Patch-clamp medidas de capacitância e Ca 2 + Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias

Neuroscience

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Summary

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação de agar-embedded fatias da retina que são adequados para eletrofisiologia e Ca2 + imagem. Este método permite que um estudo de fita do tipo sinapses em microcircuitos da retina usando direto de patch-clamp gravações de um único terminais nervosos pré-sinápticos.

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Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices. J. Vis. Exp. (59), e3345, doi:10.3791/3345 (2012).

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Abstract

Estímulos visuais são detectados e transmitidos em uma ampla faixa dinâmica de intensidades de luz e mudanças de freqüência por neurônios especializados na retina de vertebrados. Duas classes de neurônios da retina, fotorreceptores e células bipolares, fazer isso usando a fita do tipo zonas ativas, que permitem a liberação do neurotransmissor sustentada e de alto rendimento em períodos de tempo longos. ON tipo misto de células bipolares (Mb) terminais na retina peixinho, que despolarizar a estímulos de luz e receber vara mista e cone de entrada de fotorreceptores, são adequados para o estudo da fita do tipo sinapses tanto devido a seu grande tamanho (~ 12/10 diâmetro mm) e aos seus inúmeros lateral e recíprocas conexões sinápticas com dendritos de células amácrinas. Acesso direto aos terminais Mb de células bipolares da retina em fatias goldfish com a técnica de patch-clamp permite a medição de Ca 2 + pré-sináptico correntes, alterações de capacitância de membrana, e inibição de feedback recíproco sináptica mediada pelo GABA <receptores sub> A e GABA C expresso nos terminais. Medições membrana pré-sináptica capacitância de exocitose permitem estudar a plasticidade de curto prazo da liberação do neurotransmissor excitatório 14,15. Além disso, a plasticidade de curto prazo e longo prazo da liberação do neurotransmissor inibitório das células amácrinas também pode ser investigado por gravações de inibição de feedback recíproco de chegar ao terminal Mb 21. Em períodos curtos de tempo (por exemplo, ~ 10 s), a inibição GABAérgica comentários recíproca a partir de células amácrinas sofre pares de pulso, depressão através de esgotamento GABA vesícula piscina 11. A dinâmica de microcircuitos sináptica da retina na camada plexiforme interna da retina podem, portanto, ser diretamente estudados.

A técnica do cérebro fatia foi introduzida mais de 40 anos atrás, mas ainda é muito útil para a investigação das propriedades elétricas dos neurônios, tanto na soma única célula, dendrite única ou axônio, e microcircuit nível sináptico 19. Tecidos que são pequenos demais para ser colado diretamente na câmara de corte são muitas vezes incorporadas no primeiro agar (ou colocado em um filtro de papel) e depois em fatias 20, 23, 18, ​​9. Neste vídeo, nós empregamos a técnica de agar pré-incorporação usando retina goldfish. Alguns dos gigantes terminais célula bipolar em nossa retina fatias de peixe dourado são axotomized (axônio corte) durante o processo de corte. Isso nos permite isolar única entradas terminal pré-sináptico do nervo, porque a gravação dos terminais axotomized exclui os sinais do compartimento soma dendríticas. Alternativamente, pode-se também gravar a partir de células intactas Mb bipolar, por gravação a partir de terminais ligados ao axônios que não foram cortadas durante o processo de corte. No geral, a utilização deste protocolo experimental ajudará nos estudos da fisiologia sináptica da retina, análise de microcircuito funcional, ea transmissão sináptica em sinapses fita.

Protocol

1. Soluções externas e internas

  1. Prepare a solução de corte (cálcio) de solução estoque de 10x e adicione MgCl 2, CaCl 2 e D-glicose diário. A solução final consiste em 1x (em mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 3,2 MgCl 2, 0,25 CaCl 2, 12 D-glicose, 0,2 ácido L-ascórbico, 12 HEPES. Definir o pH para 7,4 (com NaOH) e ajuste da osmolaridade para 260 mOsm (usando H 2 O e solução estoque 10x).
  2. Pesar 3% agar gelificação baixa temperatura (Agarose tipo VII-A, A0701, Sigma; Rieke, 2001) e misture com corte solução. Aquecer a solução agar contendo no microondas por 1-2 min, ou até que se dissolva completamente, e incubar a ágar-ágar em banho-maria (30-33 ° C) para evitar a solidificação rápida (temperatura de transição gel: 26 ± 2 ° C).
  3. Prepare solução de gravação (cálcio normal) a partir de solução estoque de 10x e adicione MgCl 2, CaCl 2 e D-glicose diário. A consistência solução final 1xts de (em mM): 100 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 0,2 ácido L-ascórbico, 2,5 CaCl 2, 12 D-glicose. Depois de borbulhar a solução em 95% O CO 2 / 5% 2 (carbogênio) por 5-10 minutos, definir o pH para 7,4 (com NaOH) e ajuste da osmolaridade para 260 mOsm (usando H 2 O e solução estoque 10x).
  4. Alíquotas (1 ml cada) de soluções internas da pipeta são preparados com antecedência e armazenado em um freezer (-20 ° C). Duas soluções pipeta internos são normalmente utilizados para isolar células bipolares correntes de cálcio (em mM):
    1. 40 CsCl, 60 Cs-gluconato, 10 tetraethylammonium (TEA)-Cl, 28 HEPES, 3 Mg-ATP, um Na-GTP, e 2 EGTA. Ajustar o pH para 7,2 (com CsOH) e osmolaridade para 250 mOsm set. Esta solução de cloreto de alta interna normalmente fornece gravações menor resistência série (melhores condições de braçadeira de tensão) e maiores correntes pós-sinápticos inibitórios (iPSCs) em um potencial de membrana bipolar de célula de repouso de -60 mV.
    2. 95 Cs-gluconato, 10 TEA-Cl, 25 HEPES, 3 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP, e 0,5 EGTA. Ajustar o pH para 7,2 (com CsOH), e definir osmolaridade para 250 mOsm 22. Esta baixa EGTA solução interna tipicamente leva a mudanças maior capacitância de membrana induzida por pulsos despolarizantes passo e, assim, permite estudos de depleção de vesícula piscina e de curto prazo depressão.

2. Patch-clamp eletrodos pipeta

  1. Prepare de paredes espessas (1,5 mm de diâmetro externo) vidro de borosilicato (1B150F-4; Instrumentos de Precisão Mundial, Sarasota, FL) e puxe as pipetas patch usando um extrator vertical (Narishige, PP830, Tóquio, Japão). Resistências pipeta Open-ponta patch em soluções de gravação são 7-8 mohms quando a pipeta é preenchido com solução de pipeta interna # 1.
  2. Brasão do patch pipeta-uniformemente, da ponta até o nível do eixo que atinge o titular da pipeta, com cera dental (Cavex, West Chester, PA). Isso irá minimizar a capacitância pipeta e ruídos elétricos e permitirmais precisos e de baixo ruído medidas de capacitância. A capacitância pipeta baixo também ajuda a compensação electrónica de C-rápido (capacitância rápido) da EPC-9 (ou EPC-10) amplificador de patch clamp.

3. Preparação de agar-embedded fatias da retina

  1. Selecione um goldfish (Carassius auratus; 8-16 cm) e coloque em um balde coberto em um quarto escuro por 30 min de adaptação ao escuro. Após a anestesia, euthanize o peixinho sedado por decapitação rápida e duplo mielotomia da medula espinhal e do tronco cerebral. Em seguida, retire os olhos com ponta curvada tesouras e pinças curvas de ponta. Estes procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê de Uso (IACUC) na Oregon Health & Science University.
  2. Hemisect cada olho, cortando uniformemente em torno da frente do olho com uma tesoura de mola (15003-08, Ferramentas Ciência Belas; iniciar corte por punção com pontas de tesoura) e coloque o eyecups em solução fatia refrigerados (cálcio). Se necessary, retire a lente com uma pinça (a lente normalmente irá destacar com a parte frontal do olho). Remova a retina com epitélio pigmentar anexado usando um par de fórceps de 45 ° ponta angulada multa (11251-35, Ferramentas Ciência Fine) para descascar a retina longe da ocular, progredindo lentamente em torno do 360 °. Romper ou cortar o nervo óptico com o auxílio de pinças ou tesouras finas primavera. Remove delicadamente a retina com uma combinação de ângulo pinças de ponta fina e sucção aplicada a partir de um Pasteur modificada pipeta ou pipeta de transferência (ponta de grande porte). Use uma pinça de ponta fina angulada para remover o restante do epitélio pigmentar ligado à retina. A superfície da retina limpo e saudável deve aparecer escuro, liso e de cor vermelha. Para a remoção completa de todas as células do epitélio escuro pigmento escuro-adaptação da retina de uma hora (8, 1992).
  3. Tratar a retina isolada com ~ 0,03% (wt / vol; ~ 0,36 mg / mL em 1x solução fatia) hialuronidase (3; H6254, Sigma) por 15-30 min, na salatemperatura (20-23 ° C) para remover humor vítreo. Durante esta incubação, você pode preparar gelada solução fatia.
  4. Corte um pedaço retangular de retina (~ 2x2 milímetros, contendo toda a espessura da retina), removendo as bordas curvadas com um pequeno segmento de lâmina de barbear (Personna, de dois gumes, limpa com álcool 70% e H 2 O) ligado a o corpo de uma seringa de plástico de 1 mL, e transferir a parte da retina de um pequeno recipiente cheio de solução de agar (elaborado em (1.2)). Tentar minimizar a quantidade de solução em torno da retina, uma vez que é colocado no ágar líquido. Mergulhar diretamente na gelada solução fatia (elaborado em (3.3)) para solidificar o agar 20, 18, ​​9. Usamos um recipiente pequeno e artesanal. Resumidamente, um pequeno tubo cilíndrico (Fisherbrand, frascos de polietileno de amostra 2,5 ml, 03-338-1B) foi cortada em ambos os lados e selado com Parafilm (PM-996, Pechiney Embalagens Plásticas) patches.
  5. Cortar o bloco de ágar sólido em um 1x1x1 cubo cm contendo o pedaço retangular de retina.
  6. Transferência do bloco para a câmara de corte e cola-lo para a superfície da placa de corte. A câmara de fatia é pré-resfriado em um freezer (-20 ° C). Cortar o bloco para 200-250 mM fatias grossas usando um cortador de Vibratome (VT1000S ou VT 1200S, Leica) na gelada solução fatia. Um total de 5 a 10 fatias podem ser obtidas, que são viáveis ​​para cerca de 5 a 6 horas.
  7. Transferência de uma das fatias para a câmara de gravação. Colocar uma grade de fios de nylon colada a uma estrutura de platina em forma de U 19 em cima da fatia, e perfundir continuamente (taxa de 1-2 mL por minuto) com solução de gravação aeradas com 95% O 2 / 5% CO 2 (carbogênio ).

Resolução de Problemas:

Se a parte da retina embutido no bloco de agar é separada ou sai do ágar durante a corte, pode-se aumentar a espessura de corte de 200 mM de até 300 mm, em incrementos de 20 mM. Também tentar minimizar a quantidade de solução em torno da retina, uma vez que é transferido e colocado no ágar líquido por sugando solução extra com um "Kimwipe" rolou ponta de papel. Outra forma de evitar este problema é reduzir o tamanho do pedaço de retina inicialmente colocados no agar. Porque humor vítreo proíbe agar de totalmente anexando à peça da retina, pode ser necessário fazer hialuronidase frescos ou ajustar o tempo de incubação (etapa (3.3)).

4. Identificação do terminal de célula bipolar sináptica em uma fatia da retina

  1. Posição da fatia da retina sob o microscópio vertical (por exemplo, BX51WI, Olympus). Nós vemos a fatia da retina com infravermelho contraste de interferência diferencial (IR-DIC) através de uma ótica objetiva de imersão em água-60x (NA 0,90, Olympus) e câmera CCD (XC-75, Sony). A saída da câmera CCD é enviado a um controlador de câmera (C2400, Hamamatsu) para realce de contraste antes visualização em um Sony analógico 13 "black e branco monitor. O microscópio é montado em uma fase de tradução XY, ea câmara de gravação é colocado em um palco fixo 14.
  2. Quer encontrar intacto e axotomized (axônio-cut) terminais de células bipolares, que podem ser identificadas pelo seu tamanho, forma e posição na fatia (Figura 1). Terminais Axotomized e intacto também podem ser distinguidos pelo exame de sua capacitiva transitória vezes decadência atual (single decai exponencial contra dupla-exponencial, respectivamente) e Ca 2 + correntes (Figura 2, 12, 14, 15). Mb terminais estão localizados na camada mais proximal da sublamina b (ON-tipo de camada, adjacente à camada de células ganglionares) na camada plexiforme interna da retina goldfish. Terminais Mb, com a sua superfície sem brilho e aparência plana, pode ser facilmente distinguidos dos ganglionares e amácrinas deslocadas somas, que aparecem fase brilhante e esférico. Além disso, a borda de terminais Mb é coberto com uma altadensidade de contatos sinápticos, e parece áspera e irregular quando comparado ao superfícies lisas, limpas de ganglionares e células amácrinas (Figura 1a-c). Terminais Axotomized Mb aparecem circular em volta e perto (Figura 1c), enquanto os terminais intacta aparecem elíptica e esticado, muitas vezes com um final apertado apontando para a camada nuclear interna da retina (Figura 1a, b).
  3. Terminais danificados ou insalubres, muitas vezes olhar inchado e mostrar várias pequenas estruturas granular na superfície. Pode ser possível obter um selo GÊ sobre esses terminais, mas que são susceptíveis de ruptura logo após o break-in. Outros sinais de terminais insalubres incluem uma cavidade aparência, o contraste e / ou brilho idêntico ao da fatia ao redor, e às vezes localização na superfície da fatia. É possível gravar dois dos terminais saudáveis ​​no fundo da fatia (vantagem: mais intacto circuitos sinápticos) e também perto da superfície da fatia (advantage: acesso mais rápido às drogas perfundidos na solução externa; mais fácil de selo).

5. Gravações eletrofisiológicas e Ca 2 + imagem

  1. Usando uma seringa com uma ponta de 0,2 mm de filtro (Nalgene), encher a pipeta de patch de vidro com uma solução interna para um nível de 02/01 centímetros na parte de trás da pipeta. Depois de retirar as bolhas de ar da ponta, segura a pipeta no suporte, aplicar pressão positiva (1,2-1,6 psi), e movê-lo em direção ao terminal alvo usando um micromanipulador (MPC-200, Sutter Instrument). Enquanto se move a ponta para baixo, através da fatia, passar a pipeta em uma direção lateral varrendo para garantir que a fatia não é puxada juntamente com a ponta.
  2. Mover a ponta da pipeta em torno do terminal para limpar a superfície da membrana. Aperte a ponta para baixo sobre a borda do terminal para criar uma ondulação (travessão), e liberar a pressão positiva. Se um selo GÊ não faz imediatamente, aplicar uma ligeira pressão negativa. Depois de um selo GÊ, mude para o modo de gravação on-célula do amplificador clamp EPC-9 patch e mudar o potencial de exploração para -60 ou -70 mV. Aplicar o C-rápida correção (capacitância-rápido), espere o selo para estabilizar entre GÊ 10/05, e depois a ruptura da membrana com sucção, sharp suave aplicada por via oral para estabelecer a configuração de gravação de célula inteira. Se a configuração de célula inteira foi corretamente estabelecida, resistência em série será entre 14-30 mohms. Resistência de entrada será 200-500 mohms para terminais intactos e GÊ 1-3 para terminais axotomized 14.
  3. Observe o transitório corrente capacitiva (Figura 2a e 2c), para distinguir entre os terminais de células intactas e axotomized bipolar. Terminais Mb intacta e axotomized têm uma capacitância de membrana basal de 9-16 pF e 3-8 pF, respectivamente.
  4. Aplicar a 200 ms de duração degrau de tensão-clamp de -70 a 0 mV a um terminal Mb axotomized. Isso permitirá quea medição direta de grandes (~ 200-600 pA), isolado Ca 2 + para dentro correntes ativado pela abertura de voltagem-dependentes do tipo L-Ca 2 + canais (Figura 2b). Em paralelo, um é capaz de monitorar o salto capacitância causada pela exocitose de vesículas sinápticas, ea rápida, a inibição mediada por pH de Ca 2 + corrente que segue exocitose 15, e inibição de feedback recíproco GABAérgica (Figura 3c; 22). Se uma remendos uma intacta Mb terminal de célula bipolar, o resultado será como mostrado na Figura 2c e 2d. Sem Ca 2 + discernível correntes são observados por causa da grande "vazamento" correntes devido ao gap-junction acoplamento nos dendritos das células bipolares Mb 1.
  5. Alterações de capacitância de membrana podem ser evocados por uma despolarização etapa do potencial de realização de -70 mV a 0 mV usando o "sine + DC" método de tempo resolvido medições de capacitância de membrana 6. Saltos capacitância de membrana indicam a fusão das vesículas sinápticas com a membrana plasmática. A 2 kHz comando de voltagem clamp-sinusoidal (30 mV pico-a-pico) foi adicionado ao potencial realização de -70 mV. A corrente de gravação foi analisada em dois ângulos de fase ortogonais pelo EPC-9 emulação de software patch-clamp amplificador de um amplificador lock-in (Heka, Lambrecht, Alemanha). No terminal intactos da Figura 2d, uma alta freqüência (2 kHz) limites de estímulo sinusoidal a capacitância de membrana que é analisado para as terminações terminal e axônio, que têm uma capacitância base Cm ~ 6,8 pF. A membrana do corpo celular e dendritos da célula bipolar são, portanto, filtradas pela alta freqüência de tensão-clamp sinewave 13.
  6. Para Ca 2 + imagem-experimentos, misturar completamente a solução interna pipeta de patch com um Ca 2 + sensíveis ao corante fluorescente (por exemplo, Oregon Verde 488 BAPTA-1 (100-200 mM; O-6806, Invitrogen)) e repita o protocolo de 50,1-5,5. Isto irá permitir uma para combinar imagens de fluorescência e gravação eletrofisiológico. Por exemplo, é possível a imagem do Ca 2 + transitória associada com uma etapa de 200 ms de -70 a 0 mV em pequenos apêndices telodendria do terminal Mb (Figura 3a, b). Nós integramos nosso microscópio Olympus vertical com um disco de sistema a laser spinning microscópio confocal (CSU-X1, Yokogawa). O microscópio confocal utiliza 488 nm e 561 nm linhas de laser que são modulados por um filtro acusto-óptico sintonizável. Os dados são adquiridos por meio Slidebook software (3i; Instruments Intelligent Imaging). Para mais detalhes sobre técnicas de cálcio imagem usando neurônios da retina goldfish ver 24, 17, 3.

Resolução de Problemas:

Se uma freqüência não consegue estabelecer uma configuração de célula inteira, mesmo após a formação de um selo GÊ estável, pode ser útil para reduzir a pressão negativa, utilizado para perfurar o terminal membrane. Também pode ser o caso que a pressão de sucção ideal para a criação de células inteiras configuração varia em função da curvatura da membrana (soma> terminal). Também é possível usar um protocolo de zap (Amplitude: 400 mV, Duração: 100 mS) para entrar na configuração de célula inteira, sozinho ou em combinação com um pulso acentuada de pressão negativa. Nós encontramos o protocolo zap ser particularmente útil para break-in quando se utiliza uma ponteira com uma resistência de banho em excesso de 12 mohms.

6. Resultados representante

Figura 1
Figura 1. Identificação de terminais Mb célula bipolar em fatias goldfish da retina. (Ac) IR-DIC imagens de terminais celulares Mb bipolar. Podemos identificar terminais provável axotomized (axônio-cut) e intacto na imagem IR-DIC. Um terminal axotomized aparece redondo e circular, como mostrado na cenquanto um terminal intacta é mais provável que apareça elíptico, como mostrado em um e b. Esta classificação pode ser confirmada por medição de capacitância transitórias (ver Figura 2) ou pelo método de tintura de enchimento (d - f). Setas vermelhas indicada a localização da interseção entre o axônio eo terminal do axônio para os terminais intacto em a e b. Linha pontilhada vermelha indica o contorno de terminais celulares Mb bipolar. (Df). Imagens de fluorescência de terminais Mb célula bipolar com um axônio intacta (d), um axônio parcialmente cortadas (e), ou um axônio totalmente removidos (f). Alexa 555 (A20501MP, Invitrogen) corante fluorescente foi preenchido com solução interna antes da gravação. Imediatamente depois de patch-clamp de gravação, a fatia da retina foi transferido para 4% (wt / vol) paraformaldeído (P6148, Sigma) em solução tampão fosfato (70013, GIBCO) e incubado por 30min. Cortes foram montados em lâminas Superfrost (Fisher Scientific) em meio de montagem aquoso com anti-fading agentes (Biomeda corp). Alexa contendo 555 Mb terminais de células bipolares eram vistos com uma linha de laser 555 nm (vermelho) utilizando objetiva de imersão em água-40x em um microscópio confocal de varredura a laser (LSM 710, Carl Zeiss). Observe a presença de pequenos apêndices telodendria salientes dos terminais do axônio (setas azuis). Barra de escala indicam 10 mM (a - f). INL: camada nuclear interna, IPL: camada plexiforme interna, GCL: camada de células ganglionares.

Figura 2
Figura 2. Propriedades elétricas de axotomized e intacto Mb terminais célula bipolar. (A, c) A resposta transitória atual ativado por um degrau de tensão hiperpolarização-clamp do potencial de realização de -60 mV a -70 mV. A resposta curta atual para um degrau de tensão -10 mV-clamppode resultar em: 1) um único decaimento exponencial rápida corrente com resistência de entrada elevada a -70 mV (indicativo de um terminal axotomized; painel a), ou 2) um decaimento exponencial duplo com resistência de entrada baixa a -70 mV (indicativo de um terminal intactos; painel c, ver também 12, 14, 15). (B, d) Ca 2 + correntes e saltos capacitância de membrana foram evocados por uma despolarização passo de -70 a 0 mV. Tempo resolvido medições de capacitância de membrana usam um estímulo de 2 kHz sinewave sobreposta sobre o potencial de repouso segurando -70 mV 6. O traço vermelho é o valor médio dos dados dos pontos de capacitância. Note-se que o salto de capacitância na Figura 2b e 2d são ambos iguais a cerca de 200 fF.

Figura 3
Figura 3. Medidas diretas de Ca 2 + sinais de imagem, exocitose, e feedback inibitório em um Mb terminal de célula bipolar. (A) Um aumento transitório da concentração de Ca 2 + no telodendria de um terminal Mb foi ativada por um degrau de tensão despolarização-clamp de -70 a 0 mV para 200 ms (seta). Oregon Verde 488 BAPTA-1 (100 M), um indicador de Ca 2 + corante, foi incluído na pipeta patch. (B) imagem correspondente fluorescência do telodendria Mb (região de interesse indicada pela linha pontilhada vermelha). (C) a depressão de curto prazo sináptica da liberação de neurotransmissores (exocitose). Ca 2 + correntes (traço médio) e membrana de capacitância (traço inferior) evocada por um par de 20 despolarizações ms a 0 mV (traço superior; 200 ms intervalo inter-pulso). A seta indica o efeito de prótons exocytosed sobre o Ca 2 + atual e também a inibição GABAérgica comentários recíprocos da vizinha células amácrinas 15, 21. Note-se que a inibição de prótons mediado do Ca 2 + atual e também a GABInibição do feedback Aergic recíprocas estão presentes apenas na primeira resposta despolarizante, que também tem um salto de capacitância devido à exocitose de vesículas sinápticas.

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Discussion

Um passo crítico e difícil em nosso protocolo é a transferência do pedaço de retina na solução de agar (protocolo 3.4). É necessário remover cuidadosamente o humor vítreo e solução fatia residual do pedaço da retina e transferi-lo sem distorção ou flexão. A fim de conseguir isso, usamos uma pequena espátula (21-401-25B, Fisherbrand) com uma ponta dobrada para formar um ângulo de 90 °, juntamente com uma pinça ponta angulada (11251-35, Ferramentas Ciência Fine), para posicionar a retina peça durante todo o processo de transferência em solução fatia. Solução fatia residual sobre a fatia da retina e espátula pode ser removido por dabbing cuidado de superfície com o canto de um Kimwipes dobrado ou enrolado (Kimberly-Clark).

Outra forma comum de preparar fatias transversais da retina é o protocolo de filtro de papel baseado em 23. Resumidamente, um pedaço de retina invertida todo é anexado a um pedaço retângulo de Millipore disco de filtro (células ganglionares leigoser contra o papel de filtro, a camada de fotorreceptores para cima) e corte em fatias grossas 250 mM com um manual de "thumb" vertical slicer (por exemplo, Narishige ST-20). Nós achamos que as vantagens do protocolo em papel de filtro incluem fotorreceptores saudável e uma relação de aumento de axotomized aos terminais Mb intacta. Nós, portanto, use este método de papel de filtro para extrair respostas de luz evocada a partir de terminais Mb único embutido em fatias de retina.

As vantagens do nosso protocolo de agar-base sobre o protocolo em papel filtro são que 1) a fatia da retina produzida é plana, mesmo, e relativamente intacto com uma clara separação entre as camadas da retina, que permite a aplicação de patches em qualquer camada nuclear interna ou camada plexiforme da retina célula que é desejado, e 2) imunohistoquímica de gravação seguintes eletrofisiológico é realizado com mais facilidade por causa da geometria plana e intacta da fatia e os factores mencionados no item (1) acima. Um protocolo para registro das respostas luzs de neurônios da retina em uma preparação de agar-base foi publicado anteriormente em JOVE 2. A preparação fatia horizontal da retina que usou uma combinação de agar e técnicas de filtro de papel também foi anteriormente publicado na JOVE 5. Recomendamos assistir esses vídeos em combinação com a nossa própria para comparar as diferentes técnicas.

Acesso direto a fita do tipo terminais pré-sinápticos em vertebrados fatias da retina que nos permite investigar a transmissão sináptica em zonas de fita do tipo ativo. Também nos permite estudar diretamente a fisiologia sináptica na retina microcircuitos. Esta técnica será particularmente útil para gravações de pares de sinais de pré e pós-sinápticos, com parceiros incluindo a pós-sináptico inibitório células amácrinas e células ganglionares spiking 1, 16, 10. Gravações em fita-emparelhado tipo de sinapses entre os ratos coclear células ciliadas e dendritos aferentes são possíveis e têm sido descritos por 7. Cálcio Imaging dos terminais celulares Mb bipolar tem sido realizado em agudamente células dissociadas 8 e 17 da retina em fatias, bem como em células amácrinas goldfish 3. Estudos recentes têm mostrado grandes melhorias para in vivo e in vitro abordagens optogenetic em retina zebrafish transgênicos 4. Direções futuras provavelmente envolverá essas técnicas transgênicas, juntamente com métodos eletrofisiológicos, o que nos permitirá fazer a ponte entre em gravações fatia vitro e in vivo de imagens, em última instância, para estudos comportamentais.

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Disclosures

Nós não temos interesses concorrentes a divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Fred Rieke para o seu tipo de explicação o ágar-embedded preparação fatia da retina quando começamos a usar o protocolo em nosso laboratório. Agradecemos também a Lori Vaskalis para a ilustração do esquema visão geral e as Dras. Veeramuthu Balakrishnan e Soyoun Cho para comentários úteis no texto e vídeo. Este trabalho foi financiado por um NEI-NIH RO1 concessão, e também foi parcialmente financiado por uma Research Foundation Grant Coréia financiado pelo Governo coreano [KRF-2008-357-E00032].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low gelling-temperature agar Sigma-Aldrich A0701 Agarose type VII-A
Patch pipette World Precision Instruments, Inc. 1B150F-4 Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass
Vertical puller Narishige International PP830
Dental wax Cavex
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
45° angled fine tip forceps Fine Science Tools 11251-35
Razor blade Personna Medical Care Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O
Cylindrical tube Fisher Scientific 03-338-1B Polyethylene sample vials 2.5 ml
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H6254
Vibratome slicer Leica Microsystems VT1000S or VT1200S
Upright microscope Olympus Corporation BX51WI
60x water-immersion objective Olympus Corporation LUMPlanFl NA 0.90
CCD camera Sony Corporation XC-75
Camera controller Hamamatsu Corp. C2400
Monitor Sony Corporation 13” black and white monitor
Syringe filter Nalge Nunc international 0.2 μm
Micromanipulator Sutter Instrument Co. MPC-200
Lock-in amplifier HEKA Instruments EPC-9/10 amplifiers have software emulation
Spinning disk laser confocal microscope Yokogawa CSU-X1 Live cell imaging after patch clamp whole cell recording
Slidebook software Intelligent Imaging Instruments (3i) Imaging data acquisition and analysis
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate buffer solution GIBCO, by Life Technologies 70013
Superfrost slide Fisher Scientific Slide glass
Anti-fading agents Biomeda corp.
Confocal laser-scanning microscope Carl Zeiss, Inc. LSM 710 Imaging of fixed tissue
Spatula Fisher Scientific 21-401-25B
Manuel vertical slicer Narishige International ST-20
Oregon Green 488 BAPTA-1 Invitrogen O-6806 Ca2+ sensitive fluorescent dye
Alexa Fluor 555 Hydrazide Invitrogen A-20501MP Fluorescent dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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