי כדי oligonucleotide מצמידים חרוזי פוליסטירן.

  1. מכשיר Prewarm עד 60 ° C כדי לשמור על טמפרטורת הכלאה במהלך ניתוח. הפעל את החימום באמצעות פלטפורמת התוכנה של המכשיר הקפד להשתמש החימום פליז בלוק שמתאים את הצלחת ה-PCR בסגנון שמכיל את תערובת חרוז הכלאה.
  2. Resuspend microsphere מיקס מאסטר (שלב 1.20) עם טפטפת, לוותר על הכמות המתאימה לתוך צינור Eppendorf, מכסה את הצינור, ואת sonicate ב sonicator waterbath במשך 2 דקות. לחלופין, כדי להבטיח עקביות מוחלטת חרוז resuspension, לערבב את אב microsphere ניתן resuspended ידי vortexing ו pipetting, אז sonication לעיל, ולאחר מכן מחלק את הכמות הרצויה לתוך צינור פוליפרופילן Eppendorf.
  3. לוותר על 17 μl של מוצר ה-PCR חד גדילי (שלב 2.2) לתוך הבארות המתאים פרופיל נמוך-96-PCR גם Thermowell צלחת (טבלה 2). הוסף 33 μl של התערובת, resuspended חרוז sonciated היטב כל אחד. מכסים עם מכסה סיליקון (טבלה 2) ולחץ בעדינות.
  4. מכניסים את הצלחת לתוך thermocycler עם תוכנית של: 95 ° C למשך 5 דקות, 60 ° C למשך 10 דקות, 60 ° C להחזיק, 60 ° C במשך 5 דקות, סוף. הפעל את התוכנית.
  5. בצע טרי streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) פתרון: תצטרך 25 μl לכל טוב (לעשות כמה בארות נוספות). הפוך את SA-PE פתרון על ידי דילול מניות SA-PE (1 מ"ג / מ"ל) 01:50 עד 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​עם כלוריד 1x tetramethylammonium (TMAC) חוצץ (3 M TMAC; Sarkosyl 0.1%; 50 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0 ; 4 mM EDTA, pH 8.0).
  6. כאשר thermocycler מגיע שלב 60 C ° להחזיק,פותחים את המכסה, הסר את כיסוי סיליקון ולהוסיף SA-PE פתרון ישירות זה טוב (לא לוקח את הצלחת מתוך thermocycler). החזר את מכסה סיליקון, לסגור את המכסה thermocycler ולחדש את התוכנית.
  7. כאשר התוכנית תושלם, לקחת את הצלחת החוצה במהירות ולהעביר אותו למכונה BioPlex לקרוא. פלייט יש לקרוא תוך 10 דקות. קריאה ב 60 ° C; להבטיח כי BioPlex כבר prewarmed לטמפרטורה זו. הייה בטוח כי גובה בדיקה הותאם כדי להכיל את צלחת מנוצל, כפי שתואר עבור המכשיר בשימוש ידני של המשתמש.
  8. עבור חרוז מדויק זיהוי אות, הגדרות השער על BioPlex יש להגדיר על פי סוג של microspheres בשימוש. חרוזים BioRad קלקר דורש הגדרה השער של 4,335-10,000 בעוד microspheres מגנטי דורשות הגדרה של 5,000-25,000. יש גם את האפשרות להפעיל את הצלחת באמצעות הגדרת PMT גבוהה אשר מגדילה את הערך לזכות הכתב. זה יכול increase את עוצמת האותות נמוכים אולם חשוב לכלול בקרה שליליות מתאימות כאות רקע יהיה גם גדל.

