Author Produced

Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanarak bir örnek içinde mikroorganizmaların tespiti için çoklama yöntemi açıklar. Bir örnek içindeki tüm organizmalar Amplikon bir panel prob-çiftli boncuk melezleşmiştir. LUMINEX veya Bio-Plex enstrüman, boncuk, boncuk türü ve hibridizasyon sinyali için her bir sorgu için kullanılır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dumonceaux, T. J., Town, J. R., Hill, J. E., Chaban, B. L., Hemmingsen, S. M. Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres. J. Vis. Exp. (56), e3344, doi:10.3791/3344 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bakteriyel vajinozis (BV), "normal" Mikrobiyota Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae de dahil olmak üzere çok sayıda bakteri türlerinin hakim olduğu bir Mikrobiyota Lactobacillus-egemen, ve diğerleri 1-3 bir değişiklik ile karakterize tekrarlayan polimikrobiyal bir sendromdur. Bu durum, HIV satın alma 4 de dahil olmak üzere, olumsuz sağlık sonuçları, bir dizi ile ilişkili olup, klinik olarak 5 yönetmek için zor olabilir. Ayrıca, BV tanısı, çeşitli sayısal kriterleri 6,7 puan vajinal sürüntü smear Gram boyama güvendi . Bu tanı, basit, ucuz ve kaynak sınırlı ayarları iyi uygun olmasına rağmen, sübjektif ve vajinal Mikrobiyota 8 kompozisyon ayrıntılı bir profilini vermez sorunları muzdarip olabilir. Yeni derin sıralama çabaları ile zengin, çeşitli vajinal Mikrobiyota ortaya koymuşturbir dizi BV 11,12 moleküler tanı için potansiyel hedefler belirlenmesi sonuçlandı Normal 9,10 olarak bireylere kıyasla BV tanısı kişilerden alınan örnekler arasında belirgin farklılıklar. Bu çalışmalar yararlı bilgiler bir zenginlik var, ama derin sıralama henüz klinik bir ortamda bir tanı yöntemi olarak pratik değildir. Biz son zamanlarda hızla LUMINEX platformu 13 algılama oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanılarak, çok katlı bir biçimi vajinal Mikrobiyota profil için bir yöntem tanımlanmıştır. Bu yöntem, mevcut Gram boyama tabanlı yöntemler gibi basit ve hızlı ama prob tasarım çalışmaları sıralama kaynaklanan moleküler bilgi sömürmek için ek bir avantaj katıyor. Bu yöntem, bu nedenle, BV, spesifite ve duyarlılığı yüksek comp ile teşhis etmek için kullanılabilecek bir vajinal sürüntü bulunan önemli mikroorganizmalar profil bir yol sağlaryarı-kantitatif ve hızlı bir şekilde türlerin varlığı ve bolluk hakkında ek bilgi sağlarken Gram boyama ared. Bu çoklama yöntemi, şu anda tek bir örnek 14 5 veya 6 farklı deneyleri ile sınırlı belirli organizmalar için geçerli kantitatif PCR testleri aralığının dışında genişletilebilir. Önemlisi, bu yöntem vajinal bezlerden bakteri tespit sınırlı değil ve hızla ilgi hemen hemen her mikrobik bir topluluk profil kolayca adapte edilebilir. Örneğin, son zamanlarda, atıksu arıtma tesislerinde kullanım için tanı araçları geliştirme metodolojisini uygulamak için başladı.

Protocol

Bu yöntem Dumonceaux ark bildirilen araştırma kullanılmıştır. J. Clin. Microbiol 47, 4067-4077, DOI: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

Genel prosedürü anlatan şematik diyagramı Şekil 1'de sunulmaktadır.

1. Boncuk kaplin

(Bkz. Tablo 2) polistiren LUMINEX boncuk oligonükleotid problar kaplin için kullanılacak yöntemler açıklanmıştır. Hacimler yeni yakalama probları bir deneme olarak değerlendirilmesi için biraz adapte; bu miktarlar parantez içinde belirtilmiştir.

  1. -20 ° C desikatöre 1-Etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) toz çıkarın ve oda sıcaklığına kadar sıcak.
  2. , Daha sonra yaklaşık 20 saniye karıştırın, 20 saniye boyunca bir su banyosunda sonikatör sonciation mikroküreler tekrar
  3. (5x10 6 veya 1.25x karşılık gelen bir Eppendorf tüpüne Transfer ul mikroküre 400 (100 ul)10 6 mikroküreler). LUMINEX tüpler yapışmasını ve boncuk kurtarma ile müdahale Kuplajsız boncuk önlemek için düşük protein bağlama mikrosantrifüj tüpleri (örneğin Eppendorf Protein LoBind tüpler, katalog numarası 0030 108,094) kullanılmasını önerir. Bunu biz genellikle standart polipropilen mikrosantrifüj tüpleri, (örn. VWR katalog sayısı 87.003-298) kullanılarak bir sorun bulamadı.
  4. Pelet az 1 dakika süreyle 14000 xg. Süpernatantı çıkarın ve atın.
  5. Ethanesulfonic asit (MES), pH 4,5 - (N-morfolino) oda sıcaklığında 0,1 M 2 50 ul mikroküreler (12,5 ul) tekrar
  6. 10 mg / ml su EDC taze bir çözüm hazırlayın.
    1. Sonra 10 mg / ml su ekleyerek, analitik bir ölçekte EDC 5-10 mg ağırlığındaki bu çözümün en az 1 ml hazırlayın.
  7. 5'-amino C12 modifiye yakalama mikroküreler oligonükleotid (Tablo 2) ve vorteks karışım 1 nmol ekleyin. 1 nmol 200 mcM oligo 5 ulnükleotid.
  8. 5 saniye boyunca karıştırın mikrosferler ve karışık taze EDC çözüm 2,5 ul ekleyin.
  9. Karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  10. EDC çözüm atın (adım 1.6) ve (adım 1.6) yukarıdaki gibi suda 10 mg / ml EDC taze bir örnek hazırlamak.
  11. 5 saniye süreyle mikroküreler ve vorteks taze EDC çözüm başka bir 2.5 ul ekleyin.
  12. Karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  13. % 0.02 Tween 20 1 ml ekleyerek boncuk yıkayın. Boncuklar tekrar süspansiyon Vortex (isteğe bağlı olarak 20 saniye sonikasyon).
  14. 14000 xg 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve atın.
  15. % 0,1 sodyum dodesil sülfat (SDS) 1 ml ekleyerek boncuk tekrar yıkayın. Boncuklar tekrar süspansiyon Vortex (isteğe bağlı olarak 20 saniye sonikasyon).
  16. 14000 xg 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve atın.
  17. 100 ul (25 ul) Tris-EDTA (TE) tampon [10 m boncuk süspanse edinM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8,0].
  18. Stok konsantrasyonunu belirlemek için bir haemocytometer veya Coulter sayacı boncuk numaralandırmak.
  19. Her boncuk 100 boncuk / ul TE tampon bir son konsantrasyona seyreltilmesi Microsphere Master Mix hazırlayın. Havuzu testinin istenen karmaşık (örneğin 10-karmaşık bir tahlil için, her boncuk 100/μl bir nihai konsantrasyonu 10 farklı birleştiğinde boncuk karışımı) karşılık gelen boncuklar birleştiğinde.
  20. 4 Microsphere Master Mix Mağaza ° C karanlıkta. Eğer bu koşullar altında tutulur karışımı ay boyunca saklanabilir.

2. Chaperonin 60 evrensel hedef tek iplikçikler Amplikon üretim ve üretim (cpn60 UT).

  1. Her bir örnek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürün üretin. Phosphorothioate ve biyotin modifiye 5 'astar seti (Tablo 1) ekleyin. Tablo 3 karıştırmak için hacimleri ve konsantrasyonları için Bkz.
  2. PCR işlemi tamamlandıktan hemen sonra, 2 T7 ex ul (20 adet)her PCR tüpü (PCR tampon T7 reaksiyon için yeterli olacaktır) onuclease. Reaksiyon oda sıcaklığında inkübe (~ 22-25 ° C) 40 dakika.
  3. Bu inkübasyon sonunda, 0,5 M etilen 12.5 ul eklemek tetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 ve karıştırın diamine. Bu tek iplikli PCR ürün ~ 64.5μl bir toplam verir.

3. Oligonükleotid çiftli polistiren boncuklar tek iplikli PCR ürün Hibridizasyon.

  1. 60 Prewarm alet ° C, analiz sırasında hibridizasyon ısısını korumak için. Platformu ısıtıcı cihazın yazılımını kullanarak açın ve melezleşmiş boncuk karışımı içeren PCR tarzı plaka uygun pirinç ısıtma bloğu kullandığınızdan emin olun.
  2. Bir pipet yardımıyla yeniden süspanse Microsphere Master Mix (adım 1.20), Eppendorf tüpe uygun bir miktar vazgeçmek kap tüp ve su banyosunda sonikatör 2 dakika boyunca sonikasyon. Alternatif olarak, boncuk resuspe mutlak tutarlılık sağlamak içinnsion, Microsphere ana karışımı, sonra bir polipropilen Eppendorf tüp içine istenilen miktarda dağıtılması, yukarıdaki gibi sonication vorteks ve, sonra pipetleme yeniden süspanse edilebilir.
  3. 17 ul tek iplikli PCR ürünü (adım 2.2) düşük profilli 96-iyi termo PCR plate (Tablo 2) uygun kuyu içine koyun. Her bir kuyunun 33 ul yeniden süspanse sonciated boncuk karışımı ekleyin. Silikon kapak (Tablo 2) ile kaplayın ve hafifçe dokunun.
  4. Bir program ile PCR plaka koyun: 5 dk, 10 dk, 60 ° C - 95 ° C - 60 ° C tutun, 60 ° C de 5 dakika, son. Programı başlatın.
  5. Streptavidin fikoeritrin (SA-PE) çözümü taze olun; (ekstra birkaç kuyu olun) ortalama 25 ul gerekecektir. % 0.1 Sarkosyl; 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 stok SA-PE (1 mg / ml), 1x tetramethylammonium klorür (TMAC) tampon (3 M TMAC 01:50 20 mg / ml seyreltilmesiyle SA-PE çözüm olun 4 mM EDTA, pH 8.0).
  6. Termalcycler 60 ° C tutun adım alır.kapağı açın, silikon kapak ve her iyi (PCR plaka dikkate almayınız) SA-PE doğrudan çözüm eklemek kaldırmak. Silikon kapağını yerine takın PCR kapağını kapatın ve program kaldığı yerden devam.
  7. Program tamamlandığında, plaka ve hızlı bir şekilde okumak için Bioplex makineye aktarmak. Plaka 10 dakika içinde okumak gerekir. 60 ° C'de okuyun; Bioplex bu sıcaklık prewarmed olduğundan emin olun. Prob yükseklik olarak kullanılan araç için kullanım kılavuzuna açıklanan kullanılan plaka, uyum sağlamak için ayarlanabilir edildiğine emin olmak.
  8. Bioplex kapı ayarlarını doğru boncuk ve sinyal tespiti için, kullanılan mikroküreler türüne göre ayarlanmış olmalıdır. Manyetik mikroküreler 5,000-25,000 bir ayar gerektiren BioRad polistiren boncuklar 4,335-10,000 bir kapı ayarı gerektirir. Plaka muhabiri kazanç değerini artırır Yüksek PMT ayarını kullanarak çalışan seçeneği de vardır. Bu i canArtış düşük sinyallerin yoğunluğunu ancak önemli arka plan sinyali artacaktır uygun bir negatif kontrol içerir.

4. Temsilcisi sonuçları:

Geliştirilmesi ve uygulanması bu testte amaçlarından biri, mümkün olduğunca basit ve düzenli olarak bunu yapmak için. Bu nedenle makul bir zaman çerçevesi içinde tamamlanabilir bir test geliştirmek için T7 eksonükleaz tedavi süresi ve hibridizasyon süresi de dahil olmak üzere, kritik amplifikasyon sonrası adımları optimize edilmiş. Şekil 2A gösterildiği gibi, Amplikon T7 tedavisi çoğu probları T7 tedavi ile kısa ya da çok az ya da hiç sinyal olduğu gibi, sinyal üretimi için esastır. Sinyal sinyal artışı yavaşladı, hangi zamanda, yaklaşık 40 dakika kadar doğrusal bir artış göstermiştir. Primerlerin phosphorothioate değişiklik küçük kalkan önlenmesinde son derece etkili olduğunu gösteren sinyal hiçbir bozulma, T7 tedavi süresi 2 saat bile gözlendit iplikçik bozulması 15 nitelendirdi. Biz genel protokol süresini en aza indirmek için T7 tedavi süresi için 40 dakika seçti, ama T7 tedavi çok daha uzun süre devam edebilir Şekil 2A açıktır. Ayrıca sinyal nesil (Şekil 2B) hibridizasyon zaman etkisi belirlenir ve 10 dakika maksimum sinyal için yeterli olduğunu, melezleşme 4 saat sonra bile sinyal daha fazla artış gözlendi. Bu nedenle, genel test süresini en aza indirmek için 10 dakika hibridizasyon adım tekrar seçildi. Göz önünde bulundurarak, InstaGene (Bio-Rad) gibi hızlı DNA ekstraksiyon teknikleri ile bu sonuçlar ile, DNA ekstraksiyonu, PCR, ve LUMINEX analizleri de dahil olmak üzere genel bir tahlil, 4-5 saat içinde tamamlanabilir.

Dikkat edilmesi gereken bir nokta, bir LUMINEX veya Bioplex çalışması sırasında polistiren boncuklar agregasyonunun düzeyi testin verimliliği üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir. Bioplex yazılımı oluşur boncuk kümeleme seviyesi gösterecektirBirden fazla boncuk lazer yolu ve agrega hibridizasyon sinyali dışlama sonuçları tespit edilmiştir. Görünür boncuk agregasyon tek bir boncuk için uygun boyutta olmayan herhangi bir partikül madde neden olabilir ve hatta hava kabarcıkları neden olabilir. Bu olaylar herhangi bir boncuk agrega, hava kabarcığı veya partikül sinyal atılır. Çoğu durumda, biz o boncuk agregasyonu az (Şekil 3A) ve her boncuk için 100 sayma olayların hedeflenen düzeyin kolayca ulaşılabilir. Bununla birlikte, bazen boncuk, orta (Şekil 3B) ya da şiddetli bir agregasyon (Şekil 3C) düzeyi göstermektedir. Bu durumlarda, verilerin çoğu atılır, cihaz 100 boncuk tipine göre olaylar ve sonuçları ulaşmada sorun tartışmalı olabilir olabilir. Sonication adım (adım 3.2) boncuk agregasyonu en aza indirmek içindir. Buna ek olarak boncuk, seyreltilmiş Microsphere ana karışımlar (adım 1.20) olarak saklamak yardımcı olabilir. Biz hybri, bu hariç TMAC fark vardization tampon yerine SA-PE seyreltici (adım 3.5) ekleyerek boncuk agregasyonu en aza indirmek için yardımcı olur. Ayrıca, bu test değil ise, LUMINEX veya BioRad yeni manyetik boncuk agrega için bir eğilim daha az göstermek için düşünülmektedir.

G. hedefleyen bir 5-karmaşık LUMINEX dizi uygulama sonuçları vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus, ve L. ilgili Gram boyanan çubukla vajinal smear ile birlikte gasseri Şekil 4'te gösterilmiştir. Bu örnekler, tek bir bireyin birden fazla zaman noktalarında alınmıştır. 0 zamanında, bireysel Gram boyama dayalı BV tanısı (Şekil 4A) ve dizi, G. temsil edilen organizmaların bu aynı örnek LUMINEX sonuçları (Şekil 4B) gösterisi vaginalis, en yaygın iken A. vaginae ve L. iners da pozitifti. Dokuz gün sonra, bireysel hala BV pozitif ve sG. için ignal vaginalis önemli ölçüde artmıştır ise A. vaginae ve L. iners hala pozitifti. Gram pozitif basil smear saptanabilir oldu önemlisi, G. için sinyal ise, bu süreden sonra bireysel (Şekil 4A), normal bir Mikrobiyota geçiş başladı vaginalis azaldı ve L. için sinyal iners (Şekil 4B) artmıştır. Gram G. algılamak için başarısız leke rağmen, bu yöntem (BV pozitif olarak kabul edildi G. vaginalis ve / veya A. vaginae için olumlu örnekleri) 13 BV orijinal tanımı olarak, bu birey, tüm zaman noktalarında olumlu BV Son iki zaman noktalarında vaginalis. Burada anlatılan LUMINEX yöntemi ile, eğilimleri kolayca sıralama tabanlı yöntemlerle karşılaştırıldığında olabilir ve organizma kimliğini ve bolluk hakkında ek bilgi sağlarken LUMINEX testinin sonuçları genellikle Gram boyama 13 doğrulamak.

Şekil 1 LUMINEX karmaşık bir klinik ya da çevresel örnek Mikrobiyota profili belirlemek için protokol şematik. Protokol ilgi örnekten elde edilmiştir DNA ile başlar. (1) kullanarak DNA PCR ürünü oluşturun iplikçik özel biotinlenmiş, değiştirilmemiş cpn60 UT PCR primerleri (Tablo 1) ile birleştiğinde phosphorothioate modifiye cpn60 UT PCR primerleri; (2) Bu Mikrobiyota temsil eden bir PCR ürünü havuzu oluşturur biotin bir iplikçik üzerinde değişiklik phosphorothioate; (3) phosphorothioate modifiye iplikçik düşürebilir ve bu nedenle tek iplikli DNA biotin 5 'sonunda güncellenmiştir oluşturur T7 eksonükleaz, çift zincirli PCR ürününün Digest; (4) Çift türe özgü cpn60 UT probları polistiren boncuklar her boncuk eşsiz bir spektral adresi (boncuk renk ile gösterilen) bu iLUMINEX veya Bio-Plex alet tarafından ayırt edilebilir (5) faiz örnek türe özgü oligonükleotid çiftli boncuk paketi için oluşturulan tek iplikli PCR ürünü melezleşme; (6) bağlanır streptavidin fikoeritrin konjuge ekle biotinlenmiş tek iplikli PCR ürünü ve melezleşme bir göstergesi olarak görür; (7) bir LUMINEX ya da Bio-Plex alet kullanarak spektral adresi (boncuk kimlik) ve hibridizasyon sinyal yoğunluğu belirler. En az 100 boncuk boncuk her kimlik için sayılır ve fikoeritrin sinyal ortalama floresan yoğunluğu (MFI) çıktı olarak rapor edilir. 100 farklı boncuk türleri için aynı anda değerlendirilebilir ancak üç boncuk türleri ayrımcılık gösteren bir tahlil gösterilmiştir. (8) PCR MFI aynı örnekten üretilen çoğaltır zaman (tek-kuyruklu öğrenci Kullanıcı t-testi, p <0.05) bir verilen boncuk negatif kontrolü göre önemli ölçüde daha fazla olduğunu, örnek bu organizma için pozitif olması için kabul edilir.

Şekil 2
Şekil 2 LUMINEX tahlil parametreleri optimizasyonu. Beş farklı prob Peptostreptococcus anaerobius hedefleyen P. de dahil olmak üzere klonlanmış cpn60 UT vajina ile ilişkili olduğu bilinen 20 bakteri içeren plazmid oluşan karışık bir şablondan oluşturulan amplikonlarının kullanıldı anaerobius. (A). T7 eksonükleaz tedavi süresi Etkisi. Yukarıda açıklanan protokol izledi ama T7 eksonükleaz ile tedavi süre önce hibridizasyon ve medyan floresan yoğunluğu (MFI) tüm problar için belirlenen değişmekteydi. (B). Hibridizasyon zaman Etkisi. Yukarıda açıklanan protokol çeşitli hibridizasyon kez izledi. A ve tüm problar için medyan floresan yoğunluğu (MFI) olarak tespit edilmiştir aynı şablondan oluşturulan bir Amplikon probları aynı setleri kullanıldı.

"> Şekil 3
Şekil 3 Bioplex yazılım kullanarak boncuk agregasyonunun belirlenmesi. Üç örnekleri boncuk agregasyon seviyesi (A) kabul edilebilir (% 5) olduğu Bioplex çalışır verilmiştir; (B) borderline (% 50) ve (C) kabul edilemez (% 80).

Şekil 4
Şekil 4 BV tanısı, aynı kişiden alınan sıralı numuneler 5-karmaşık LUMINEX dizi Uygulama . (A). BV her numune değerlendirmek için kullanılan geleneksel teşhis gösteren Gram-lekeli slaytlar. (B). Uygulama 5-karmaşık LUMINEX dizi hazırlanmış ve bu protokol (A) gösterilen aynı dört örnek açıklandığı gibi yürütülür. MFI sinyal Bakteriyel hedefler bizim tanımı (tek kuyruklu Student t-testi, p <0.05) bir yıldız (*) ile gösterilir anlamlı pozitif oldu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Özgüllük sinyal nesil kritik öneme sahiptir; sinyal gerçekten, o organizmanın elde Amplikon tespiti yansıtan gözlenen emin olmak gerekir. Yazılım PrimerPlex (Premier Biosoft) gibi verimli bir melezleşme olan problar tasarım için yardımcı olabilir, ancak kendilerinin veya hedef olmayan türler çapraz melezleşme değil olabilir. Bu protokol evrensel PCR primerleri açıklandığı gibi kullanıldığı zaman, üretilen Amplikon örnek mevcut organizmaların tümünü temsil ettiğini akılda tutmak önemlidir. CpnDB cpn60 UT dizilerinin bir veritabanı 16 prob tasarım yazılımı tarafından önerilen dizileri karşılaştırılarak, çapraz hibridizasyon olasılığı için potansiyel probları analiz etmek, bu nedenle önemli; birden fazla organizmalar maç probları kaçınılmalıdır mümkünse . Ayrıca, potansiyel olarak spesifik problar tanımlanır, biz doğrulama prob bir yaklaşım almış olan karmaşık bir yapay template ilgi (13) Mikrobiyota ile ilişkili organizmaların çok sayıda klonlanmış cpn60 UT karşılık hazırlanmıştır. Amplikon hedef şablon da dahil olmak üzere tam bir "karma paneli", daha sonra üretilen ve sinyal hedef organizmanın cpn60 UT içermez karışık panel oluşan ikinci bir şablondan oluşturulan göre. Yüksek sinyal-gürültü oranı (sinyal panelinden oluşturulur ve gürültü hedef şablonu olmadan panel oluşturulur) üreten Probları, son tahlil dahil için seçilir. Biz genellikle son LUMINEX dizi dahil birini seçmeden önce her bir hedef organizma için 4-5 olası probları analiz ettik.

Olumlu bir sonuç tanımı dikkate alınması gereken bir konudur. Biz farklı prob doğası gereği farklı sinyal-gürültü oranı olduğunu bulduk, bu yüzden pozitif bir sonuç defin sayede bir yaklaşım karar verdiöğrenci t-testi (tek uçlu): çok basit bir istatistik testi ed. Pozitif sonuç, "şablon" kontrolü için numune MFI karşılaştıran ile tanımlanır ve MFI, p <0.05 kontrol anlamlı derecede daha yüksek olduğunda, sonuç bu organizma için pozitif olarak kabul edilir. Normalde iki bağımsız olarak üretilen amplikonlarının her iki nüsha halinde test. PCR ve T7 eksonükleaz adımları tek iplikli PCR ürün hakkında 64.5 ul (2.3 adım) oluşturmak ve bu sadece 17 ul yeterli hibridizasyon (adım 3.2), 3 hibridizasyon deneyleri için kullanılmasına rağmen, biz normalde iki ilâvelerle çiftleri analiz kuyularının aşırı numarasını kullanarak doğal olmayan bir teknik çoğaltmak verir.

Araştıran bu testin bir yönü, onun yarı-kantitatif doğası. Belirli bir prob MFI sinyali belirli bir organizmanın qPCR belirlenen bolluk (Spearman korelasyon katsayısı r koreledirho; = 0,4686, p <0.0001) 13, ancak dinamik aralığı sınırlıdır; sinyal Amplikon son nokta PCR 40 döngü sonra analiz beri beklendiği gibi yüksek bir hedef organizma seviyelerinde doyurmak için eğilimindedir. Yarı-kantitatif olduğundan, organizmanın bol miktarda trendleri takip edilebilir ve desenler (yüksek miktarlara sinyal doygunluğu ile ilgili akılda tutulması ihtar) gözlemlenmiştir. Örneğin, Şekil 4, normal BV'dan değişiklikler olarak zaman içinde bireyin vajinal Mikrobiyota bir profil göstermektedir. Bu gerçekleşirse G., sinyal ilgili sonra vaginalis (BV-ilişkili bir organizma 17) artar, azalıyor L. için sinyal izleme süresi ders üzerinde iners artar. Sorumlu Gram boyama, BV tanısı için "altın standart", Gram pozitif basil başlangıçta bulunmadığına, ancak daha sonraki zaman noktalarında algılanamaz sayede bir model göstermektedir. LUMINEX yöntemi örnek mevcut organizmaların tanımlar ve s verir hembağıl bollukları azı bilgi. Bu tür bilgiler potansiyel olarak belirli organizmaların bollukları istenmeyen eğilimler için herhangi bir tür örnekleri izlemek için ve aynı anda çok sayıda organizmalar için bu veriler sağlayabilir olabilir.

Daha da önemlisi, bu yöntem vajinal Mikrobiyota profil sınırlı değildir ve makul olduğu bir dizi hedef organizmaların tespiti ve kısmi kantifikasyon arzu herhangi bir ortamda uygulanabilir. Diğer ortamlara yöntemi uygularken, bu yaygın olarak pek çok ortamlarda 18 DNA ile birlikte-purify PCR inhibitörleri gibi, PCR inhibisyonu oluşma olasılığı dikkate almak önemlidir. PCR inhibisyonu bir sorun olduğunda, örnek bu testte için yeterli sinyal üretmek için ya seyreltilmiş ya da daha fazla arıtılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Alberto Severini ve Vanessa Goleski tahlil geliştirme ve bu yazının üzerine eleştirel yorumlar yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma, Kanada Halk Sağlığı Ajansı ve Endüstriyel Araştırma Destek Programı (Kanada Ulusal Araştırma Konseyi) tarafından finanse edildi. Saskatchewan Üniversitesi Yayın Fonu Ek destek elde edildi.

References

  1. Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
  2. Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
  3. Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. Bacterial vaginosis: a public health review. Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).
  4. Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women's susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms. Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).
  5. Wilson, J. Managing recurrent bacterial vaginosis. Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).
  6. Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).
  7. Ison, C. A., Hay, P. E. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics. Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).
  8. Money, D. The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).
  9. Schellenberg, J. Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).
  10. Spear, G. T. Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).
  11. Brotman, R. M., Ravel, J. Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis. Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).
  12. Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).
  13. Dumonceaux, T. J. Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres. J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).
  14. Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics. J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).
  15. Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization. PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).
  16. Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. cpnDB: A Chaperonin Sequence Database. Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).
  17. Bradshaw, C. S. The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy. J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).
  18. Dumonceaux, T. J. Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target. J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).

Comments

1 Comment

  1. We should prepare one about detection of phytoplasmas ! ;)

    Reply
    Posted by: Edel P.
    May 13, 2014 - 2:45 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics