समाई माप पैच दबाना और Ca 2 +

Neuroscience

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Summary

यहाँ हम अगर एम्बेडेड रेटिना स्लाइस कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और सीए 2 + इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. यह विधि एक एकल presynaptic तंत्रिका टर्मिनलों के प्रत्यक्ष पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग रेटिना microcircuits में रिबन प्रकार synapses का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है.

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Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices. J. Vis. Exp. (59), e3345, doi:10.3791/3345 (2012).

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Abstract

Protocol

1. बाहरी और आंतरिक समाधान

  1. 10x शेयर समाधान से टुकड़ा करने की क्रिया समाधान (कम कैल्शियम) तैयार है और MgCl 2, 2 CaCl, और डी ग्लूकोज दैनिक जोड़ने . 119 NaCl, 2.5 KCl, 3.2 2 MgCl, 0.25 CaCl 2, 12 डी ग्लूकोज, 0.2 एल ascorbic एसिड, 12 HEPES: अंतिम 1x समाधान (मिमी) के होते हैं. 7.4 (NaOH के साथ) पीएच सेट, और 260 mOsm (एच 2 हे और 10x स्टॉक समाधान का उपयोग) osmolarity समायोजित .
  2. 3% कम बीच बढ़िया तालमेल तापमान अगर वजन (agarose प्रकार सातवीं ए, A0701, सिग्मा, Rieke, 2001) और समाधान टुकड़ा करने की क्रिया के साथ मिश्रण. 1-2 मिनट के लिए माइक्रोवेव में अगर युक्त समाधान हीट, या जब तक यह पूरी तरह घुल, और नहाने के पानी (30-33 डिग्री सेल्सियस) में अगर सेते तेजी solidification (जेल संक्रमण तापमान को रोकने: 26 2 ± ° सी).
  3. 10x शेयर समाधान से रिकॉर्डिंग समाधान (सामान्य कैल्शियम) तैयार है और MgCl 2, 2 CaCl, और डी ग्लूकोज दैनिक जोड़ने . अंतिम 1x समाधान निरंतरताके टीएस (मिमी): NaCl 100, 2.5, KCl 1 2 MgCl, 25 NaHCO 3, 0.2 एल ascorbic एसिड, 2.5 2 CaCl, 12 डी ग्लूकोज . हे 2 / 5% 2 5-10 मिनट के लिए सीओ (carbogen), 95% में समाधान बुदबुदाती के बाद 7.4 (NaOH के साथ) पीएच सेट, और 260 mOsm (एच 2 हे और 10x स्टॉक समाधान का उपयोग) osmolarity समायोजित.
  4. Aliquots आंतरिक विंदुक समाधान के (1 मिलीलीटर प्रत्येक) अग्रिम में तैयार कर रहे हैं और एक फ्रीजर (-20 डिग्री सेल्सियस) में संग्रहीत. दो आंतरिक विंदुक समाधान आमतौर पर द्विध्रुवी सेल कैल्शियम धाराओं (मिमी में) को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है:
    1. CSCL 40, Cs-gluconate 60, 10 (चाय) tetraethylammonium - सीएल, 28 HEPES, 3 मिलीग्राम एटीपी, एक ना - GTP, और 2 EGTA. पीएच 7.2 (CsOH साथ) के लिए समायोजित करें और osmolarity 250 mOsm करने के लिए सेट. यह उच्च क्लोराइड आंतरिक समाधान -60 एम वी के एक द्विध्रुवी सेल आराम झिल्ली क्षमता पर आम तौर पर कम श्रृंखला प्रतिरोध (बेहतर वोल्टेज क्लैंप शर्तों) रिकॉर्डिंग और बड़ा निरोधात्मक postsynaptic धाराओं (IPSCs) प्रदान करता है.
    2. 95 CS-gluconate, 10 चाय - सीएल, 25 HEPES, 3 मिलीग्राम एटीपी, 0.5 ना-GTP, और EGTA 0.5. 7.2 (CsOH साथ) पीएच को समायोजित, और 250 22 mOsm osmolarity सेट . यह कम EGTA आंतरिक समाधान आमतौर पर उच्च झिल्ली समाई कदम दालों depolarizing द्वारा हासिल परिवर्तनों की ओर जाता है है और इस तरह पुटिका पूल रिक्तीकरण और अल्पकालिक अवसाद के अध्ययन की अनुमति देता है.

2. पैच दबाना विंदुक इलेक्ट्रोड

  1. तैयार मोटी दीवारों (1.5 मिमी बाहरी व्यास) borosilicate (1B150F-4, विश्व परिशुद्धता उपकरण, Sarasota, FL) कांच और खींच पैच pipettes एक ऊर्ध्वाधर खींचने (Narishige PP830, टोक्यो, जापान) का उपयोग. ओपन टिप पैच रिकॉर्डिंग समाधान में पिपेट resistances 7-8 MΩ जब विंदुक आंतरिक विंदुक समाधान # 1 के साथ भरा है.
  2. कोट समान रूप से पैच - विंदुक टिप से शाफ्ट कि दंत मोम के साथ विंदुक धारक (Cavex, पश्चिम Chester, PA) तक पहुँच के स्तर है. यह विंदुक समाई और बिजली के शोर को कम करने और सक्षम हो जाएगाऔर अधिक सटीक और कम शोर समाई माप. एक कम विंदुक समाई भी ईपीसी (या ईपीसी 10) पैच दबाना एम्पलीफायर-9 के इलेक्ट्रॉनिक सी - तेजी से (तेजी समाई) मुआवजा मदद करता है.

3. अगर एम्बेडेड रेटिना स्लाइस की तैयारी

  1. तमोनुकूलन के 30 मिनट के लिए एक अंधेरे कमरे में एक कवर बाल्टी में और जगह, एक सुनहरीमछली (8-16 सेमी Carassius auratus) का चयन करें. संज्ञाहरण के बाद, त्वरित कत्ल और रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क स्टेम डबल pithing द्वारा बेहोश सुनहरीमछली euthanize. फिर घुमावदार टिप कैंची और चिमटी घुमावदार टिप के साथ आंखों को हटा दें. इन प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और Oregon स्वास्थ्य एवं विज्ञान विश्वविद्यालय में प्रयोग करें समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया.
  2. वसंत कैंची (15003-08, ठीक विज्ञान के उपकरण, कैंची सुझावों के साथ puncturing द्वारा आरंभ कटौती) के साथ आंखों के सामने के आसपास समान रूप से काटने से हर आंख Hemisect, और ठंडा टुकड़ा समाधान (कम कैल्शियम) में eyecups जगह. यदि necessary, चिमटी (लेंस आमतौर पर आंखों के सामने के साथ अलग होगा) के साथ लेंस को हटा दें. रेटिना वर्णक उपकला eyecup से दूर रेटिना छील 45 ° angled टिप ठीक संदंश (11251-35, ललित विज्ञान उपकरण) की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए, धीरे धीरे पूर्ण 360 डिग्री के आसपास प्रगति से जुड़ी के साथ निकालें. या तो ठीक संदंश या वसंत कैंची के साथ ऑप्टिक तंत्रिका तोड़ या कटौती. Angled ठीक टिप संदंश और चूषण से लागू संशोधित पाश्चर विंदुक या हस्तांतरण विंदुक (बड़े टिप) का एक संयोजन के साथ रेटिना धीरे निकालें. Angled ठीक टिप संदंश का उपयोग रेटिना को संलग्न वर्णक उपकला के शेष हटा दें. साफ और स्वस्थ रेटिना की सतह काली, चिकनी और लाल रंग दिखाई देनी चाहिए. सभी अंधेरे वर्णक उपकला कोशिकाओं के पूरी तरह हटाने के लिए 1 घंटा (8, 1992) के लिए रेटिना अंधेरे अनुकूल.
  3. कमरे में 15-30 मिनट के लिए, hyaluronidase (H6254, सिग्मा 3); ~ 0.03% (~ 0.36 मिलीग्राम / एमएल 1x में टुकड़ा समाधान wt / खंड) के साथ अलग रेटिना समझोतापमान (20-23 डिग्री सेल्सियस) शीशे हास्य निकालने. इस ऊष्मायन के दौरान, आप ठंडा टुकड़ा समाधान तैयार कर सकते हैं.
  4. धार के एक छोटे से क्षेत्र (Personna, दोधारी है, 70% इथेनॉल और एच 2 हे के साथ साफ) से जुड़ी के साथ घुमावदार किनारों को हटाने के द्वारा रेटिना (~ 2x2 मिमी, रेटिना की पूरी मोटाई युक्त) का एक आयताकार टुकड़ा कट 1 एमएल प्लास्टिक सिरिंज के शरीर, और अगर समाधान ((1.2) में तैयार) के साथ एक छोटे से भरा कंटेनर रेटिना टुकड़ा हस्तांतरण. रेटिना के आसपास समाधान की राशि कम से कम है के रूप में यह तरल अगर में रखा गया है की कोशिश करो. सीधे ठंडा टुकड़ा समाधान ((3.3) में तैयार) में विसर्जित करने के लिए अगर 20, 18, ​​9 जमना . हम एक छोटे से, हस्तनिर्मित कंटेनर का उपयोग करें. संक्षेप में, एक छोटे से, बेलनाकार ट्यूब (Fisherbrand, Polyethylene नमूना 2.5 मिलीलीटर की शीशियों, 03-338-1B) दोनों सिरों पर काट दिया गया और Parafilm (प्रधानमंत्री-996, Pechiney प्लास्टिक पैकेजिंग) पैच के साथ बंद.
  5. एक 1 में ठोस अगर ब्लॉक कटx1x1 सेमी घन युक्त रेटिना के आयताकार टुकड़ा.
  6. टुकड़ा कक्ष और इसे टुकड़ा करने की क्रिया थाली की सतह के लिए गोंद के ब्लॉक करने के लिए स्थानांतरण. टुकड़ा चैम्बर है एक फ्रीजर (-20 डिग्री सेल्सियस) में पूर्व ठंडा. ब्लॉक 200-250 सुक्ष्ममापी मोटी बर्फ ठंड टुकड़ा समाधान में एक Vibratome slicer (VT1000S या VT 1200s, Leica) का उपयोग स्लाइस में काटें. 5 to10 स्लाइस की एक कुल, प्राप्त किया जा सकता है जो के बारे में 5 से 6 घंटे के लिए व्यवहार्य हैं.
  7. रिकॉर्डिंग कक्ष में एक स्लाइस की स्थानांतरण. नायलॉन धागे टुकड़ा के शीर्ष पर एक प्लैटिनम U-आकार 19 फ्रेम करने के लिए चिपके के एक ग्रिड रखें, और लगातार रिकॉर्डिंग के साथ 95% 2 हे / 5% सीओ 2 (carbogen bubbled समाधान के साथ (1-2 एमएल प्रति मिनट की दर ) छिड़कना ).

मुसीबत शूटिंग:

यदि रेटिना अगर ब्लॉक में एम्बेडेड टुकड़ा अलग है या टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान अगर के बाहर आता है, एक 200 सुक्ष्ममापी से 20 सुक्ष्ममापी की वेतन वृद्धि में टुकड़ा मोटाई 300 सुक्ष्ममापी में वृद्धि कर सकते हैं. इसके अलावा, के रूप में इसे स्थानांतरित और रखा एक लुढ़काया "Kimwipe" कागज टिप के साथ अतिरिक्त समाधान चूसने द्वारा तरल अगर में रेटिना के आसपास समाधान की राशि को कम करने की कोशिश. इस समस्या से बचने का एक अन्य तरीका रेटिना शुरू अगर में रखा टुकड़ा के आकार को कम करने के लिए है. क्योंकि शीशे हास्य पूरी तरह रेटिना टुकड़ा संलग्न से अगर प्रतिबन्धित है, यह ताजा hyaluronidase बनाने के लिए या ऊष्मायन समय (कदम (3.3)) को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

4. द्विध्रुवी सेल synaptic टर्मिनल के एक रेटिना टुकड़ा में पहचान

  1. ईमानदार माइक्रोस्कोप (जैसे BX51WI, ओलिंप) के तहत रेटिना टुकड़ा स्थिति. हम अवरक्त अंतर है एक 60x पानी विसर्जन (0.90 एनए, ओलिंप) उद्देश्य और सीसीडी कैमरा (XC-75, सोनी) के माध्यम से हस्तक्षेप विपरीत (आईआर - डीआईसी) प्रकाशिकी के साथ रेटिना टुकड़ा देखने के लिए. सीसीडी कैमरा के उत्पादन के विपरीत बढ़ाने के लिए एक कैमरा (C2400, हमामात्सू) एक एनालॉग 13 सोनी "blac पर दृश्य से पहले नियंत्रक के लिए भेजा हैकश्मीर और सफेद मॉनिटर. खुर्दबीन एक XY अनुवाद मंच पर मुहिम शुरू की है, और रिकॉर्डिंग कक्ष एक निश्चित स्तर 14 पर रखा गया है.
  2. और या तो बरकरार axotomized (अक्षतंतु में कटौती) द्विध्रुवी सेल टर्मिनल, जो अपने आकार, आकार, और टुकड़ा (चित्रा 1) में स्थिति से पहचाना जा सकता का पता लगाएं. Axotomized और बरकरार टर्मिनलों भी अपने capacitative क्षणिक वर्तमान क्षय बार की परीक्षा (एक घातीय बनाम डबल घातीय decays, क्रमशः) और 2 Ca द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है + धाराओं (चित्रा 2, 12, 14, 15) . सुनहरीमछली रेटिना के भीतर जालक - रूप परत में, एमबी टर्मिनलों sublamina ख का सबसे समीपस्थ (नाड़ीग्रन्थि सेल परत करने के लिए आसन्न प्रकार परत पर) परत में स्थित हैं. एमबी टर्मिनल, उनके सुस्त सतह और फ्लैट उपस्थिति के साथ, आसानी से नाड़ीग्रन्थि और विस्थापित लंबे प्रबर्धों से रहित somas, जो चरण उज्ज्वल और गोलाकार दिखाई देते हैं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. इसके अलावा, एमबी टर्मिनलों की बढ़त के साथ कवर किया जाता है एक उच्चsynaptic संपर्कों का घनत्व, और किसी न किसी और अनियमित प्रकट होता है जब नाड़ीग्रन्थि और लंबे प्रबर्धों से रहित कोशिकाओं (चित्र 1a - ग) चिकनी, साफ सतहों की तुलना में. Axotomized एमबी टर्मिनलों दौर और निकट परिपत्र (चित्र -1 सी) दिखाई देते हैं, जबकि बरकरार टर्मिनलों अण्डाकार और बढ़ाकर एक pinched रेटिना के भीतर परमाणु परत (चित्रा 1a, ख) की ओर इशारा करते हुए अंत के साथ अक्सर दिखाई देते हैं.
  3. क्षतिग्रस्त या अस्वस्थ टर्मिनलों अक्सर सूजन लग रही है और सतह पर कई छोटे बारीक संरचनाओं प्रदर्शित. यह संभव हो सकता है इन टर्मिनलों पर एक GΩ मुहर प्राप्त करने के लिए, हो सकता है लेकिन वे में टूट के बाद शीघ्र ही टूटना करने के लिए की संभावना है. अस्वस्थ टर्मिनलों के अन्य लक्षण एक खोखले उपस्थिति, इसके विपरीत है और या आसपास टुकड़ा है, और कभी कभी टुकड़ा की सतह पर स्थान के समान चमक /. यह संभव है दोनों स्वस्थ टुकड़ा में गहरी टर्मिनलों (लाभ: अधिक बरकरार synaptic circuitry) से रिकॉर्ड और भी टुकड़ा की सतह के निकट (advantage; मुहर आसान) जल्दी बाहरी समाधान में perfused दवाओं के लिए उपयोग:.

5. Electrophysiological रिकॉर्डिंग और 2 Ca + इमेजिंग

  1. 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर टिप (Nalgene) के साथ एक सिरिंज का प्रयोग, एक विंदुक के पीछे से 1-2 स्तर सेंटीमीटर करने के लिए आंतरिक समाधान के साथ कांच पैच विंदुक भरने. सिरे से हवाई बुलबुले को हटाने के बाद, धारक में पिपेट सुरक्षित, सकारात्मक दबाव (1.2-1.6 साई) को लागू करने के लिए, और यह लक्षित micromanipulator का उपयोग टर्मिनल (MPC-200, Sutter साधन) की ओर कदम. जबकि टुकड़ा के माध्यम से टिप नीचे चल, एक पार्श्व व्यापक दिशा में पिपेट स्थानांतरित करने के लिए सुनिश्चित करें कि टुकड़ा टिप के साथ नहीं खींच लिया है.
  2. झिल्ली सतह को साफ करने के लिए टर्मिनल के आसपास विंदुक टिप हटो. टिप एक हिलकोरे (इंडेंट) बनाने के लिए, और सकारात्मक दबाव जारी टर्मिनल के किनारे पर नीचे पुश. यदि एक GΩ मुहर तुरंत फार्म नहीं करता है, थोड़ा नकारात्मक दबाव लागू होते हैं. एक GΩ मुहर के बाद, पर सेल ईपीसी-9 पैच दबाना एम्पलीफायर की रिकॉर्डिंग मोड पर स्विच करने और -60 या -70 एम वी पकड़े संभावित परिवर्तन. सी तेजी से सुधार (तेजी से समाई) को लागू करने के लिए, सील के लिए प्रतीक्षा करने के लिए 5-10 GΩ के बीच स्थिर, और फिर टूटना तेज, कोमल मुंह से लागू रिकॉर्डिंग पूरे सेल विन्यास स्थापित चूषण के साथ झिल्ली. यदि पूरे सेल विन्यास सही ढंग से स्थापित किया गया है, श्रृंखला प्रतिरोध 14-30 MΩ के बीच किया जाएगा. इनपुट प्रतिरोध बरकरार axotomized 14 टर्मिनलों के लिए और टर्मिनलों 1-3 GΩ के लिए 200-500 MΩ जाएगा .
  3. Capacitive वर्तमान क्षणिक (चित्रा 2a और 2c) निरीक्षण बरकरार है और axotomized द्विध्रुवी सेल टर्मिनल के बीच भेद . बरकरार है और axotomized एमबी टर्मिनलों 9-16 pF आधारभूत झिल्ली समाई और 3-8 pF, क्रमशः है.
  4. एक 200 एमएस की अवधि वोल्टेज दबाना -70 से 0 axotomized एमबी टर्मिनल करने के लिए एम वी के लिए कदम को लागू करें. यह अनुमति देगाबड़े (~ 200-600 PA), आवक Ca 2 अलग वोल्टेज पर निर्भर एल टाइप 2 Ca के उद्घाटन के द्वारा सक्रिय धाराओं + चैनल (चित्रा 2b) के प्रत्यक्ष माप. समानांतर में, एक समाई कूद synaptic vesicles के exocytosis की वजह से है, और तेजी से निषेध, 2 Ca के पीएच मध्यस्थता + वर्तमान है कि 15 exocytosis के बाद, और GABAergic पारस्परिक प्रतिक्रिया निषेध (-3 सी, चित्र 22) पर नजर रखने में सक्षम है. यदि परिणाम एक पैच एक अक्षुण्ण एमबी द्विध्रुवी सेल टर्मिनल के रूप में चित्रा 2c और 2d में दिखाया जाएगा. कोई प्रत्यक्ष 2 Ca + धाराओं बड़े "रिसाव" एमबी द्विध्रुवी 1 कोशिकाओं dendrites में अंतराल जंक्शन युग्मन के कारण धाराओं की वजह से मनाया जाता है.
  5. झिल्ली समाई परिवर्तन -70 एम वी की होल्डिंग क्षमता से 0 एम वी के लिए एक कदम विध्रुवण "साइन + डीसी" 6 समय हल झिल्ली समाई माप की विधि का उपयोग द्वारा पैदा किया जा सकता है है. झिल्ली समाई कूदता प्लाज्मा झिल्ली के साथ synaptic vesicles के संलयन से संकेत मिलता है. एक 2 kHz sinusoidal आदेश वोल्टेज दबाना (30 mV चोटी पीक) -70 एम वी की होल्डिंग क्षमता के लिए जोड़ा गया है. रिकॉर्डिंग वर्तमान दो ईपीसी 9-पैच दबाना प्रवर्धक सॉफ्टवेयर का अनुकरण द्वारा orthogonal चरण कोण पर विश्लेषण किया गया था एक ताला में प्रवर्धक (HEKA, LAMBRECHT, जर्मनी). चित्रा 2d, एक उच्च आवृत्ति (2 kHz) sinusoidal उत्तेजना सीमीत झिल्ली समाई है कि अंत टर्मिनल और अक्षतंतु, ~ जो एक आधारभूत समाई सेमी 6.8 pF के लिए विश्लेषण किया है बरकरार टर्मिनल में. सेल शरीर और द्विध्रुवी सेल के dendrites की झिल्ली इस प्रकार उच्च आवृत्ति वोल्टेज दबाना 13 Sinewave से बाहर फ़िल्टर्ड रहे हैं.
  6. Ca के लिए 2 + इमेजिंग के प्रयोगों, अच्छी तरह से आंतरिक पैच विंदुक Ca के साथ 2 + संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई समाधान मिश्रण (जैसे ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA 1 (100-200 सुक्ष्ममापी, हे +६८०६ Invitrogen,)) और प्रोटोकॉल को दोहराने से 5.1 करने के लिए 5,5. यह एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग और electrophysiological रिकॉर्डिंग गठबंधन करने की अनुमति देगा. उदाहरण के लिए, यह संभव है 2 Ca + क्षणिक एक 200 एमएस -70 से एमबी टर्मिनल (चित्र 3a, ख) के छोटे telodendria appendages में 0 एम वी के लिए कदम के साथ जुड़े छवि के लिए. हम एक कताई डिस्क लेजर confocal खुर्दबीन प्रणाली (CSU-X1, Yokogawa) के साथ हमारे ईमानदार ओलिंप खुर्दबीन एकीकृत है. confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करता है 488 एनएम और 561 एनएम लेजर लाइनों है कि एक acousto ऑप्टिक tunable फ़िल्टर के द्वारा modulated हैं. डेटा Slidebook सॉफ्टवेयर (इंटेलिजेंट इमेजिंग उपकरण 3i) का उपयोग कर हासिल किया है. सुनहरीमछली का उपयोग रेटिना न्यूरॉन्स कैल्शियम इमेजिंग तकनीकों पर अधिक जानकारी के 24, 17, 3, देखते हैं.

मुसीबत शूटिंग:

यदि एक बार के लिए एक पूरे सेल विन्यास की स्थापना में विफल रहता है, एक स्थिर GΩ मुहर के गठन के बाद भी, यह मददगार हो पंचर करने के लिए इस्तेमाल किया नकारात्मक दबाव कम मुझे टर्मिनलmbrane. यह भी मामला है कि पूरे सेल विन्यास की स्थापना के लिए इष्टतम चूषण दबाव झिल्ली वक्रता (सोमा> टर्मिनल) के एक समारोह के रूप में बदलता जा सकता है. यह भी संभव है जैप प्रोटोकॉल (आयाम: 400 mV, अवधि: 100 μs) का उपयोग करने के लिए, या तो अकेले या संयोजन में नकारात्मक दबाव के एक तेज नाड़ी के साथ पूरे सेल विन्यास में प्रवेश. हम जैप प्रोटोकॉल पाया है तोड़ने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब से अधिक 12 MΩ में स्नान प्रतिरोध के साथ एक विंदुक टिप का उपयोग.

6. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1 एमबी सुनहरीमछली रेटिना स्लाइस में द्विध्रुवी सेल टर्मिनल की पहचान. (एसी) IR डीआईसी एमबी द्विध्रुवी सेल टर्मिनल की छवियों. हम आईआर - डीआईसी छवि में होने की संभावना (अक्षतंतु में कटौती) axotomized और बरकरार टर्मिनलों की पहचान कर सकते हैं. एक axotomized टर्मिनल दौर है और गोल दिखाई देता है, के रूप में ग में दिखाया गया हैजबकि एक अक्षुण्ण टर्मिनल और अधिक करने के लिए अण्डाकार प्रदर्शित होने की संभावना है, के रूप में एक और ख में दिखाया गया है . इस वर्गीकरण क्षणिक समाई माप (देखें चित्र 2) द्वारा या डाई भरने विधि (घ च) के द्वारा पुष्टि की जा सकती है. लाल तीर एक और में बरकरार टर्मिनलों के लिए अक्षतंतु और अक्षतंतु टर्मिनल के बीच चौराहे के स्थान का संकेत दिया. लाल बिंदीदार रेखा एमबी द्विध्रुवी सेल टर्मिनल की समोच्च संकेत दिया. (Df). एक अक्षुण्ण अक्षतंतु (घ), एक आंशिक रूप से काट अक्षतंतु (ई), या एक पूरी तरह से हटा अक्षतंतु (च) के साथ एमबी द्विध्रुवी सेल टर्मिनल की प्रतिदीप्ति छवियों. Alexa (A20501MP, Invitrogen) फ्लोरोसेंट रंजक 555 रिकॉर्डिंग के लिए पहले आंतरिक समाधान के साथ भरा हुआ था. तुरंत पैच दबाना रिकॉर्डिंग के बाद, रेटिना टुकड़ा 4 (wt / खंड)% paraformaldehyde फॉस्फेट बफर समाधान में (P6148, सिग्मा) (७०,०१३, GIBCO) में स्थानांतरित किया गया था और 30 के लिए incubatedमि. स्लाइसें Superfrost स्लाइड्स (फिशर साइंटिफिक) पर विरोधी लुप्त होती एजेंट (Biomeda कॉर्प) के साथ जलीय बढ़ते मध्यम में घुड़सवार थे. एलेक्सा युक्त 555 एमबी द्विध्रुवी सेल टर्मिनल एक 555 एनएम लेजर लाइन (लाल) एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग (710 LSM, कार्ल Zeiss) पर एक 40x उद्देश्य पानी विसर्जन का उपयोग कर के साथ देखा गया. छोटे telodendria अक्षतंतु टर्मिनलों (नीले तीर) से उभड़नेवाला appendages की उपस्थिति ध्यान दें. स्केल बार 10 सुक्ष्ममापी (च क) से संकेत मिलता है. लीग: भीतर परमाणु परत, आईपीएल: भीतरी परत उलझन - रूप, GCL: नाड़ीग्रन्थि सेल परत.

चित्रा 2
चित्रा 2 axotomized और बरकरार एमबी द्विध्रुवी सेल टर्मिनल के विद्युत गुणों. (एक ग) क्षणिक वर्तमान एक वोल्टेज क्लंप पकड़ -60 एम वी के -70 एम वी के लिए संभावित से कदम hyperpolarization से सक्रिय प्रतिक्रिया. कम एक -10 एम वी कदम वोल्टेज दबाना वर्तमान प्रतिक्रियामें परिणाम कर सकते हैं: 1) एक एकल तेजी -70 (एम वी एक axotomized टर्मिनल के संकेत पर घातीय उच्च इनपुट प्रतिरोध के साथ वर्तमान क्षय; एक पैनल), या 2) -70 एम वी (संकेत के पर एक डबल कम इनपुट प्रतिरोध के साथ घातीय क्षय एक अक्षुण्ण टर्मिनल, पैनल ग, यह भी देख 12, 14 15). (ख, घ) 2 Ca + धाराओं और झिल्ली समाई कूदता एक कदम विध्रुवण -70 से 0 एम वी द्वारा पैदा किया गया . समय हल झिल्ली समाई माप एक 2 kHz Sinewave -70 6 mV के आराम होल्डिंग क्षमता पर आरोपित उत्तेजना का उपयोग करें. लाल निशान समाई डेटा बिंदुओं का औसतन मूल्य है. ध्यान दें कि चित्र 2b और 2d में समाई कूद दोनों के बारे में 200 एफएफ के बराबर हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3 Ca 2 के प्रत्यक्ष माप. + इमेजिंग संकेतों exocytosis, और एक एम में निरोधात्मक प्रतिक्रियाख द्विध्रुवी सेल टर्मिनल. (क) 2 CA में एक क्षणिक वृद्धि एक एमबी टर्मिनल के telodendria + एकाग्रता एक कदम वोल्टेज दबाना -70 से 0 एम वी विध्रुवण द्वारा 200 एमएस (तीर) के लिए सक्रिय किया गया था. ओरेगन 488 BAPTA 1 (100 सुक्ष्ममापी), एक सीए 2 + सूचक डाई ग्रीन, पैच पिपेट में शामिल किया गया था. (ख) एमबी telodendria (लाल बिंदीदार रेखा ने संकेत दिया हित के क्षेत्र) के अनुरूप प्रतिदीप्ति छवि. (ग) अल्पावधि neurotransmitter रिहाई (exocytosis) की synaptic अवसाद. 2 Ca + धाराओं (मध्य ट्रेस) और झिल्ली (कम ट्रेस) समाई 20 0 एम वी (ऊपरी ट्रेस, 200 एमएस अंतर - नाड़ी अंतराल) एमएस depolarizations की एक जोड़ी के द्वारा पैदा की . तीर 2 Ca पर exocytosed प्रोटॉन के प्रभाव + वर्तमान और भी पड़ोसी लंबे प्रबर्धों से रहित कोशिकाओं 15, 21 से GABAergic पारस्परिक प्रतिक्रिया निषेध. इंगित करता है ध्यान दें कि प्रोटॉन की मध्यस्थता Ca 2 का निषेध + वर्तमान और भी गपशपAergic पारस्परिक प्रतिक्रिया निषेध पहली depolarizing प्रतिक्रिया है, जो भी एक समाई synaptic vesicles के exocytosis की वजह से कूद है में ही मौजूद हैं.

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Discussion

हमारे प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण और कठिन कदम अगर समाधान (3.4 प्रोटोकॉल) में रेटिना के टुकड़े के हस्तांतरण है. यह आवश्यक है ध्यान से शीशे और रेटिना टुकड़ा से अवशिष्ट टुकड़ा समाधान हास्य हटा दें और इसे विकृति या झुकने के बिना स्थानांतरण. आदेश में यह पूरा करने के लिए, हम एक टिप angled टिप संदंश (11251-35, ललित विज्ञान उपकरण), के साथ एक 90 डिग्री कोण, फार्म तुला रेटिना की स्थिति के साथ एक छोटा सा मलहम लगाने का औजार (21-401-25B, Fisherbrand) का उपयोग करें टुकड़ा समाधान में हस्तांतरण प्रक्रिया के दौरान टुकड़ा. रेटिना टुकड़ा और लेपनी पर अवशिष्ट टुकड़ा समाधान एक जोड़ या लुढ़का Kimwipes (Kimberly-क्लार्क) के कोने के साथ सावधान सतह के dabbing द्वारा हटाया जा सकता है.

एक अन्य आम तरीका अनुप्रस्थ रेटिना स्लाइस तैयार फिल्टर आधारित कागज प्रोटोकॉल 23 है. संक्षेप में, पूरे रेटिना के एक औंधा टुकड़ा Millipore फिल्टर डिस्क की एक आयत टुकड़ा (नाड़ीग्रन्थि सेल रखना करने के लिए जुड़ा हुआ हैफिल्टर पेपर के खिलाफ एर, फोटोरिसेप्टर परत का सामना करना पड़) और एक मैनुअल ऊर्ध्वाधर "अंगूठे" के साथ 250 सुक्ष्ममापी मोटी स्लाइसें में कटौती slicer (जैसे Narishige ST-20). हम पाते हैं कि फिल्टर कागज आधारित प्रोटोकॉल के फायदे स्वस्थ photoreceptors और बरकरार एमबी टर्मिनलों के लिए axotomized की वृद्धि अनुपात शामिल हैं. हम इस तरह इस फिल्टर पेपर पद्धति का उपयोग करने के लिए प्रकाश एकल एमबी रेटिना स्लाइस में एम्बेडेड टर्मिनल से पैदा की प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना.

फिल्टर कागज आधारित प्रोटोकॉल पर हमारे अगर आधारित प्रोटोकॉल का लाभ कर रहे हैं कि 1) रेटिना उत्पादित टुकड़ा फ्लैट है, भी, और अपेक्षाकृत रेटिना परतों, जो किसी भी भीतर परमाणु परत या उलझन - रूप रेटिना परत में पट्टी को सक्षम बनाता है के बीच स्पष्ट विभाजन के साथ undamaged सेल है कि वांछित है, और 2) immunohistochemistry निम्नलिखित electrophysiological रिकॉर्डिंग और अधिक आसानी से टुकड़ा बरकरार है और फ्लैट में ज्यामिति और आइटम (1) में वर्णित ऊपर कारकों की वजह से किया जाता है. प्रकाश प्रतिक्रिया रिकॉर्डिंग के लिए एक प्रोटोकॉलअगर आधारित तैयारी में रेटिना न्यूरॉन्स की एस पहले जौव 2 में प्रकाशित किया गया था. एक क्षैतिज रेटिना टुकड़ा तैयारी है कि अगर और फिल्टर पेपर तकनीकों का एक संयोजन का इस्तेमाल भी पहले जौव 5 में प्रकाशित किया गया था. हम अपने स्वयं के साथ संयोजन में इन वीडियो देखने के लिए विभिन्न तकनीकों की तुलना करने की सलाह देते हैं.

हड्डीवाला रेटिना स्लाइस में रिबन प्रकार presynaptic टर्मिनलों सीधी पहुँच हमें रिबन प्रकार सक्रिय क्षेत्रों पर synaptic प्रसारण की जांच करने के लिए अनुमति देता है. यह भी हमें सीधे रेटिना microcircuits में synaptic शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक को निरोधात्मक लंबे प्रबर्धों से रहित कोशिकाओं और spiking नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं 1, 16, 10 सहित postsynaptic भागीदारों के साथ विशेष रूप से पूर्व और बाद synaptic संकेतों के बनती रिकॉर्डिंग के लिए उपयोगी हो जाएगा. चूहे कर्णावत भीतरी बालों की कोशिकाओं और अभिवाही dendrites के बीच रिबन प्रकार synapses पर बनती रिकॉर्डिंग संभव हो रहे हैं और 7 से वर्णित किया गया है. कैल्शियम imagiएनजी एमबी द्विध्रुवी सेल टर्मिनल की तीव्रता dissociated 8 कोशिकाओं में है और रेटिना 17 स्लाइस, के रूप में के रूप में सुनहरीमछली लंबे प्रबर्धों से रहित 3 कोशिकाओं में में प्रदर्शन किया गया है . हाल के अध्ययनों से महान सुधार के लिए vivo में इन विट्रो ट्रांसजेनिक zebrafish 4 रेटिना में optogenetic दृष्टिकोण में पता चला है. भविष्य दिशाओं की संभावना इन ट्रांसजेनिक तकनीक शामिल होगा, साथ electrophysiological विधियों, जो हमें इन विट्रो टुकड़ा रिकॉर्डिंग में और vivo इमेजिंग में के बीच की खाई को पाटने के लिए, अंततः व्यवहार के अध्ययन के लिए अग्रणी के लिए अनुमति देगा के साथ.

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Disclosures

हम कोई खुलासा हितों की होड़ है.

Acknowledgments

हम अगर एम्बेडेड रेटिना टुकड़ा तैयारी का अपने तरह के स्पष्टीकरण के लिए धन्यवाद डा. फ्रेड Rieke जब हम हमारी प्रयोगशाला में प्रोटोकॉल का उपयोग शुरू कर दिया. हम भी योजनाबद्ध सिंहावलोकन और डीआरएस के चित्रण के लिए लोरी Vaskalis धन्यवाद. Veeramuthu बालकृष्णन और उपयोगी टिप्पणी के लिए पाठ और वीडियो पर Soyoun चो. यह काम एक Nei-NIH RO1 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और भी आंशिक रूप से कोरिया रिसर्च फाउंडेशन अनुदान कोरियाई सरकार द्वारा वित्त पोषित द्वारा समर्थित [KRF-2008-357-E00032]

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low gelling-temperature agar Sigma-Aldrich A0701 Agarose type VII-A
Patch pipette World Precision Instruments, Inc. 1B150F-4 Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass
Vertical puller Narishige International PP830
Dental wax Cavex
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
45° angled fine tip forceps Fine Science Tools 11251-35
Razor blade Personna Medical Care Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O
Cylindrical tube Fisher Scientific 03-338-1B Polyethylene sample vials 2.5 ml
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H6254
Vibratome slicer Leica Microsystems VT1000S or VT1200S
Upright microscope Olympus Corporation BX51WI
60x water-immersion objective Olympus Corporation LUMPlanFl NA 0.90
CCD camera Sony Corporation XC-75
Camera controller Hamamatsu Corp. C2400
Monitor Sony Corporation 13” black and white monitor
Syringe filter Nalge Nunc international 0.2 μm
Micromanipulator Sutter Instrument Co. MPC-200
Lock-in amplifier HEKA Instruments EPC-9/10 amplifiers have software emulation
Spinning disk laser confocal microscope Yokogawa CSU-X1 Live cell imaging after patch clamp whole cell recording
Slidebook software Intelligent Imaging Instruments (3i) Imaging data acquisition and analysis
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate buffer solution GIBCO, by Life Technologies 70013
Superfrost slide Fisher Scientific Slide glass
Anti-fading agents Biomeda corp.
Confocal laser-scanning microscope Carl Zeiss, Inc. LSM 710 Imaging of fixed tissue
Spatula Fisher Scientific 21-401-25B
Manuel vertical slicer Narishige International ST-20
Oregon Green 488 BAPTA-1 Invitrogen O-6806 Ca2+ sensitive fluorescent dye
Alexa Fluor 555 Hydrazide Invitrogen A-20501MP Fluorescent dye

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References

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