4. נציג תוצאות:

אחת המטרות שלנו בפיתוח ויישום זה assay היה לעשות את זה פשוט ויעיל ככל האפשר. לפיכך, אנו אופטימיזציה הקריטית שלאחר הגברה צעדים, כולל זמן exonuclease T7 הטיפול וזמן הכלאה על מנת לפתח assay כי ניתן להשלים במסגרת זמן סבירה. כפי שניתן לראות בתרשים 2A, טיפול T7 של amplicon חיונית עבור הדור האות, כמו רוב הבדיקות היה האות עם מעט או ללא טיפול T7 קצר או לא. האות גדל באופן ליניארי עד כ 40 דקות, בו בזמן להגדיל אות האט. אין השפלה של האות נצפתה אפילו 2 שעות של זמן טיפול T7, המציין שינוי phosphorothioate של primers הוא יעיל מאוד במניעת targeהשפלה לא גדיל כמתואר 15. בחרנו 40 דקות זמן הטיפול T7 כדי לצמצם את זמן פרוטוקול הכולל, אך ברור מתוך 2A איור T7 כי הטיפול יכול להימשך עוד הרבה זמן. אנחנו נקבע גם את ההשפעה של זמן הכלאה על הדור האות (תרשים 2B) ומצא כי 10 דקות הספיקה אות מקסימלית, כמו עלייה נוספת של האות נצפתה גם לאחר 4 שעות של הכלאה. לכן, כצעד הכלאה 10 דקות נבחר, שוב כדי לצמצם את זמן assay הכוללת. עם התוצאות הללו בחשבון, ועם מיצוי מהיר טכניקות ה-DNA כמו InstaGene (Bio-Rad), assay הכולל כולל מיצוי DNA, PCR, וניתוח Luminex ניתן להשלים שעות 4-5.

על פתק אזהרה, רמת צבירה של חרוזי פוליסטירן במהלך הריצה Luminex או BioPlex יכולה להיות השפעה משמעותית על היעילות של assay. התוכנה BioPlex יציג את רמת חרוז צבירה, אשר מתרחשת כאשריותר חרוז מזוהה בדרך לייזר התוצאות למעט האות הכלאה בין במצטבר. צבירה חרוז לכאורה יכול להיגרם גם על ידי כל חלקיקי החומר שאינו בגודל המתאים חרוז אחד, אפילו יכול להיגרם על ידי בועות אוויר. בכל אחד מאירועים אלה, האות מ במצטבר חרוז, בועת אוויר, או חלקיק נמחקת. ברוב המקרים, אנו מוצאים כי צבירה חרוז הוא מזערי (איור 3A) ורמת ממוקד של 100 אירועים לספור עבור כל חרוז הוא בר השגה בקלות. לפעמים, לעומת זאת, החרוזים להראות מתון (איור 3B) או חמורה (איור 3 ג) רמת צבירה. במקרים אלה, שכן רוב הנתונים נמחק, המכשיר יתקשו להגיע 100 אירועים לפי סוג חרוז ואת התוצאות ניתן בספק. צעד sonication (שלב 3.2) נועד למזער צבירה חרוז. בנוסף, לאחסון חרוזים כמו שילוב הורים לדלל microsphere (שלב 1.20) עשויים לעזור. שמנו לב TMAC למעט מן hybriחיץ dization - הוספתו diluent SA-PE במקום (שלב 3.5) - מסייע לצמצם צבירה חרוז. יתר על כן, בזמן שאנחנו לא צריך לבדוק את זה, חרוזים המגנטי החדשים זמינים Luminex או BioRad נחשבים להציג פחות נטייה לצבור.

התוצאות של יישום של מערך Luminex 5-Plex מיקוד G. vaginalis, א vaginae, ל iners, ל crispatus, ול ' gasseri יחד עם המקבילה מוכתם גראם מריחות הנרתיק ספוגית מוצגים באיור 4. דגימות אלה נלקחו אדם יחיד בנקודות זמן שונות. בזמן 0, הפרט אובחן BV מבוסס על כתם גראם (איור 4 א) ואת תוצאות Luminex ממדגם זה זהה (איור 4B) מראים של אורגניזמים המיוצגים במערך, G. vaginalis היה נפוץ ביותר, בעוד א vaginae ול iners היו גם חיוביים. כעבור תשעה ימים, הפרט היה עדיין BV חיובית שלignal עבור G. vaginalis גדל באופן משמעותי תוך א vaginae ול iners עדיין חיובי. חשוב לציין, אחרי כל הזמן הזה האדם החלו המעבר החיידקים נורמלית כמו החיידקים גראם חיובי הפך להבחין מריחות (איור 4A) ואילו האות G. vaginalis דעכה ואת האות L. iners מוגבר (איור 4B). על פי ההגדרה המקורית של BV עם שיטה זו (דגימות חיוביות vaginalis ג'ו / או א vaginae נחשבו BV חיובי) 13, הפרט הזה היה BV חיובית בכל נקודות הזמן, למרות גראם הכתם לא הצליחו לאתר G. vaginalis בשתי נקודות הזמן האחרון. עם השיטה Luminex המתואר כאן, מגמות ניתן להשוות בקלות רצף שיטות מבוססות, ואת התוצאות של assay Luminex בדרך כלל לאשש כתמים גראם 13 תוך מתן פרטים נוספים על זהות האורגניזם ושפע.

"איור באיור 1. תרשים סכמטי של פרוטוקול Luminex לקביעת פרופיל החיידקים מדגם קליני או סביבתיות מורכבות. פרוטוקול מתחיל עם תבנית ה-DNA חולץ מן המדגם של עניין. (1) יצירת מוצר ה-PCR מ-DNA תבנית באמצעות גדיל ספציפי biotinylated, phosphorothioate-UT שונה cpn60 primers PCR יחד עם ללא שינוי cpn60 UT-PCR primers (טבלה 1), (2) זה יוצר בריכה מוצר PCR המייצג את החיידקים עם ביוטין, phosphorothioate שינוי על גדיל אחד; (3) תקציר המוצר פעמיים תקועים PCR עם exonuclease T7, אשר לא ניתן לבזות את גדיל phosphorothioate-שונה ולכן יוצרת גדילי דנ"א יחיד כי הוא שונה בסוף "5 עם ביוטין, (4) זוג חרוזי פוליסטירן למינים ספציפיים cpn60 בדיקות UT - כל חרוז יש כתובת ייחודית ספקטרלי (מסומנת בצבע חרוז) זה אניזה ניתן להבחין על ידי Luminex או Bio-Plex מכשיר: (5) להכליא את המוצר חד גדילי ה-PCR שנוצר מן המדגם עניין הסוויטה של ​​מינים ספציפיים oligonucleotide מצמידים חרוזים; (6) הוסף streptavidin-phycoerythrin המצומד הנקשרת המוצר biotinylated חד גדילי ה-PCR ומהווה אינדיקטור הכלאה; (7) לקבוע את כתובת ספקטרלי (חרוז זהות) ואת עוצמת האות הכלאה באמצעות Luminex או Bio-Plex מכשיר. לפחות 100 חרוזים נספרים עבור כל זהות חרוז את עוצמת הקרינה החציונית (MFI) של האות phycoerythrin המדווח הפלט. עד 100 סוגי חרוזים שונים ניתן להעריך בו זמנית אבל assay מראה את האפליה של שלושה סוגי חרוז מודגם. (8) כאשר MFI של PCR משכפל שנוצר מן המדגם אותו באופן משמעותי יותר מאשר שליטה שלילי חרוז נתון (אחד זנב של התלמיד מבחן t, p <0.05), המדגם נחשב חיובי עבור אורגניזם זה.

איור 2
באיור 2. אופטימיזציה של הפרמטרים Luminex assay. חמש בדיקות שונות ממוקד anaerobius Peptostreptococcus שימשו עם amplicons שנוצר מתבנית מעורבת הכוללת פלסמידים המכילים את משובטים cpn60 UT של 20 חיידקים ידועים להיות מזוהה עם הנרתיק, כולל פ anaerobius. (א). השפעת זמן הטיפול T7 exonuclease. הפרוטוקול שתואר לעיל באה אך הפעם הטיפול עם exonuclease T7 היתה מגוונת לפני הכלאה לבין עוצמת הקרינה החציונית (MFI) נקבע עבור כל הבדיקות. (B). השפעת הזמן הכלאה. הפרוטוקול שתואר לעיל באה עם מגוון רחב של הכלאה פעמים. מגדיר אותו בדיקות ששימשו עם amplicon שנוצר מתבנית זהה ועוצמת הקרינה החציונית (MFI) נקבע עבור כל הבדיקות.

"> איור 3
באיור 3. קביעת צבירה חרוז באמצעות תוכנת BioPlex. שלוש דוגמאות ניתנות של פועל BioPlex שבו רמת חרוז צבירה הוא (א) מקובל (5%), (ב) גבולית (50%), ו (ג) מקובל (80%).

איור 4
איור 4. יישום של מערך Luminex 5-Plex לאבחון BV בדגימות שנלקחו רציפים בודדים זהה. (א). גראם מוכתמת שקופיות המציגה את האבחון המסורתיות להערכת עבור כל מדגם BV. (B). יישום מערך Luminex 5-Plex מוכנים והוצאו להורג כמתואר בפרוטוקול זה ארבע דגימות אותו מוצג (A). מטרות חיידקית אשר אות MFI היתה חיובית משמעותית על ידי הגדרה שלנו (אחד זנב של התלמיד מבחן t, p <0.05) מסומנים על ידי כוכבית (*).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

סגוליות של הדור אות היא בעלת חשיבות מכרעת, אתה חייב להיות בטוח כי האות שנצפה באמת משקף את הזיהוי של amplicon שנוצר אורגניזם הזה. תוכנות כגון PrimerPlex (פרמייר Biosoft) יכול לעזור לתכנן בדיקות אשר להכליא ביעילות, אבל הם עשויה או לא עשויה לחצות להכליא ליעד הלא מינים. כאשר אוניברסלי primers PCR משמשים כמתואר בפרוטוקול זה, חשוב לזכור כי amplicon שנוצר מייצג את כל האורגניזמים הנמצאים במדגם. חשוב, אפוא, לנתח את פוטנציאל בדיקות לאפשרות של הכלאה הנגדית על ידי השוואת רצפי הציע ידי תוכנת עיצוב בדיקה של cpnDB, מסד נתונים של רצפי cpn60 UT 16; בדיקות התואמים אורגניזמים מרובים יש להימנע במידת האפשר . יתר על כן, כאשר בדיקות ספציפיות פוטנציאל מזוהים, נקטנו גישה בדיקה ואימות בו מורכב, מלאכותי template מוכן המתאים UT cpn60 משובטים של מספר אורגניזמים הקשורים החיידקים של עניין 13. Amplicon נוצר אז מתוך "פאנל מעורבת" המלא, כולל תבנית היעד, אות הוא כי בהשוואה שנוצר מהתבנית השנייה מורכבת בלוח מעורב שאינו מכיל cpn60 האורגניזם היעד של UT. בדיקות שיוצרים יחס גבוה אות לרעש (שם אות מופק מתוך לוח להשלים את הרעש מופק בלוח ללא תבנית היעד) נבחרו להיכלל assay הסופי. ניתחנו בדרך כלל 4-5 בדיקות אפשרי עבור כל אורגניזם היעד לפני בחירת אחד להיכלל במערך Luminex הסופי.

ההגדרה של תוצאה חיובית היא סוגיה שיש לקחת בחשבון. מצאנו כי בדיקות שונות שונה במהותו אות לרעש יחס, ולכן החלטנו על גישה לפיה תוצאה חיובית היא definעל ידי עורך בדיקה סטטיסטית פשוטה מאוד: התלמיד מבחן t (חד זנב). תוצאה חיובית מוגדרת על ידי השוואת MFI המדגם של שליטה "אין תבנית", וכאשר MFI הוא גבוה באופן משמעותי מאשר לשלוט ב p <0.05, תוצאה נחשבת חיובית עבור אורגניזם זה. בדרך כלל two amplicons שנוצר באופן עצמאי כל אחד מהם נבדק כפולים. למרות PCR צעדים T7 exonuclease ליצור על 64.5 μl של מוצר ה-PCR חד גדילי (שלב 2.3), ורק 17 μl זה משמש הכלאה (שלב 3.2), מספקת 3 מבחני ההכלאה, אנו בדרך כלל לנתח כפילויות משני amplifications ל לתת לשכפל טכני הטבועה ללא שימוש מספר מוגזם של בארות.

היבט של assay זה שיש לנו לחקור הטבע וכמותיות שלה. האות מ MFI בדיקה נתון וקושרת היטב שפע qPCR שנקבע האורגניזם נתון (מתאם Spearman בדרגת מקדם & rהו: = 0.4686, p <0.0001) 13, אבל את הטווח הדינמי הוא מוגבל; האות נוטה להרוות ברמות האורגניזם גבוה היעד, כצפוי מאז amplicon מנותח לאחר נקודת הסיום PCR של 40 מחזורים. כי זה חצי כמותי, מגמות בשפע האורגניזם ניתן לנטר דפוסים שנצפו (שמירה על אזהרה בראש לגבי הרוויה אות ב שכיחותם גבוהה יותר). לדוגמה, איור 4 מראה פרופיל של החיידקים הנרתיק של אדם לאורך זמן כפי שהוא משתנה BV לקדמותו. כאשר זה מתרחש, האות המתאים G. (אורגניזם BV הקשורים 17) vaginalis מגביר ואז דועכת, ואילו במהלך הזמן ניטור האות L. iners עליות. כתמים גראם מקבילים, את "תקן הזהב" לאבחון הנוכחי BV, להראות דפוס לפיה החיידקים גראם חיובי נעדרים בהתחלה אבל הם לזיהוי בנקודות זמן מאוחר יותר. השיטה Luminex גם מזהה את האורגניזמים הנמצאים במדגם ונותן sOme מידע לגבי שכיחותם היחסית שלהם. סוג זה של מידע העלול לשמש כדי לפקח על דגימות מכל סוג של מגמות רצויים שכיחותם של אורגניזמים מסוימים יכולה לספק נתונים עבור מספר גדול של אורגניזמים בו זמנית.

חשוב לציין כי שיטה זו אינה מוגבלת פרופיל של החיידקים בנרתיק סביר להיות מיושם בכל סביבה שבה כימות איתור חלקי של מגוון רחב של אורגניזמים יעד רצוי. כאשר מיישמים את שיטת לסביבות אחרות, חשוב לשקול את האפשרות של עיכוב PCR המתרחשים, כמו מעכבי PCR נפוץ שיתוף לטהר עם DNA מסביבות רבות 18. איפה עיכוב PCR היא סוגיה, המדגם יכול להיות מדולל או מטוהרים נוסף על מנת ליצור אות מספיק assay הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

אנו מודים אלברטו Severini וונסה Goleski לעזרה בפיתוח assay והערות קריטי על כתב היד הזה. עבודה זו מומנה על ידי הסוכנות לבריאות הציבור של קנדה תעשייתי מחקר סיוע התוכנית (המועצה הלאומית למחקר של קנדה). תמיכה נוספת התקבלה מאוניברסיטת הקרן פרסום ססקצ'ואן.

References

  1. Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
  2. Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
  3. Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. Bacterial vaginosis: a public health review. Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).
  4. Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women's susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms. Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).
  5. Wilson, J. Managing recurrent bacterial vaginosis. Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).
  6. Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).
  7. Ison, C. A., Hay, P. E. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics. Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).
  8. Money, D. The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).
  9. Schellenberg, J. Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).
  10. Spear, G. T. Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).
  11. Brotman, R. M., Ravel, J. Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis. Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).
  12. Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).
  13. Dumonceaux, T. J. Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres. J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).
  14. Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics. J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).
  15. Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization. PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).
  16. Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. cpnDB: A Chaperonin Sequence Database. Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).
  17. Bradshaw, C. S. The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy. J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).
  18. Dumonceaux, T. J. Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target. J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).

Comments

1 Comment

  1. We should prepare one about detection of phytoplasmas ! ;)

    Reply
    Posted by: Edel P.
    May 13, 2014 - 2:45 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics