Author Produced

Multiplex Påvisning av bakterier i Complex Clinical and Environmental Prøver å bruke oligonukleotid-coupled Fluorescent Mikrokuler

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver en multiplex metode for påvisning av mikroorganismer i en prøve med oligonukleotid-kombinert fluoriserende perler. Amplicon fra alle organismer innen en prøve er hybridisert til et panel av probe-koblet perler. En Luminex eller Bio-Plex instrumentet brukes til å spørre hver perle for perle type og hybridisering signal.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Dumonceaux, T. J., Town, J. R., Hill, J. E., Chaban, B. L., Hemmingsen, S. M. Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres. J. Vis. Exp. (56), e3344, doi:10.3791/3344 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bakteriell vaginose (BV) er et tilbakevendende polymikrobielle syndrom som er karakterisert ved en endring i "normal" microbiota fra Lactobacillus-dominert til et microbiota dominert av en rekke av bakterielle arter, inkludert Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae og andre 1-3. Denne tilstanden er forbundet med en rekke negative helseutfall, deriblant HIV anskaffelse 4, og det kan være vanskelig å håndtere klinisk 5. Videre har diagnosen BV stolt på bruk av Gram flekker av vaginal vattpinne utstryk som er scoret på ulike numeriske kriterier 6,7. Selv om dette diagnostiske er enkel, billig og godt egnet til ressurs-begrensede innstillinger, kan det lider av problemer knyttet til subjektive tolkninger og det gir ikke en detaljert profil av sammensetningen av vaginal microbiota 8. Nyere dype sekvensering innsats har avdekket en rik og mangfoldig vaginal microbiota medklare forskjeller mellom prøver tatt fra personer som er diagnostisert med BV i forhold til de individer som anses normal 9,10, noe som har resultert i identifisering av en rekke potensielle mål for molekylær diagnostikk av BV 11,12. Disse studiene har gitt et vell av nyttig informasjon, men dypt sekvensering er ennå ikke praktisk som en diagnostisk metode i en klinisk setting. Vi har nylig beskrevet en metode for raskt profilering vaginal microbiota i en multiplex format ved hjelp oligonukleotid-coupled fluoriserende perler med deteksjon på en Luminex plattform 13. Denne metoden, som nåværende Gram stain-baserte metoder, er rask og enkel, men legger den ekstra fordelen av å utnytte molekylær kunnskap oppstår fra sekvensering studier i probe design. Denne metoden gir derfor en måte å profilere viktige mikroorganismer som er tilstede i en vaginal vattpinne som kan brukes til å diagnostisere BV med høy spesifisitet og sensitivitet compared til Gram stain samtidig som det gir ytterligere informasjon om artene tilstedeværelse og overflod i en semi-kvantitativ og rask måte. Denne multiplex metoden kan utvides godt utover rekkevidden til dagens kvantitative PCR-analyser for aktuelle organismer, som er foreløpig begrenset til 5 eller 6 forskjellige analyser i en enkelt prøve 14. Viktigere, er metoden ikke begrenset til påvisning av bakterier i skjeden vattpinner og kan enkelt tilpasses raskt profilen nesten alle mikrobielle samfunn av interesse. For eksempel har vi nylig begynt å bruke denne metodikken til utvikling av diagnostiske verktøy for bruk i avløpsrenseanlegg.

Protocol

Denne metoden ble brukt i forskning rapportert i Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

En skjematisk diagram som viser den generelle prosedyren er presentert i Figur 1.

1. Bead kobling

Dette beskriver metoder som skal benyttes for kopling oligonukleotid prober til polystyren Luminex perler (se tabell 2). Volumene er tilpasset litt for vurdering av nye fange prober på en prøveordning, og disse volumene er angitt i parentes.

  1. Fjern 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) pulver fra -20 ° C dessicator og varm det opp til romtemperatur.
  2. Resuspender mikrosfærer ved sonciation i en waterbath sonicator i 20 sekunder, deretter virvling omtrent 20 sekunder.
  3. Overfør 400 mL (100 mL) av mikrosfærer til en Eppendorf tube (dette tilsvarer 5x10 6 eller 1.25x10 6 mikrosfærer). Luminex antyder bruk av lav proteinbinding Mikrosentrifugerør (f.eks Eppendorf Protein LoBind rør, katalognummer 0030 108.094) for å hindre frikoblet perler fra stikker til tuber og forstyrrer perle utvinning. Vi har ikke funnet dette å være et problem ved hjelp av standard polypropylen Mikrosentrifugerør, som vi vanligvis bruker (f.eks VWR katalognummer 87003-298).
  4. Pellet på 14 000 xg i 1 minutt. Fjern og kast supernatanten.
  5. Resuspender mikrosfærer i 50 mL (12,5 mL) av romtemperatur 0,1 m 2 - (N-Morpholino) ethanesulfonic syre (MES) pH 4.5.
  6. Forbered en frisk løsning av EDC ved 10 mg / ml i vann.
    1. Forbered mindre enn 1 ml av denne løsningen ved veiing 5-10 mg av EDC på en analytisk skala, deretter legge vann til 10 mg / ml.
  7. Tilsett 1 nmol av 5'-amino C12-modifisert fanger oligonukleotid (tabell 2) for å mikrosfærer og bland ved virvling. 1 nmol er 5 mL av 200 mM oligonukleotid.
  8. Legg 2,5 mL av fersk EDC løsning på mikrosfærer og bland ved virvling i 5 sekunder.
  9. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter i mørket.
  10. Kast EDC løsningen (trinn 1,6) og forberede en ny prøve av 10 mg / ml EDC i vann som ovenfor (trinn 1,6).
  11. Legg til en annen 2,5 mL av fersk EDC løsning på mikrosfærer og vortex i 5 sekunder.
  12. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter i mørket.
  13. Vask perlene ved å tilsette 1 ml på 0,02% Tween 20. Vortex (valgfritt sonicate i 20 sekunder i tillegg) for å resuspendere perlene.
  14. Sentrifuger 14 000 xg 1 minutt. Fjern og kast supernatanten.
  15. Vask perlene igjen ved å tilsette 1 ml 0,1% natrium dodecyl sulfat (SDS). Vortex (valgfritt sonicate i 20 sekunder i tillegg) for å resuspendere perlene.
  16. Sentrifuger 14 000 xg 1 minutt. Fjern og kast supernatanten.
  17. Resuspender perlene i 100 mL (25 mL) av Tris-EDTA (TE) buffer [10 mM Tris-Cl 8,0 pH, 1 mM EDTA, 8,0 pH].
  18. Nummerere perler i en haemocytometer eller Coulter counter å bestemme bestanden konsentrasjon.
  19. Utarbeide en mikrosfære Master Mix ved å fortynne hver perle til en endelig konsentrasjon på 100 perler / mikroliter i TE buffer. Pool kombinert perler tilsvarer ønsket Plex av analysen (f.eks for en 10-plex analysen, mikse 10 forskjellige kombinert perler på en endelig konsentrasjon på 100/μl av hver perle).
  20. Oppbevar mikrosfære Master Mix ved 4 ° C i mørket. Blandingen kan lagres i månedsvis hvis holdt under disse forholdene.

2. Chaperonin 60 universelle målet (cpn60 UT) amplicon produksjon og generering av single tråder.

  1. Generer polymerase kjedereaksjon (PCR) produkt for hver prøve. Inkluder phosphorothioate-og biotin-modifisert 5 "primer sett (tabell 1). Se tabell 3 for volumer å blande og konsentrasjoner.
  2. Umiddelbart etter at PCR er ferdig, tilsett 2 mL (20 enheter) av T7 exonuclease til hvert PCR rør (PCR buffer vil være tilstrekkelig for T7 reaksjon). Inkuber reaksjonen ved romtemperatur (~ 22-25 ° C) i 40 minutter.
  3. På slutten av denne inkubering, tilsett 12.5 mL 0,5 M etylen diamine tetraacetic acid (EDTA) pH 8,0 og bland. Dette gir totalt ~ 64.5μl av enkelt-strandet PCR produktet.

3. Hybridisering av enkelt-strandet PCR produkt til oligonukleotid-kombinert polystyren perler.

  1. Prewarm instrumentet til 60 ° C for å opprettholde hybridisering temperatur under analyse. Slå på plattformen varmeovnen med instrumentets programvare og være sikker på å bruke messing varme blokken som passer til PCR-stil plate som inneholder hybridisert perle blandingen.
  2. Resuspender mikrosfære Master Mix (steg 1,20) med en pipette, dispensere en passende mengde til en Eppendorf rør, lue røret, og sonicate i en waterbath sonicator i 2 minutter. Alternativt, for å sikre absolutt konsistens i perle resuspension kan mikrosfære mestre blandingen bli resuspendert av virvling og pipettering, deretter sonikator som ovenfor, så dispensing ønsket mengde til et polypropylen Eppendorf rør.
  3. Tilsett 17 mL av enkelt-strandet PCR produkt (trinn 2.2) i den aktuelle brønnene av en lav profil 96-godt termolomme PCR plate (tabell 2). Legg til 33 mL av resuspendert, sonciated perle blandingen til hver brønn. Dekk med silikon cover (tabell 2) og trykk forsiktig.
  4. Sett platen inn i thermocycler med et program for: 95 ° C i 5 min, 60 ° C i 10 min, 60 ° C hold, 60 ° C i 5 min, slutt. Start programmet.
  5. Lag friske streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) løsning, du vil trenge 25 mL per brønn (gjøre flere brønner ekstra). Gjør SA-PE-løsning ved å fortynne lager SA-PE (1 mg / ml) 01:50 til 20 mikrogram / ml med 1x Tetramethylammonium klorid (TMAC) buffer (3 M TMAC; 0,1% Sarkosyl, 50 mM Tris-HCl, 8,0 pH , 4 mM EDTA, 8,0 pH).
  6. Når thermocycler kommer til 60 ° C holde skritt,Åpne lokket, fjerner silikon dekselet og legg SA-PE-løsning direkte til hver brønn (IKKE ta platen ut av thermocycler). Sett på silikon cover, lukk thermocycler lokket og gjenoppta programmet.
  7. Når programmet er ferdig, ta platen ut og raskt overføre den til BioPlex maskin å lese. Plate må leses innen 10 minutter. Les ved 60 ° C; sikre at BioPlex har blitt forvarmet til denne temperaturen. Vær sikker på at sonden høyden er justert for å imøtekomme plate utnyttet, som beskrevet i brukerhåndboken for instrumentet brukes.
  8. For nøyaktig perle og signal deteksjon, må porten innstillingene på BioPlex være angitt i henhold til type mikrosfærer som brukes. BioRad isopor perler krever en port setting av 4,335-10,000 mens magnetisk mikrosfærer krever en innstilling på 5,000-25,000. Det er også mulighet for å kjøre plate med høy PMT innstillingen som øker reporter gain verdi. Dette kan jegncrease intensiteten av lavere signaler men det er viktig omfatte en egnet negativ kontroll som bakgrunn signal vil også bli økt.

Fire. Representative resultater:

Ett av våre mål å utvikle og implementere denne analysen var å gjøre det så enkelt og strømlinjeformet som mulig. Vi er derfor optimalisert kritiske post-forsterkning skritt, inkludert T7 exonuclease behandling tid og hybridisering tid for å utvikle en analyse som kan være ferdig i en rimelig tidsramme. Som vist i figur 2A, er T7 behandling av amplicon avgjørende for signal generasjon, som de fleste prober hadde liten eller ingen signal med kort eller ingen T7 behandling. Signalet økte lineært til cirka 40 minutter, hvor signalet økningen avtatt. Ingen degradering av signalet ble observert selv ved 2 timer T7 behandling tid, noe som indikerer at phosphorothioate modifisering av primere er svært effektive i å forebygge target strand degradering som beskrevet 15. Vi valgte 40 minutter for T7 behandling tid å minimere den totale protokoll tid, men det er klart av figur 2A som T7 behandling kan gå mye lenger. Vi har også bestemt effekten av hybridisering tid på signal generasjon (figur 2B) og fant at 10 minutter var tilstrekkelig for maksimal signal, var da ingen ytterligere økning i signal observert selv etter 4 timer hybridisering. Derfor ble en 10 minutters hybridisering steg valgt, igjen for å minimere den samlede analysen tid. Med disse resultatene i tankene, og med raske DNA-ekstraksjon teknikker som InstaGene (Bio-Rad), kan den generelle analysen, inkludert DNA-ekstraksjon, PCR, og Luminex analyse være ferdig i 4-5 timer.

På en advarende notat, kan nivået av aggregering av polystyren perler under en Luminex eller BioPlex kjøre ha stor innvirkning på effektiviteten av analysen. Den BioPlex programvaren vil vise nivået av bead aggregering, som oppstår nårmer enn én perle er oppdaget i laser banen og resultater i utelukkelse av hybridisering signalet fra aggregat. Tilsynelatende perle aggregering kan også være forårsaket av eventuelle partikler som ikke er riktig størrelse for en enkelt perle, og kan også være forårsaket av luftbobler. I noen av disse hendelsene, er signalet fra bead samlet, luftboble, eller partikkel kasseres. I de fleste tilfeller finner vi at perle aggregering er minimal (figur 3A) og målrettet nivået på 100 telle hendelser for hver perle er lett oppnåelig. Av og til, men perlene viser en moderat (Figur 3B) eller alvorlig (Figur 3C) nivå av aggregering. I disse tilfellene, siden det meste av dataene er forkastet, kan instrumentet har problemer med å nå 100 hendelser per perle type og resultatene kan være tvilsom. Det sonikator trinnet (trinn 3.2) er ment å minimere perle aggregering. I tillegg kan lagring av perler som en fortynnet mikrosfære mester mix (steg 1,20) hjelp. Vi har lagt merke til at eksklusive TMAC fra hybridization buffer - legge det til SA-PE fortynningsmiddel stedet (trinn 3.5) - bidrar til å minimere perle aggregering. Videre, mens vi ikke har testet dette, er de nyere magnetiske kuler tilgjengelig fra Luminex eller BioRad tenkt å vise mindre tendens til å aggregere.

Resultatene av anvendelsen av en 5-plex Luminex array targeting G. vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus, og L. gasseri sammen med tilsvarende Gram beiset vaginal vattpinne utstryk er vist i figur 4.. Disse prøvene ble tatt fra et enkelt individ på flere tidspunkter. Ved tid 0, var det enkelte diagnostisert med BV basert på Gram stain (figur 4A) og Luminex resultatene fra denne samme prøve (Figur 4B) viser at av organismene er representert i array, G. vaginalis var mest utbredt, mens A. vaginae og L. iners var også positive. Ni dager senere, var det enkelte fremdeles BV positive og Signal for G. vaginalis hadde økt betydelig, mens A. vaginae og L. iners var fortsatt positive. Viktigere, etter denne tid den enkelte begynte å gå over til en normal microbiota som Gram-positive staver ble påvist i utstryk (Figur 4A) mens signalet for G. vaginalis avtok og signalet for L. iners økt (Figur 4B). Ved vår opprinnelige definisjon av BV med denne metoden (prøver positive for G. vaginalis og / eller A. vaginae ble vurdert BV positive) 13, ble denne personen BV positive ved alle tidspunkter, selv om Gram flekken ikke klarte å oppdage G. vaginalis i sistnevnte to tidspunkter. Med Luminex metoden beskrevet her, kan trender lett sammenlignes med sekvensering-baserte metoder, og resultatene av Luminex analysen typisk bekrefte Gram beis 13 samtidig som det gir ytterligere informasjon om organismens identitet og overflod.

"Figur Figur 1. Skjematisk diagram av Luminex protokoll for å bestemme microbiota profilen av en kompleks klinisk eller miljømessige prøve. Protokollen starter med mal DNA som er ekstrahert fra prøven av interesse. (1) Generer PCR produktet fra mal DNA ved hjelp av tråd-spesifikke biotinylert, phosphorothioate-modifisert cpn60 UT PCR primere kombinert med umodifisert cpn60 UT PCR primere (Tabell 1), (2) Dette genererer et PCR produkt basseng representerer microbiota med biotin- phosphorothioate modifikasjon på en tråd, (3) Digest dobbel-strandet PCR produkt med T7 exonuclease, som ikke forringer phosphorothioate-modifiserte strand og derfor genererer enkelt-strandet DNA som er endret ved 5 'enden med biotin, (4) Par polystyren perler til artsspesifikk cpn60 UT sonder - hver perle har en unik spektral adresse (indikert med perle farge) som jege merkes av Luminex eller Bio-Plex instrument, (5) hybridize den single-strandet PCR produkt generert fra prøven av interesse for suite av artsspesifikke oligonukleotid-coupled perler, (6) Legg streptavidin-phycoerythrin konjugat som binder seg til den biotinylert single-strandet PCR produkt og fungerer som en indikator på hybridisering, (7) Bestem spektrale adresse (perle identitet) og hybridisering signal intensiteten ved hjelp av en Luminex eller Bio-Plex instrument. Minst 100 perler telles for hver perle identitet og median fluorescensintensitet (MFI) av phycoerythrin signalet er rapportert som output. Opp til 100 forskjellige perle typer kan evalueres samtidig, men en analyse som viser diskriminering av tre perle typene er illustrert. (8) Når MFI av PCR gjentak generert fra samme utvalget er betydelig større enn den negative kontrollen for en gitt perle (ensidige student t-test, p <0,05), er prøven anses å være positivt for den organisme.

Figur 2
Figur 2. Optimalisering av Luminex analysen parametere. Fem forskjellige prober rettet mot Peptostreptococcus anaerobius ble brukt med amplicons generert fra en blandet mal bestående av plasmider som inneholder klonet cpn60 UT på 20 bakterier kjent for å være assosiert med vagina, inkludert P. anaerobius. (A). Effekt av T7 exonuclease behandling tid. Protokollen beskrevet ovenfor ble fulgt, men tidspunktet for behandling med T7 exonuclease var variert før hybridisering og median fluorescensintensitet (MFI) ble bestemt for alle sonder. (B). Effekt av hybridisering tid. Protokollen beskrevet ovenfor ble etterfulgt med en rekke hybridisering ganger. Den samme sett av prober ble brukt med en amplicon generert fra samme mal som i A og median fluorescensintensitet (MFI) ble bestemt for alle sonder.

"> Figur 3
Figur 3. Fastsettelse av perle aggregering bruke BioPlex programvare. Tre eksempler er gitt av BioPlex går der nivået av perle aggregering er (A) akseptabelt (5%), (B) borderline (50%) og (C) uakseptabelt (80%).

Figur 4
Figur 4. Påføring av en 5-plex Luminex array til BV diagnose i sekvensiell prøver tatt fra samme individ. (A). Gram-farget lysbilder som viser tradisjonelle diagnostiske brukes til å vurdere hver prøve for BV. (B). Påføring av en 5-plex Luminex array forberedt og utført som beskrevet i denne protokollen til de samme fire prøvene vist i (A). Bakteriell mål som MFI signal var signifikant positiv med vår definisjon (ensidige student t-test, p <0,05) er markert med en asterisk (*).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spesifisiteten av signal generasjon er av avgjørende betydning, og du må være trygg på at signalet observert virkelig reflekterer påvisning av amplicon generert fra den organisme. Programvare som PrimerPlex (Premier Biosoft) kan bidra til å utforme sonder som skal hybridize effektivt, men de kan eller ikke kan kryss-hybridize til non-target arter. Når universell PCR primere brukes som beskrevet i denne protokollen, er det viktig å huske på at amplicon genererte representerer alle organismer til stede i prøven. Det er derfor viktig å analysere potensialet probes for muligheten for cross-hybridisering ved å sammenligne sekvenser foreslått av probe design software til cpnDB, en database over cpn60 UT sekvenser 16, prober som passer flere organismer skal unngås hvis mulig . Videre, når potensielt spesifikke prober er identifisert, har vi tatt en tilnærming til probe validering som en kompleks, kunstig template er forberedt tilsvarende den klonede cpn60 UT av en rekke organismer i forbindelse med microbiota av interesse 13. Amplicon er da genereres fra en fullstendig "mixed panel", inkludert målet mal, og signalet er i forhold til at generert fra en annen mal består av blandet panel som ikke inneholder målet organismens cpn60 UT. Prober som genererer en høy signal-til-støy-forhold (der signalet er generert fra hele panelet, og støyen er generert fra panelet uten mål mal) er valgt for inkludering i den endelige analysen. Vi har vanligvis analysert 4-5 mulig prober for hvert mål organisme før du velger en for inkludering i den endelige Luminex array.

Definisjonen av et positivt resultat er et problem å bli vurdert. Vi har funnet at ulike sonder har iboende forskjellige signal-til-støy-forhold, så vi bestemte på en tilnærming hvor et positivt resultat er defined av en veldig enkel statistisk test: studentens t-test (ensidige). Et positivt resultat er definert ved å sammenligne MFI av prøven til "ingen mal" kontroll, og når MFI er betydelig høyere enn kontrollgruppen ved p <0,05, er resultatet anses å være positivt for den organisme. Normalt to uavhengig generert amplicons er hver testet i duplikat. Selv om PCR og T7 exonuclease skritt skape ca 64,5 mL av enkelt-strandet PCR produkt (trinn 2,3) og bare 17 mL av dette er brukt for hybridisering (trinn 3,2), tilstrekkelig for 3 hybridisering analyser, vi vanligvis analyserer duplikater fra to presiseringer til gi en iboende tekniske replikeres uten å bruke et overdrevent antall brønner.

Et aspekt av denne analysen at vi har undersøkt er det semi-kvantitativ natur. Den MFI signal fra en gitt sonde korrelerer godt til qPCR-bestemmes overflod av en gitt organisme (Spearman rank korrelasjonskoeffisient & rho; = 0,4686, p <0,0001) 13, men det dynamiske området er begrenset, signalet en tendens til å mette på høyere mål organisme nivåer, som forventet ettersom amplicon er analysert etter end-point PCR på 40 sykluser. Fordi det er semi-kvantitative, kan trender i organismen overflod overvåkes og mønstre observert (holde påminnelse i tankene angående signal metning ved høyere Forekomsten). For eksempel viser figur 4 en profil av vaginal microbiota av en person over tid som det skifter fra BV til det normale. Ettersom dette skjer, signalet tilsvarer G. vaginalis (en BV-assosiert organisme 17) øker og deretter synker, mens i løpet av overvåkingen tid signalet for L. iners øker. Tilsvarende Gram flekker, den nåværende "gullstandarden" for BV diagnose, viser et mønster der Gram-positive staver er i utgangspunktet fraværende, men kan påvises ved senere tidspunkter. Den Luminex Metoden både identifiserer organismer til stede i prøven og gir some informasjon om deres relative hopetall. Denne typen informasjon kan potensielt brukes til å overvåke prøver av noen type for uønskede trender i Forekomsten av bestemte organismer og kan gi disse dataene for et stort antall organismer samtidig.

Viktigere er denne metoden ikke begrenset til profilering av vaginal microbiota og rimelighet kan brukes på alle miljøer der deteksjon og delvis kvantifisering av en rekke målorganismer er ønskelig. Ved bruk av metoden til andre miljøer, er det viktig å vurdere muligheten for PCR-hemming oppstår, som hemmere av PCR vanlig co-renser med DNA fra mange miljøer 18 år. Hvor PCR hemming er et problem, kan prøven enten bli utvannet eller videre renset for å generere tilstrekkelig signal for denne analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker Alberto Severini og Vanessa Goleski for hjelp med analysen utvikling og kritiske kommentarer til dette manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av Public Health Agency of Canada og Industrial Research Assistance Program (National Research Council of Canada). Ekstra støtte ble hentet fra University of Saskatchewan Publication fondet.

References

  1. Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
  2. Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
  3. Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. Bacterial vaginosis: a public health review. Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).
  4. Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women's susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms. Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).
  5. Wilson, J. Managing recurrent bacterial vaginosis. Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).
  6. Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).
  7. Ison, C. A., Hay, P. E. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics. Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).
  8. Money, D. The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).
  9. Schellenberg, J. Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).
  10. Spear, G. T. Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).
  11. Brotman, R. M., Ravel, J. Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis. Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).
  12. Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).
  13. Dumonceaux, T. J. Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres. J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).
  14. Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics. J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).
  15. Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization. PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).
  16. Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. cpnDB: A Chaperonin Sequence Database. Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).
  17. Bradshaw, C. S. The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy. J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).
  18. Dumonceaux, T. J. Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target. J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).

Comments

1 Comment

  1. We should prepare one about detection of phytoplasmas ! ;)

    Reply
    Posted by: Edel P.
    May 13, 2014 - 2:45 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics