Patch-clamp Misure di capacità e Ca 2 + Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette

Neuroscience

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Summary

Qui descriviamo un protocollo per la preparazione di agar-embedded fette della retina che sono adatti per elettrofisiologia e Ca2 + imaging. Questo metodo permette di studiare nastro di tipo sinapsi in microcircuiti della retina mediante diretta patch-clamp registrazioni dei singoli terminali nervosi presinaptici.

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Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices. J. Vis. Exp. (59), e3345, doi:10.3791/3345 (2012).

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Abstract

Stimoli visivi vengono rilevati e inoltrato su una ampia gamma dinamica di intensità di luce e variazioni di frequenza dai neuroni specializzati nella retina dei vertebrati. Due classi di neuroni della retina, fotorecettori e cellule bipolari, ottenere questo risultato utilizzando zone attive nastro tipo, che consentono il rilascio dei neurotrasmettitori sostenuta e high-throughput per periodi di tempo lunghi. ON-cellula bipolare di tipo misto (Mb) terminali nella retina pesci rossi, che depolarizzare agli stimoli luminosi e ricevere asta mista e di ingresso dei fotorecettori cono, sono adatti per lo studio delle sinapsi, sia a causa delle loro grandi dimensioni nastro di tipo (~ 10-12 micron di diametro) e per le loro numerose connessioni laterali e reciproca sinaptica con dendriti delle cellule amacrine. Accesso diretto ai terminali Mb cellule bipolari a fette pesci rossi della retina con la patch-clamp consente la misurazione di Ca 2 + presinaptico correnti, variazioni di capacità della membrana, e reciproca inibizione di feedback sinaptica mediata dal GABA <sub> recettori GABA A e C espresso sui terminali. Presinaptico misure membrana capacità di esocitosi permettono di studiare a breve termine plasticità del rilascio di neurotrasmettitore eccitatorio 14,15. Inoltre, la plasticità a breve termine ea lungo termine del rilascio di neurotrasmettitore inibitorio da parte delle cellule amacrine possono anche essere indagato da registrazioni di inibizione reciproca di feedback che arrivano al terminal Mb 21. In brevi periodi di tempo (ad esempio ~ 10 s), GABAergici inibizione di feedback reciproco a partire da cellule amacrine subisce accoppiato impulsi depressione attraverso l'esaurimento GABA piscina vescicola 11. La dinamica sinaptica di microcircuiti retina nello strato plessiforme interno della retina può quindi essere direttamente studiato.

Il cervello-fetta tecnica è stata introdotta più di 40 anni fa ma è ancora molto utile per lo studio delle proprietà elettriche dei neuroni, sia a singola cellula soma, dendriti singolo o assone, e microcircuit livello sinaptico 19. Tessuti che sono troppo piccole per essere incollato direttamente sulla camera di taglio sono spesso incorporati in prima agar (o la collocazione in una carta da filtro) e poi a fette 20, 23, 18, ​​9. In questo video, ci avvaliamo di pre-embedding tecnica di agar con retina pesci rossi. Alcuni dei giganti terminali delle cellule bipolari nelle nostre fette di retina pesci rossi sono axotomized (assone-cut) durante la procedura di taglio. Questo ci permette di isolare singoli ingressi terminale nervoso presinaptico, perché la registrazione da terminali axotomized esclude i segnali dal soma-dendritiche vano. In alternativa, si può anche registrare da intatto Mb cellule bipolari, registrando dai terminali collegati a assoni che non sono stati tagliati durante la procedura di taglio. Nel complesso, l'uso di questo protocollo sperimentale sarà di aiuto negli studi di fisiologia sinaptica della retina, l'analisi funzionale microcircuito, e la trasmissione sinaptica di sinapsi nastro.

Protocol

1. Soluzioni interne ed esterne

  1. Preparare la soluzione per affettare (calcio) dalla soluzione madre 10x e aggiungere MgCl 2, CaCl 2 e D-glucosio tutti i giorni. La soluzione finale è costituito da 1x (in mm): 119 NaCl, 2.5 KCl, 3.2 MgCl2, 0,25 CaCl 2, 12 D-glucosio, 0,2 acido L-ascorbico, 12 HEPES. Impostare il pH a 7.4 (con NaOH), e regolare osmolarità di 260 mOsm (con H 2 O e la soluzione madre 10x).
  2. Pesare il 3% a bassa temperatura gelificante agar (agarosio tipo VII-A, A0701, Sigma, Rieke, 2001) e mescolare con taglio soluzione. Riscaldare la soluzione contenente agar in un forno a microonde per 1-2 minuti, o fino a quando non si dissolve completamente, e incubare l'agar in un bagnomaria (30-33 ° C) per impedire la rapida solidificazione (temperatura di transizione gel: 26 ± 2 ° C).
  3. Preparare la soluzione di registrazione (di calcio normale) dalla soluzione madre 10x e aggiungere MgCl 2, CaCl 2 e D-glucosio tutti i giorni. La coerenza soluzione finale 1xtrasversale (in mm): 100 NaCl, 2.5 KCl, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 0,2 L-ascorbico, 2,5 CaCl 2, 12 D-glucosio. Dopo la soluzione bolle nel 95% di CO O 2 / 5% 2 (CarboGen) per 5-10 minuti, impostare il pH a 7.4 (con NaOH), e regolare osmolarità di 260 mOsm (con H 2 O e la soluzione madre 10x).
  4. Aliquote (1 ml ciascuna) di soluzioni interne pipetta vengono preparati in anticipo e conservati in un congelatore (-20 ° C). Due soluzioni pipetta interni sono tipicamente utilizzati per isolare le correnti di calcio delle cellule bipolari (in mm):
    1. CsCl 40, 60 Cs-gluconato, 10 tetraetilammonio (TEA)-Cl, 28 HEPES, 3 Mg-ATP, 1 Na-GTP, e 2 EGTA. Regolare il pH a 7,2 (con CsOH) e osmolarità impostato a 250 mOsm. Questa soluzione di cloruro di alta interno fornisce tipicamente inferiore registrazioni resistenza in serie (migliori condizioni clamp di tensione) e più grandi correnti post-sinaptiche inibitorie (iPSCs) ad un potenziale di membrana delle cellule bipolari a riposo di -60 mV.
    2. 95 CA-gluconato, 10 TEA-Cl, 25 HEPES, 3 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP, e 0,5 EGTA. Regolare il pH a 7,2 (con CsOH), e impostare osmolarità di 250 mOsm 22. Questa bassa EGTA soluzione interna porta normalmente a cambiamenti della membrana superiore capacità indotte da impulsi depolarizzanti passo e permette così gli studi di deplezione delle vescicole piscina ea breve termine depressione.

2. Patch-clamp pipetta elettrodi

  1. Preparare a parete spessa (1,5 mm di diametro esterno) in vetro borosilicato (1B150F-4; Strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL) e tirare le pipette di patch con un estrattore verticale (Narishige, PP830, Tokyo, Giappone). Resistenze pipetta open-cerotto punta a soluzioni di registrazione sono 7-8 MΩ quando la pipetta viene riempito con una soluzione interna pipetta # 1.
  2. Rivestire la patch-pipetta in modo uniforme, dalla punta al livello del pozzo che raggiunge il titolare pipetta, con impronte dentarie (Cavex, West Chester, PA). Ciò ridurrà la capacità pipetta e rumore elettrico e consentirepiù accurata e basso rumore misure di capacità. Una capacità pipetta bassa aiuta anche la compensazione elettronica C-veloce (capacità veloce) della CBE-9 (o EPC-10) amplificatore di patch clamp.

3. Preparazione di agar-embedded fette della retina

  1. Selezionare un pesce rosso (Carassius auratus, 8-16 cm) e posto in un secchio coperto in una stanza buia per 30 minuti di adattamento al buio. Dopo l'anestesia, eutanasia il pesce rosso sedato per decapitazione rapido e doppio enervazione del midollo spinale e tronco encefalico. Quindi rimuovere gli occhi con le forbici a punta ricurva e curve punta pinzette. Queste procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC) presso l'Oregon Health & Science University.
  2. Hemisect ciascun occhio, tagliando in modo uniforme intorno alla parte anteriore dell'occhio con le forbici a molla (15003-08, Strumenti Scienze Arti; avviare tagliate da foratura con punte a forbice), e posto le conchiglie oculari in soluzione fetta fresco (calcio). Se necessary, rimuovere la lente con una pinzetta (la lente di solito staccare con la parte anteriore dell'occhio). Rimuovere la retina con dell'epitelio pigmentato attaccato utilizzando una coppia di 45 ° pinze punta angolata bene (11251-35, Strumenti Scienza Fine) per sbucciare la retina dalla oculare, procedendo lentamente intorno al 360 °. Sever o tagliare il nervo ottico o con una pinza sottile o forbici primavera. Togliere delicatamente la retina con una combinazione di angolo pinze punta fine e aspirazione applicata da una pipetta Pasteur modificata o bonifico pipetta (punta di grandi dimensioni). Usa angolato pinze punta fine di rimuovere il resto del dell'epitelio pigmentato collegato alla retina. La superficie della retina pulito e sano dovrebbe apparire scuro, liscio e di colore rosso. Per la rimozione completa di tutte le cellule dell'epitelio pigmentato scuro scuro adattare la retina per 1 ora (8, 1992).
  3. Trattare retina isolata con ~ 0,03% (peso / volume; ~ 0,36 mg / ml soluzione a 1x fetta) ialuronidasi (3; H6254, Sigma) per 15-30 minuti a temperatura ambientetemperatura (20-23 ° C) per rimuovere vitreo. Durante questa incubazione, si può preparare ghiacciata soluzione fetta.
  4. Tagliare un pezzo rettangolare di retina (~ 2x2 millimetri, contenente l'intero spessore della retina) rimuovendo i bordi curvi con un piccolo segmento della lama di un rasoio (Personna, a doppio taglio, puliti con etanolo al 70% e H 2 O) allegata al il corpo di una siringa di plastica da 1 ml, e trasferire il pezzo della retina di un piccolo contenitore riempito con soluzione di agar (preparata in (1.2)). Cercare di minimizzare la quantità di soluzione attorno alla retina, in quanto è inserito nel agar liquido. Immergere direttamente nella ghiacciata soluzione slice (preparata in (3.3)) per solidificare l'agar 20, 18, ​​9. Usiamo un piccolo contenitore a mano. In breve, un piccolo tubo cilindrico (Fisherbrand, fiale campione di polietilene da 2,5 ml, 03-338-1B) è stato tagliato alle due estremità e sigillato con Parafilm (PM-996, Pechiney imballaggi in plastica) patch.
  5. Tagliare il blocco solido agar in un 1x1x1 cubo cm contenente il pezzo rettangolare di retina.
  6. Trasferire il blocco alla camera fetta e la colla alla superficie del piatto di taglio. La camera di fetta è pre-raffreddato in freezer (-20 ° C). Tagliare il blocco in fette 200-250 micron di spessore con una affettatrice Vibratome (VT1000S o VT 1200S, Leica), in gelide soluzione fetta. Un totale di 5 a 10 sezioni possono essere ottenuti, che sono vitali per circa 5 o 6 ore.
  7. Trasferire una delle fette alla camera di registrazione. Posizionare una griglia di fili di nylon incollato a U telaio platino 19 sulla parte superiore della fetta, e profumato in continuo (tasso di 1-2 ml al minuto) con la soluzione di registrazione bollito con il 95% O 2 / 5% di CO 2 (CarboGen ).

Risoluzione dei problemi:

Se il pezzo della retina incorporati nel blocco di agar è staccato o esce dalla agar durante affettare, si può aumentare lo spessore della fetta da 200 micron fino a 300 micron, con incrementi di 20 micron. Anche cercare di minimizzare la quantità di soluzione attorno alla retina, in quanto è trasferito e messo in agar liquido risucchiando soluzione in più con una punta di carta arrotolato "Kimwipe". Un altro modo per evitare questo problema è quello di ridurre le dimensioni del pezzo della retina inizialmente inserito nel agar. Perché vitreo vieta agar da completamente connessi con il pezzo della retina, può essere necessario fare ialuronidasi freschi o regolare il tempo di incubazione (step (3.3)).

4. Identificazione del terminale cellula bipolare sinaptica in una fetta della retina

  1. Posizionare la fetta della retina sotto il microscopio in posizione verticale (ad es BX51WI, Olympus). Riteniamo che la fetta della retina con differenziale a raggi infrarossi interferenze contrasto (IR-DIC) ottica 60x acqua attraverso un obiettivo ad immersione (NA 0,90, Olympus) e CCD (XC-75, Sony). L'uscita della camera CCD viene inviato a un controller di telecamera (C2400, Hamamatsu) per migliorare il contrasto prima di visualizzazione su un analogico Sony 13 "Black e bianco del monitor. Il microscopio è montato su una fase di traduzione XY, e la camera di registrazione è posto su un 14 tappa fissa.
  2. Trovare sia intatta e axotomized (assone-cut) i terminali delle cellule bipolari, che possono essere identificati dalle loro dimensioni, forma e posizione nel slice (Figura 1). Axotomized terminali ed intatto può anche essere distinto con l'esame della loro capacitivo tempi transitori di decadimento in corso (singolo decadimento esponenziale rispetto a doppio esponenziale, rispettivamente) e Ca 2 + correnti (Figura 2, 12, 14, 15). Terminali mb si trovano nello strato più prossimale del sublamina b (ON-tipo di livello, adiacente allo strato di cellule gangliari) nello strato plessiforme interno della retina pesci rossi. Terminali mb, con la loro superficie opaca e l'aspetto piatto, può essere facilmente distinto da ganglio e sfollati somas amacrine, che appaiono fase luminosa e sferica. Inoltre, il bordo dei terminali Mb è ricoperto da un altodensità di contatti sinaptici, e appare ruvida e irregolare rispetto alle superfici lisce e pulite delle cellule gangliari e amacrine (Figura 1a-c). Axotomized terminali Mb apparire circolare intorno e vicino (Figura 1c), mentre i terminali intatti appaiono ellittica e allungata, spesso con un finale pizzicato punta verso lo strato nucleare interno della retina (Figura 1a, b).
  3. Terminali danneggiati o malsano spesso aspetto gonfio e visualizzare numerose piccole strutture granulari sulla superficie. Potrebbe essere possibile ottenere una tenuta GΩ su questi terminali, ma è probabile che la rottura subito dopo il rodaggio. Altri segni di terminali malsano includono un cavo aspetto, il contrasto e / o la luminosità identica a quella fetta circostante, ea volte posizione sulla superficie della fetta. E 'possibile registrare sia dai terminali sano nel profondo della fetta (vantaggio: più intatta circuiti sinaptici) e anche vicino alla superficie della fetta (advantage: accesso più rapido ai farmaci perfusi nella soluzione esterna, più facile da sigillare).

5. Le registrazioni elettrofisiologiche e Ca 2 + di imaging

  1. Utilizzando una siringa con una punta 0,2 micron filtro (Nalgene), riempire la pipetta di patch di vetro con una soluzione interna a un livello di 1-2 centimetri dal retro della pipetta. Dopo aver rimosso le bolle d'aria dalla punta, fissare la pipetta nel supporto, si applica una pressione positiva (1,2-1,6 psi), e spostarlo verso il terminale mirato con un micromanipolatore (MPC-200, strumento Sutter). Mentre si muove la punta verso il basso attraverso la fetta, spostare la pipetta in direzione laterale radicali per garantire che la fetta non si tira con la punta.
  2. Spostare la punta della pipetta attorno al terminale per pulire la superficie della membrana. Spingere la punta verso il basso sul bordo del terminale per creare una fossetta (trattino), e rilasciare la pressione positiva. Se un sigillo GΩ non si forma subito, applicare una leggera pressione negativa. Dopo un sigillo GΩ, passare alla modalità on-cellula registrazione dell'amplificatore morsetto EPC-9 patch e cambiare il potenziale tenendo a -60 o -70 mV. Applicare il C-veloce (fast-capacità) di correzione, attendere che il sigillo si stabilizzi tra GΩ 5-10, e poi la rottura della membrana, con pieghe, aspirazione delicata applicata per via orale per stabilire la cellula intera configurazione della registrazione. Se la cellula intera configurazione è stata correttamente stabilita, resistenza serie saranno tra 14-30 MW. Resistenza di ingresso saranno 200-500 MΩ per terminali integro e GΩ 1-3 per i terminali axotomized 14.
  3. Osservare il transitorio corrente capacitiva (Figura 2a e 2c), per distinguere tra i terminali bipolari intatto e axotomized cellulare. Terminali Mb intatto e axotomized hanno una capacità membrana basale di 9-16 e 3-8 pF pF, rispettivamente.
  4. Applicare una durata di 200 ms voltage-clamp passo da -70 a 0 mV a un terminale axotomized Mb. Questo permetteràla misura diretta di grandi dimensioni (~ 200-600 PA), isolato verso l'interno Ca 2 + correnti attivati ​​con l'apertura di voltaggio-dipendenti di tipo L Ca 2 + canali (Figura 2b). In parallelo, si è in grado di monitorare il salto di capacità causata dalla esocitosi delle vescicole sinaptiche, e la rapida, pH-mediata di Ca 2 + corrente che segue esocitosi 15, e GABAergici inibizione di feedback reciproco (Figura 3 quater; 22). Se una patch intatta Mb terminale delle cellule bipolari il risultato sarà come mostrato nella Figura 2 quater e 2 quinquies. Non riconoscibile Ca 2 + correnti sono stati osservati a causa della grande "fuga" correnti a causa di gap-junction accoppiamento nella dendriti delle cellule bipolari Mb 1.
  5. Variazioni di capacità della membrana può essere evocato da una depolarizzazione passo dal potenziale detenzione di -70 mV a 0 mV con il "sine + DC" metodo di tempo risolto misure di capacità della membrana 6. Salta capacità membrana indicare la fusione delle vescicole sinaptiche con la membrana plasmatica. A 2 kHz sinusoidale di tensione-clamp comando (30 mV picco-picco) è stata aggiunta alla potenziale detenzione di -70 mV. La corrente di registrazione è stato analizzato in due angoli di fase ortogonali dal CPE-9 patch-clamp emulazione software di un amplificatore amplificatore lock-in (HEKA, Lambrecht, Germania). Nel terminale intatto della figura 2d, una frequenza elevata (2 kHz) confini stimolo sinusoidale la capacità di membrana che viene analizzata per il terminale e terminazioni degli assoni, che hanno una capacità di base Cm ~ 6,8 pF. La membrana del corpo cellulare e dei dendriti delle cellule bipolari sono quindi filtrati per la frequenza ad alta tensione-clamp sinusoidale 13.
  6. Per Ca 2 +-imaging esperimenti, mescolare la soluzione interna con una pipetta di patch Ca 2 +-sensitive colorante fluorescente (es. Oregon verde 488 Bapta-1 (100-200 mM; O-6806, Invitrogen)) e ripetere il protocollo da 50,1-5,5. Questo permetterà di unire l'imaging di fluorescenza e registrazione elettrofisiologica. Per esempio, è possibile l'immagine del Ca 2 + transitoria associata con un passo di 200 ms da -70 a 0 mV nel appendici piccolo telodendria del terminale Mb (Figura 3a, b). Abbiamo integrato il nostro microscopio verticale Olympus con un sistema di filatura microscopio laser confocale disco (CSU-X1, Yokogawa). Il microscopio confocale utilizza 488 nm e 561 nm linee laser che vengono modulate da un acusto-ottico filtro sintonizzabile. I dati vengono acquisiti tramite Slidebook software (3i; Intelligent Imaging Instruments). Per ulteriori dettagli sulle tecniche di imaging del calcio con i neuroni della retina pesci rossi vedere 24, 17, 3.

Risoluzione dei problemi:

Se uno non riesce spesso a creare una cellula intera configurazione, anche dopo la formazione di un sigillo stabile GΩ, può essere utile per ridurre la pressione negativa utilizzato per forare il terminale mimbrane. Può anche essere il caso che la pressione di aspirazione ottimale per la creazione di cellula intera configurazione varia in funzione della curvatura della membrana (soma> terminale). E 'anche possibile utilizzare un protocollo di zap (ampiezza: 400 mV, Durata: 100 ms) per entrare nella cellula intera configurazione, da soli o in combinazione con un impulso di forte pressione negativa. Abbiamo trovato il protocollo zap essere particolarmente utile per la break-in quando si utilizza un puntale con un bagno di resistenza superiore a 12 MW.

6. Rappresentante Risultati

Figura 1
Figura 1. Identificazione di Mb terminali delle cellule bipolari a fette pesce rosso della retina. (Ac) IR-DIC immagini di Mb terminali delle cellule bipolari. Siamo in grado di identificare i terminali probabile axotomized (assone-cut) e ancora intatto nel IR-DIC immagine. Un terminale axotomized appare rotonda e circolare, come mostrato in cmentre un terminale intatto è più probabile ad apparire ellittico, come mostrato in a e b. Questa classificazione può essere confermata con la misurazione della capacità transitorie (vedere figura 2) o con il metodo di tintura di riempimento (d - f). Freccia rossa indica la posizione della intersezione tra l'assone e il terminale assonale per i terminali intatto in a e b. Linea rossa punteggiata indicato il contorno di Mb terminali delle cellule bipolari. (Df). Immagini di fluorescenza di Mb terminali delle cellule bipolari con un assone intatto (d), un assone parzialmente tagliato (e), o completamente rimosso assone (f). Alexa 555 (A20501MP, Invitrogen) colorante fluorescente è stato riempito con una soluzione interna prima della registrazione. Subito dopo la patch-clamp registrazione, la fetta della retina è stato trasferito in 4% (peso / volume) paraformaldeide (P6148, Sigma) in soluzione tampone fosfato (70013, GIBCO) e incubate per 30min. Fette sono state montate su vetrini Superfrost (Fisher Scientific) nel mezzo di montaggio acquoso con l'anti-sbiadimento agenti (Biomeda corp). Alexa 555 Mb contenente i terminali delle cellule bipolari sono stati visti con una linea di laser a 555 nm (rosso) con un 40x acqua immersione obiettivo su un laser confocale, microscopio a scansione (LSM 710, Carl Zeiss). Si noti la presenza di piccole appendici telodendria sporgenti dai terminali dell'assone (frecce blu). Barra di scala indicano 10 micron (a - f). INL: strato nucleare interno, IPL: strato interno plessiforme, GCL: strato delle cellule gangliari.

Figura 2
Figura 2. Proprietà elettriche di axotomized e intatta Mb terminali delle cellule bipolari. (A, c) Transitorio di corrente attivato da una tensione di-clamp iperpolarizzazione passo dal potenziale detenzione di -60 mV a -70 mV. La risposta corrente di corto ad una tensione di -10 mV-clamp passopuò portare a: 1) un singolo veloce decadimento esponenziale corrente con resistenza di ingresso elevata a -70 mV (indicativo di un terminale axotomized; pannello a), o 2) un doppio decadimento esponenziale con bassa resistenza di ingresso a -70 mV (indicativo di uno intatto terminale; pannello c, vedi anche 12, 14, 15). (B, d), Ca 2 + correnti e salti capacità di membrana sono stati evocati da una depolarizzazione passo da -70 a 0 mV. Risolta in tempo misure di capacità membrana utilizzare un 2-kHz stimolo sinusoidale sovrapposto sul potenziale tenendo a riposo di -70 mV 6. La traccia rossa è il valore medio dei punti di capacità dati. Si noti che il salto di capacità nella Figura 2b e 2d sono entrambi pari a circa 200 fF.

Figura 3
Figura 3. Misurazioni dirette di Ca 2 + segnali di imaging, esocitosi, e il feedback inibitorio in un Mb bipolare cellula terminale. (A) Un aumento transitorio della concentrazione di Ca 2 + nel telodendria di un terminale Mb è stato attivato da una tensione-clamp depolarizzazione passo da -70 a 0 mV per 200 ms (freccia). Oregon verde 488 Bapta-1 (100 micron), a Ca 2 + indicatore colorante, è stata inclusa nella pipetta da patch. (B) l'immagine corrispondente fluorescenza della telodendria Mb (regione di interesse indicata dalla linea rossa tratteggiata). (C) a breve termine depressione sinaptica rilascio di neurotrasmettitore (esocitosi). Ca 2 + correnti (al centro tracce) e della membrana di capacità (in basso a tracce) evocato da una coppia di 20 depolarizzazioni ms a 0 mV (traccia superiore; 200 ms tra impulsi intervallo). La freccia indica l'effetto di protoni exocytosed il Ca 2 + corrente e anche l'inibizione GABAergica di feedback reciproco dalla vicina cellule amacrine 15, 21. Si noti che il protone-mediata del Ca 2 + corrente e anche il GABAergic inibizione di feedback reciproci sono presenti solo nella prima risposta depolarizzante, che ha anche un salto di capacità a causa della esocitosi delle vescicole sinaptiche.

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Discussion

Un passo importante e difficile nel nostro protocollo è il trasferimento del pezzo di retina nella soluzione di agar (protocollo 3.4). E 'necessario rimuovere con attenzione il vitreo e la soluzione fetta residua dal pezzo della retina e trasferirlo senza distorsioni o piegature. Per fare questo, usiamo una piccola spatola (21-401-25B, Fisherbrand) con una punta piegata a formare un angolo di 90 °, insieme con una pinza punta angolata (11251-35, Strumenti Scienza Fine), di posizionare la retina pezzo durante il processo di trasferimento in soluzione fetta. Soluzione fetta residua sulla fetta della retina e spatola può essere rimosso tamponando attento di superficie con un angolo di un Kimwipes piegati o arrotolati (Kimberly-Clark).

Un altro modo comune per preparare fette trasversali della retina è il filtro di carta protocollo basato su 23. In breve, un pezzo di retina invertita tutto è attaccato ad un pezzo di rettangolo su disco filtro Millipore (cellule gangliari laicier contro la carta da filtro, strato dei fotorecettori verso l'alto) e tagliate a fette spesse 250 micron, con un manuale verticale "pollice" affettatrice (ad esempio Narishige ST-20). Troviamo che i vantaggi del filtro di carta protocollo basato su comprendono sano fotorecettori e un rapporto di aumento di axotomized ai terminali Mb intatto. Abbiamo quindi utilizzare questo metodo filtro di carta per ottenere risposte luce evocati dai terminali Mb singolo integrato a fette della retina.

I vantaggi del nostro agar-protocollo basato sul filtro di carta protocollo basato su sono che: 1) la fetta della retina prodotto è piatta, anche, e relativamente intatta con una chiara separazione tra gli strati della retina, che permette l'applicazione di patch, in ogni strato interno nucleare o strato plessiforme retinico cella che si desidera, e 2) immunoistochimica registrazione seguente elettrofisiologico viene eseguita più facilmente a causa della geometria piana e intatto della fetta e dei fattori di cui al punto (1) di cui sopra. Un protocollo per la registrazione di risposta luces dei neuroni della retina in un preparato a base di agar è stato precedentemente pubblicato in JOVE 2. Una preparazione orizzontale fetta della retina che ha utilizzato una combinazione di agar e tecniche di carta da filtro, è stato anche precedentemente pubblicato in JOVE 5. Si consiglia di guardare questi video in combinazione con la nostra per confrontare le diverse tecniche.

Accesso diretto ai terminali presinaptici nastro di tipo a fette della retina dei vertebrati ci permette di indagare la trasmissione sinaptica in zone attive del nastro tipo. E ci permette anche di studiare direttamente la fisiologia sinaptica in microcircuiti della retina. Questa tecnica è particolarmente utile per le registrazioni dei segnali accoppiati pre-e post-sinaptica, con partner tra cui inibitori postsinaptici cellule amacrine e spiking cellule gangliari 1, 16, 10. Registrazioni abbinato a nastro di tipo sinapsi tra le cellule di ratto cocleari capelli interiore e dendriti afferenti sono possibili e sono stati descritti da 7. Calcio immaginariong dei terminali delle cellule bipolari Mb è stata effettuata in cellule acutamente dissociate 8 e 17 della retina a fette, così come pesci rossi nelle cellule amacrine 3. Recenti studi hanno dimostrato grandi miglioramenti in vivo e in vitro approcci optogenetic in zebrafish transgenico retina 4. Direzioni future probabilmente coinvolgere queste tecniche transgeniche, unitamente ai metodi elettrofisiologici, che ci permetterà di colmare il divario tra registrazioni in fetta vitro e in vivo imaging, il cui termine ultimo per studi comportamentali.

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Disclosures

Noi non abbiamo concorrenti interessi di rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo il Dr. Fred Rieke per la sua spiegazione del tipo di agar-embedded preparazione fetta della retina quando abbiamo iniziato con il protocollo nel nostro laboratorio. Ringraziamo anche Lori Vaskalis per l'illustrazione del schematica panoramica e Drs. Veeramuthu Balakrishnan e Soyoun Cho per gli utili commenti sul testo e video. Questo lavoro è stato supportato da una NEI-NIH RO1 concessione, ed è stato anche parzialmente sostenuto da una ricerca Korea Foundation Grant finanziato dal governo coreano [KRF-2008-357-E00032].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low gelling-temperature agar Sigma-Aldrich A0701 Agarose type VII-A
Patch pipette World Precision Instruments, Inc. 1B150F-4 Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass
Vertical puller Narishige International PP830
Dental wax Cavex
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
45° angled fine tip forceps Fine Science Tools 11251-35
Razor blade Personna Medical Care Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O
Cylindrical tube Fisher Scientific 03-338-1B Polyethylene sample vials 2.5 ml
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H6254
Vibratome slicer Leica Microsystems VT1000S or VT1200S
Upright microscope Olympus Corporation BX51WI
60x water-immersion objective Olympus Corporation LUMPlanFl NA 0.90
CCD camera Sony Corporation XC-75
Camera controller Hamamatsu Corp. C2400
Monitor Sony Corporation 13” black and white monitor
Syringe filter Nalge Nunc international 0.2 μm
Micromanipulator Sutter Instrument Co. MPC-200
Lock-in amplifier HEKA Instruments EPC-9/10 amplifiers have software emulation
Spinning disk laser confocal microscope Yokogawa CSU-X1 Live cell imaging after patch clamp whole cell recording
Slidebook software Intelligent Imaging Instruments (3i) Imaging data acquisition and analysis
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate buffer solution GIBCO, by Life Technologies 70013
Superfrost slide Fisher Scientific Slide glass
Anti-fading agents Biomeda corp.
Confocal laser-scanning microscope Carl Zeiss, Inc. LSM 710 Imaging of fixed tissue
Spatula Fisher Scientific 21-401-25B
Manuel vertical slicer Narishige International ST-20
Oregon Green 488 BAPTA-1 Invitrogen O-6806 Ca2+ sensitive fluorescent dye
Alexa Fluor 555 Hydrazide Invitrogen A-20501MP Fluorescent dye

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References

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