Revelando la topografía del circuito neuronal en el Multi-Color

Neuroscience

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Summary

Ofrecemos una guía práctica para la entrega de los trazadores

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Reeber, S. L., Gebre, S. A., Filatova, N., Sillitoe, R. V. Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color. J. Vis. Exp. (57), e3371, doi:10.3791/3371 (2011).

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Abstract

Circuitos neuronales se organizan en funcionamiento los mapas topográficos. Con el fin de visualizar la arquitectura de circuitos complejos, hemos desarrollado un enfoque para la etiqueta de forma fiable el patrón global de múltiples proyecciones topográficas. El cerebelo es un modelo ideal para estudiar la disposición ordenada de los circuitos neuronales. Por ejemplo, la organización compartimental de espinocerebelosa fibras musgosas ha demostrado ser un sistema indispensable para el estudio de los patrones de las fibras musgosas. Recientemente hemos demostrado que el germen de trigo crioaglutininas (WGA) conjugado con Alexa 555 y 488 se puede utilizar para rastrear espinocerebelosa proyecciones de las fibras musgosas en el desarrollo y los ratones adultos (Reeber et al. 2011). Se encontraron tres propiedades principales que hacen que las herramientas de Alexa WGA-trazadores deseable para el etiquetado de las proyecciones neuronales. En primer lugar, fluoróforos Alexa son intensos y su brillo permite obtener imágenes wholemount directamente después de rastrear. En segundo lugar, WGA-Alexa trazadores etiqueta de toda la trayectoria de desarrollo y adultos projectio neuralns. En tercer lugar, WGA-Alexa trazadores son transportados rápidamente en ambas direcciones, retrógrada y anterógrada. A continuación, describimos en detalle la forma de preparar los trazadores y otras herramientas necesarias, la forma de realizar la cirugía para espinocerebelosa localización y la mejor forma de proyección de imágenes trazadas en tres dimensiones. En resumen, ofrecemos un protocolo de paso a paso el seguimiento que será útil para descifrar la organización y la conectividad de los mapas funcionales, no sólo en el cerebelo, sino también en la corteza cerebral, tronco cerebral y médula espinal.

Protocol

1. La entrega de los marcadores en vivo mediante cirugía estériles (Secciones 1.1 a 1.16)

Durante todo el procedimiento, le aconsejamos que las técnicas quirúrgicas estériles utilizar. Esto incluye el uso de guantes estériles, bata y mascarilla. Herramientas o bien deben ser esterilizados en autoclave antes del uso o de limpiar a fondo con agua y etanol. Durante la cirugía, y especialmente entre los animales, fragmentos de limpiar el tejido de las herramientas y los instrumentos de esterilización en seco con un esterilizador de cuentas en caliente (Steri 250 cat. # 18000-45, Herramientas de Bellas Ciencia). Además, es fundamental que usted organice su espacio de trabajo de tal manera que usted tiene áreas designadas para la preparación de los animales (de afeitar, etc), la cirugía, y un área de recuperación donde se puede controlar fácilmente el animal, se calienta, y se suministra con analgésicos según sea necesario. La clave para la supervivencia de las cirugías exitosas es el de reducir el riesgo de infección y mantener una agresiva estrategia de post-operatorio de atención. Por favor refiérase a la tabla donde se puede aletad todo el equipo necesario y los reactivos para este protocolo.

  1. Anestesiar a ratones adultos con recién preparada Avertin (2,2,2-tribromoetanol, Sigma, St. Louis MO,. Cat. # T48402) a través de una vía intraperitoneal (ip) con una dosificación de peso corporal 0.2ml/10grams. Otros anestésicos como el isoflurano o ketamina / xilazina son igualmente eficaces, pero asegúrese de que su laboratorio cuenta con la aprobación institucional necesaria y federales antes de su uso. Si está utilizando los cachorros (P0 - P10), puede anestesiar el hielo picado durante 10-15 minutos. Asegúrese de que la piel de las crías no está en contacto directo con el hielo (por ejemplo, colocándolos en los dedos de los guantes de látex) cuando el agua fría rápidamente inducir un nivel letal de hipotermia. Confirmar que el animal está bajo un claro aceptable de la anestesia mediante la realización de una pizca dedo con unas pinzas o los dedos de las patas de los animales traseras. Si hay un reflejo de pedal, espere hasta que el animal no responde a este estímulo como una indicación de una profundanormal de la anestesia.
  2. Una vez que el animal está completamente anestesiado que estaba con la cara dorsal sobre una gasa estéril con la cabeza de espaldas a usted y su cola hacia usted. Afeitarse el pelo con una maquinilla de pelo con el fin de darse un campo quirúrgico claro que es lo suficientemente amplia como para tener acceso al sistema nervioso central. Limpie la zona afeitada con dos juegos de toallitas con alcohol, entonces 70% de alcohol / betadine, y luego limpiar una vez más con toallitas con alcohol. Use un patrón circular en el interior de fuera de la limpieza del área quirúrgica. Usted puede elegir para delimitar claramente el campo quirúrgico mediante la reducción de un pequeño agujero en un trozo de gasa estéril y colocar la apertura sobre el sitio quirúrgico afeitado y limpio. A pesar de mantener el campo quirúrgico estéril puede ser difícil cuando se trabaja en pequeños animales, ello ayudará a reducir el riesgo de infección.
  3. Levante la piel con las pinzas y hacer una incisión con unas tijeras en la línea media justo encima de la torácica inferior-superior r lumbaregión. La región torácica inferior-superior región lumbar se puede identificar mediante la ejecución de su dedo a lo largo de las vértebras para sentir una protuberancia en la columna vertebral (Fig. 1).
  4. Cortar la fascia superficial y los músculos espinales. Si es necesario, detener el sangrado mediante la cauterización de los vasos sanguíneos (Herramientas Artes Ciencia, Foster City, CA,. Cat. # 18000-00). En las crías, aplicando una presión suave alrededor de la incisión con hisopos de algodón es suficiente para detener el sangrado.
  5. Realizar una laminectomía dorsal mediante la eliminación de las apófisis espinosas de uno o dos segmentos de la torácica inferior - superior de la médula espinal lumbar después de cortar la lámina en ambos lados de la columna vertebral a medio camino, entre el proceso de articular y de la apófisis espinosa dorsal (Fig. 2) . Tenga cuidado de no dañar la médula espinal con las tijeras y siempre extraer los fragmentos de hueso pequeño, ya que podría lacerar la médula espinal. Tenga en cuenta que la columna vertebral a principios de los cachorros después del parto no está completamente osificado, lo que significa que los huesos son muysuave y se puede cortar con facilidad. Por lo tanto, tenga cuidado de no cortar demasiado profundo, ya que puede dañar la médula espinal.
  6. Si usted prefiere no realizar una laminectomía dorsal de ratones adultos, hemos encontrado que se puede cortar el tejido blando entre los segmentos vertebrales para exponer una pequeña región de la médula espinal sin necesidad de cortar cualquier hueso. Aunque ambos métodos son vías efectivas de entrada en la médula espinal, evitando una laminectomía dorsal puede asegurarse de que la médula espinal permanece en buen estado.
  7. Llenar un electrodo de vidrio tirado (vidrio borosilicato capilares; Cat. # 300056, Harvard Apparatus, Holliston, MA;. De dos etapas de vidrio Micropipetas Extractor de Narishige Modelo 001-PC-10) con su marcador con una jeringa micrométrica (0,2 ml; Gilmont Instrumentos gato . # GS-1100) o un aparato equivalente de entrega.
  8. Apriete los microelectrodos de vidrio en lugar de un micromanipulador e insertar el electrodo de 0.1-0.5mm en la torácica inferior-superior región lumbar de la médula espinal a medio camino entre mediados de los añoslínea y el borde lateral de la médula espinal. El animal puede ser realizada en un aparato estereotáxico para la identificación precisa de los lugares de inyección y para la estabilización del animal (Modelo de Pequeños Animales estereotáxica Instrumento 940-A y el modelo de electrodo 960 Manipulador de Instrumentación Kopf). Por otra parte, si el régimen de anestesia se puede adaptar para conseguir un avión estable sin movimientos significativos debido a la respiración profunda, suave grabación del animal, será suficiente.
  9. La presión de inyección en la médula espinal durante 3-5 minutos aproximadamente 0.5μl de una solución al 2% de WGA-Alexa 488 (aglutinina de germen de trigo, Alexa Fluor 488 conjugada;. Cat. # W11261, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 555 (aglutinina de germen de trigo, Alexa Fluor 555 conjugada;. Cat. # W32464, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 350 (aglutinina de germen de trigo, Alexa Fluor 350 conjugada;. Cat. # W11263, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA- HRP (aglutinina de germen de trigo peroxidasa de rábano picante, Sigma, St. Louis, MO Cat. # L7017) o 0.5μl del 10%BDA (biotina dextrano amina;. Cat. # D1956, Invitrogen, Carlsbad, CA) en tampón fosfato salino (PBS, Sigma, St. Louis, MO; Cat. # P4417). La inyección de estos volúmenes de los resultados de los marcadores en el etiquetado de un gran número de fibras. Volúmenes más pequeños tendrán que ser inyectada para orientar núcleos más pequeños (o sub-regiones de los núcleos individuales) y cada investigador empírico debe determinar el volumen ideal para ofrecer. Iontoforesis deben ser considerados para la entrega de nanolitros precisa de inyecciones precisas. Por lo general complementar todas las soluciones de trazador con Fast 0,5% Green (Sigma, St. Louis, MO; Cat. # F7252) para visualizar el lugar de la inyección durante la cirugía.
  10. Añadimos 1μl de aceite de maíz (Sigma, St. Louis, MO; Cat. # C8267) a cada 10μl de la solución de BDA antes de la inyección para evitar que la mezcla se pegue a las paredes de las pipetas tiró. Si usted no consigue expulsar el marcador de la pipeta, retirar lentamente la punta para crear un pequeño espacio en el tejido después tratar de inyectar de nuevo.No es raro que la punta de microelectrodos para estorbar. En la mayoría de los casos el bolsillo también ayuda a crear una reserva de la cual las neuronas circundantes puede absorber el marcador. Recuerde que debe expulsar siempre el marcador poco a poco para evitar el daño tisular masivo en las inmediaciones de la aguja.
  11. Cierre suavemente la piel con pinzas de la herida y adhesivo tisular. Alternativamente, puede utilizar puntos de sutura para cerrar la herida.
  12. Tenga en cuenta que con la práctica del procedimiento quirúrgico, por lo menos hasta este punto, se puede completar en menos de 20 minutos.
  13. Colocar el animal en una cámara de recuperación (Vetcare modelo de cámara 9.16.0 cat. # 340508 Aparato de Harvard) en un cojín eléctrico (Gato Calefacción Pad. # 341241 Aparato de Harvard) para evitar la hipotermia y acelerar la recuperación. Alternativamente, puede utilizar uno de muchas marcas y modelos de cámaras de calentamiento. Monitor de la frecuencia respiratoria y determinar si hay signos de que el animal está tratando de moverse. La mayoría de los animales suelen ser sensibles dentro de 10-15 minutos después de la cirugía.
  14. WGA-555 de Alexa, Alexa WGA-488, y HRP-WGA son transportados rápidamente en las neuronas y hemos encontrado que tanto en ratones como postnatal y adulto Alexa conjugado trazadores robusta tractos de fibras largas de la etiqueta dentro de las 24 horas (Reeber et al. 2011) . WGA-Alexa 350 es también transporta rápidamente, aunque en comparación con los otros tintes Alexa su visibilidad depende en gran medida la calidad y la sensibilidad de los juegos de filtros (datos no mostrados;. Reeber et al 2011) BDA normalmente requiere mayor tiempo de supervivencia para rastrear completamente proyecciones neuronales y por lo tanto, para completar el mapa de las proyecciones de espinocerebelosa animales tendrá que ser sacrificado después de aproximadamente 11 días.

2. La detección de anterogradely trazado fibras musgosas

  1. Después de los períodos de supervivencia respectivos anestesiar a los ratones con Avertin (o de su preferencia anestésico).
  2. Una vez que no hay reflejos que debe tener la sangre pasaba a través del corazón de perfusión con 0,1 M de PBS (pH 7.2). A continuación, fijar el tejido del animal por perfusión con paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS. Además de las regiones a las que se analizarán, siempre es necesario adquirir el tejido del sitio de la inyección para el análisis retrospectivo de lo grande que era la inyección, una indicación de la magnitud del daño tisular provocado por el electrodo, y para identificar el posible etiquetado de las fibras de paso (Fig. 3; ver Mesulam, 1982;. Reeber et al 2011).
  3. Posteriormente el brains de ratones perfusión durante 24-48 horas en el 4% PFA y luego cryoprotect en soluciones de sacarosa buffer diluido en PBS (15% de ~ 2 horas o hasta que el tejido se hunde hasta el fondo del recipiente y del 30% durante la noche o hasta que el se hunde tejido). El tejido se retira de la sacarosa, se secó suavemente seca con toallas de papel y luego se sumerge en un molde de tejido que contiene octubre (la temperatura óptima de corte; Sakura Finetech EE.UU. Inc, CA). El tejido se congela con un congelador -80 ° C y almacenados a la misma temperatura hasta que está listo para ser cortado.
  4. Los fluoróforos Alexa son visibles inmediatamente después de etiquetado y no requieren de tinción adicional. Por lo tanto, después de la perfusión del tejido WGA-Alexa trazado puede ser cortado y montado para la imagen o imágenes directamente en el 4% PFA como una preparación wholemount. Hemos encontrado que las imágenes de los tejidos en el 4% PFA dio el mejor índice de refracción para obtener imágenes de la topografía de las proyecciones trazadas en wholemounts. Para las secciones, de corte serie coron 40μm de espesorsecciones al de un criostato y los recogen como de libre flotación secciones en PBS. Dada la toxicidad de la PFA, asegúrese de que una adecuada mascarilla se usa durante la perfusión y la imagen, mantenga el área bien ventilada, y cuando no se utiliza de inmediato a cualquier PFA o tejido PFA-fijo de recipientes sellados. Lo ideal es que el microscopio se encuentra en una campana de extracción adecuado.
  5. Fibras WGA-HRP etiquetados pueden ser reveladas con tetrametilbenzidina (TMB) como cromógeno. No vamos a describir el protocolo de tinción HRP aquí, ya que ha sido descrito en detalle (Vogel y Prittie 1994;. Sillitoe et al 2010)
  6. Para BDA fibras etiquetados incubar libre flotación secciones de tejido durante 2 horas en estreptavidina-Cy3 (Cat. # 434315, Invitrogen, Carlsbad, CA) o estreptavidina Alexa Fluor 488 o 555 (Cat. # S11223 de 488 y Gato. # S21381 de 555, Invitrogen, Carlsbad, CA), lavar en PBS y luego montar con fluoro-GEL. Para DAB, las secciones de tejido se incuban durante la noche en tampón de reacción ABC (Cat. # PK-4000, Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA), enjuagar tres veces con PBS y luego reaccionar durante 5-10 minutos en DAB (0.5mg/ml, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA), complementado con 10μl de 30% de H 2 O 2 para cada solución de DAB 50ml.

3. Inmunohistoquímica

  1. La inmunohistoquímica se llevó a cabo como se describió previamente (Sillitoe et al. 2008). En pocas palabras, se incuban los cortes de tejido en PBS que contenía 0,1 M NGS al 10% (NGS, Sigma, St. Louis MO), 0,1% de Tween-20 y anticuerpos primarios (ver más abajo) durante 16-18 horas a temperatura ambiente. Lavar los cortes de tejido tres veces en PBS y luego se incuban en secundaria de anticuerpos (ver más abajo) para un máximo de 2 horas a temperatura ambiente. Enjuague el tejido nuevo y mostrar la inmunorreactividad como se describe a continuación.
  2. Para determinar la relación entre las células de Purkinje y las fibras musgosas que co-etiquetados sin cortes de tejido flotante utilizando los métodos convencionales de doble tinción. Se utilizó WGA-Alexa 555para el seguimiento y Alexa 488 burro conjugado anti-ratón secundaria de anticuerpos (Invitrogen / Molecular Probes Inc., Carlsbad, CA) para detectar ZebrinII (1:250; especie de regalo del Dr. Richard Hawkes, de la Universidad de Calgary, Calgary, Canadá). ZebrinII es un anticuerpo monoclonal de ratón y se utilizó directamente de medio gastado cultura hibridoma. El fluoróforo anticuerpos secundarios conjugados se utilizaron a una dilución de 1:1500. Después de la tinción los cortes de tejido fueron montados en portaobjetos de vidrio cargada y luego coverslipped con fluoro-GEL en tampón Tris (Microscopía Electrónica de Ciencias, Hatfield, PA) o con Vectashield hardset medio de montaje con DAPI (Cat. N º H-1200, Vector Laboratories, Burlingame , CA) para obtener imágenes de tres de fluorescencia de color.
  3. Hemos probado la especificidad de los anticuerpos secundarios mediante el procesamiento de los cortes de tejido en ausencia de anticuerpos primarios. No se detectó señal en los experimentos de control, indicando que la tinción se observó que no se debió a las señales no específicas de the Alexa y conjugado con anticuerpos (datos no mostrados).

4. Microscopía y análisis de datos

  1. Capturamos microfotografías de cortes de tejido con Leica DFC360 FX (fluorescencia) y DFC490 (DAB y TMB reaccionó secciones de tejido) cámaras montadas sobre una Leica DM5500 microscopio.
  2. Nos adquirir y analizar las imágenes de cortes de tejido con Leica Application Suite y Leica Application Suite paquetes de software de FX.
  3. Fotomicrografías de wholemounts se capturaron con una cámara Leica DFC3000 FX montado en un microscopio estereoscópico Leica MZ16 FA corriendo Leica Application Suite de software de FX.
  4. Ambos de nuestros microscopios están equipados con Leica CY3 (modelo # 11600231) y FITC (modelo # 11513880), filtros, y la DM5500, con un A4 adicionales DAPI / filtro UV (modelo # 11504162).
  5. Las imágenes se adquieren después de la optimización de bajo / sobre-exposición como se determina utilizando el software de Leica. Somos importadores de todos los datos sin procesar en Adobe Photoshop CS4 y si es necesario we corregir todo el campo de cada imagen de nitidez, brillo, contraste y niveles como máximo. Otros softwares de edición de fotos se puede utilizar como preferido.
  6. Los esquemas presentados aquí fueron elaborados en Adobe Illustrator CS4.
  7. Alexa 555 y CY3 las neuronas de colores, que son detectados como rojo con nuestros filtros, se pseudo-color magenta en las imágenes presentadas a lo largo del manuscrito.

Los animales

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo bajo un protocolo aprobado IACUC animales de acuerdo con las directrices institucionales en el Albert Einstein College of Medicine. Outbred hombres y mujeres Webster suizos (Taconic, Albany, Nueva York) o líneas consanguíneas C57BL6J (JAX, Bar Harbor, ME) los ratones fueron mantenidos en nuestra colonia y se utiliza para todos los estudios. Del mediodía del día se detectó un tapón vaginal fue considerado el día embrionario 0.5.

5. Los resultados representativos:

Aferentes terminan en espinocerebelosa parasagibandas ttal en el cerebelo (Fig. 3; Voogd et al 1969;. Grishkat Eisenman y 1995; Vogel y Prittie 1994; Vig et al 2005;. Aplicaciones y Hawkes 2009, Sillitoe et al 2010;.. Reeber et al 2011). Hemos inyectado WGA-Alexa trazadores en la torácica inferior-superior la médula espinal lumbar de demostrar: 1) que estos marcadores pueden ser usados ​​para etiquetar consistentemente subconjuntos específicos de terminales en el cerebelo (Fig. 3; Reeber et al 2011), 2). que WGA-Alexa trazadores son muy brillante y puede ser utilizado para visualizar el patrón general de la topografía de las fibras musgosas en todo el cerebelo (Fig. 3;. Reeber et al 2011), 3) que WGA-Alexa 488 y 555 se puede utilizar en combinación para el rastreo de trayectos múltiples en el mismo animal (Fig. 4), y 4) que WGA-Alexa trazadores son compatibles con la tinción inmunohistoquímica (Fig. 5). En un trabajo reciente se demostró que WGA-Alexa terminales etiqueta trazadores en el cerebelo a las 6 horas después de la entrega del trazador en la médula espinal y son una excelente opción de rastreo de los architecture de las vías de desarrollo (Reeber et al., 2011).

Figura 1
Figura 1. Configuración de equipos para la entrega de los marcadores en vivo. A. Una imagen de nuestra área quirúrgica. B. El torácica inferior-superior región lumbar se puede identificar mediante la ejecución de los dedos a lo largo de las vértebras para sentir una protuberancia en la columna vertebral. La laminectomía dorsal debe realizarse aproximadamente en el centro de la "joroba", que es indicado por la flecha amarilla.

Figura 2
Figura 2 Ilustración de un torácico inferior -... Superior del segmento vertebral lumbar antes y después de una laminectomía dorsal Esquema A. de un segmento vertebral intacta desde la región lumbar inferior-torácico-superior de la columna vertebral del ratón B. Una parte dorsallaminectomía l se lleva a cabo mediante la eliminación de las apófisis espinosas de uno o dos segmentos vertebrales, después de cortar la lámina a mitad de camino entre el proceso de articular y de la apófisis espinosa dorsal.

Figura 3
Figura 3. WGA-Alexa trazadores son muy brillante y puede ser utilizado para visualizar la topografía de proyección aferente en alta resolución. A. El esquema ilustra el origen y la terminación de la WGA-Alexa 555 etiquetados neuronas espinocerebelosa. B. Imagen de un sitio de la inyección después de entregar WGA-Alexa 555 en la región superior torácica inferior lumbar de la médula espinal del adulto. Imagen de la C. wholemount lóbulos anterior después de una inyección de WGA-Alexa 555 en la torácica inferior-superior región lumbar de la médula espinal. D. WGA-Alexa 555 anterógrada trazado de las vías espinocerebelosas revela bandas de fibras musgosas como se ve en un cosección de tejido neuronal. Los lóbulos están definidos por números romanos y las bandas de la etiqueta el número de fibras musgosas a ambos lados de la línea media (se aplica a todas las imágenes). Las barras de escala: B, C 500 m, 500 m D, 200 micras.

Figura 4
Figura 4. WGA-Alexa trazadores son eficientes para el etiquetado de varios caminos de los nervios en el mismo animal. A. wholemount esquemática del cerebelo del ratón resumir el patrón general de espinocerebelosa bandas de fibras musgosas. WGA-Alexa 555 se inyecta en el lado derecho de la médula espinal lumbar y WGA-Alexa 488 en el mismo segmento en el lado izquierdo. B. Como se ha visto en una sección de tejido coronal cortar a través de los lóbulos posteriores, ambos marcadores fueron WGA-Alexa transportados en el cerebelo y el éxito etiquetados distintos subgrupos de terminales (véase también Reeber et al. 2011). Abreviaturas: molecular capa (ml), la capa de células de Purkinje (PCL), la capa de células granulares (GCL), la sustancia blanca (WM). Las barras de escala: B, 100 micras.

Figura 5
Figura 5. WGA-Alexa trazadores se pueden utilizar en combinación con técnicas de inmunohistoquímica y la histología de etiquetado triples de las neuronas y las proyecciones. A. Ventajas de Windows Original-Alexa 555 se deposita en las terminales de las fibras musgosas en el lóbulo III. B. tinción ZebrinII revela una serie de franjas de células de Purkinje en el lóbulo III. C. DAPI de los núcleos neuronales y gliales. D. fusionado la imagen de los paneles A, B, y C muestran tres de las bandas de etiquetado aferentes, las rayas de células de Purkinje, y citoarquitectura general. EH. Imágenes de gran aumento de las regiones en caja se muestra en los paneles de AD. Franjas de células de Purkinje se numeran como se describió previamente (revisadoen (Aplicaciones y Hawkes 2009)). Abreviaturas: capa molecular (ml); capa de células de Purkinje (PCL), capa de células granulares (GCL). Las barras de escala: D, a 500 m (para AC), H, 500 m (para EG).

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Discussion

Hemos descrito los detalles quirúrgicos y técnicas necesarias para localizar a los axones y las dendritas utilizando un nuevo enfoque basado en los fluorescentes para la rápida etiquetado proyecciones neuronales en el desarrollo y los ratones adultos. Utilizando WGA-Alexa se muestra cómo los trazadores y marcadores se pueden utilizar para el análisis de la topografía de circuitos modelados en alta resolución y en tres dimensiones.

Muchos trazadores disponibles para el rastreo de los circuitos neuronales incluyendo cólera subunidad B de toxina, Biocitina, Neurobiotin, Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (Phal), fluororuby, fluoremerald y Fluorogold. Además, los últimos marcadores basados ​​genéticos y virales han demostrado que los subconjuntos neuronales son molecularmente diferentes topográficamente conectados a sus objetivos con gran precisión. Tenga en cuenta que aunque algunos marcadores neuronales son predominantemente transportados, ya sea en la dirección anterógrada o retrógrada (por ejemplo, BDA 10.000 MW frente a 3.000 MW), las moléculas de trazador se transportan a menudo en ambosdirecciones. En nuestros estudios, se introduce WGA-Alexa trazadores basados ​​en herramientas confiables para el análisis neuroanatómico de los patrones de proyección topográfica. Se demuestra que WGA-Alexa fluorescente brillante, se transporta con rapidez, y es lo suficientemente versátil para ser emparejado con marcadores inmunohistoquímicos incluidos los de los compartimentos del cerebelo sagital (Fig. 3).

Hemos encontrado varias limitaciones del uso de WGA-Alexa en comparación con otros marcadores neuroanatómicos disponibles. En contraste con la BDA (Wu et al. 1999), que anteriormente mostró que WGA-Alexa (y WGA-HRP) no revela la morfología completa de terminales terminal compleja (Reeber et al. 2011). Sin embargo, hemos mejorado el valor de la información anatómica obtenida de terminales trazado por el emparejamiento WGA-Alexa rastreo con tinción inmunohistoquímica para transportador de glutamato vesicular 2 (VGLUT2) y la cocaína y las anfetaminas péptido transcripción regulados (CART) inmunohistoquímica (Reeber et al 2011;. Reeber y Sillitoe, 2011). Unotra deficiencia de la WGA-Alexa es que la señal se degrada relativamente rápido en secciones de tejido, a pesar de ser montados en los medios de comunicación que protegen la señal fluorescente. Por lo tanto, por lo general la imagen del tejido inmediatamente después del corte, a pesar de imagen dentro de 2 días de corte todavía permite que las fibras de la etiqueta y los terminales con éxito imágenes. Hay una tendencia a que la señal de WGA-Alexa a perder intensidad durante la inmunotinción de las secciones de tejido. Los lavados menos y más cortas durante la tinción puede minimizar este problema. Otra recomendación es colocar siempre y la imagen de un conjunto de las secciones de tejido trazado en el día de corte de un conjunto de referencia para comparar con las secciones adyacentes que serán procesadas para inmunohistoquímica. En nuestras manos octubre (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA) incrustados bloques de tejido se mantiene a -80 ° C después de la perfusión y el crioprotector se pueden almacenar por largos periodos de tiempo sin ninguna pérdida de intensidad del marcador.

Nuestros distintos criteriosch de las fibras de rastreo puede ser fácilmente adaptado para trazar mapas de los nervios en vías corticales, el tronco encefálico y la médula espinal. Actualmente estamos explorando la posibilidad de utilizar WGA-Alexa trazadores de imágenes in vivo de la formación de circuitos en los animales modificados genéticamente y para estudiar la dinámica de la formación del circuito después de las lesiones del tracto selectivo y las manipulaciones farmacológicas. Dado que el transporte rápido de WGA-Alexa trazadores permite análisis a corto plazo nuestro enfoque tiene el potencial para revelar los cambios dinámicos que ocurren durante la plasticidad estructural de los circuitos topográficos.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el investigador nuevos fondos iniciales de Albert Einstein College of Medicine de la Universidad Yeshiva de RVS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bead sterilizer Fine Science Tools Model Steri 250 Cat. # 18000-45
Cauterizer Fine Science Tools Cat. # 18000-00
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus Cat. # 300056
Dual stage Glass Micropipette Puller Narishige International Model 001-PC-10
Micrometer syringe Gilmont Instruments Cat. # GS-1100
Small Animal Stereotaxic Instrument Kopf Instruments Model 940-A
Electrode Manipulator Kopf Instruments Model 960
Vetcare chamber Harvard Apparatus Cat. # 340508
Heating Pad Harvard Apparatus Cat. # 341241
Leica DFC360 FX camera Leica Microsystems DFC360 FX
Leica DFC490 camera Leica Microsystems DFC490
Leica DM5500 microscope Leica Microsystems DM5500
Leica DFC3000 FX camera Leica Microsystems DFC3000 FX
Leica MZ16 FA microscope Leica Microsystems MZ16 FA
CY3 Filter Leica Microsystems Model # 11600231
FITC Filter Leica Microsystems Model # 11513880
A4 DAPI/UV filter Leica Microsystems Model # 11504162
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Cat. #W11261
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen Cat. #W32464

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References

  1. Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
  2. Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
  3. Mesulam, M. Tracing neural connections with horseradish peroxidase. Wiley. New York. (1982).
  4. Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. Journal of Comparative Neurology. (2011).
  5. Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain. Struct. Funct. (2011).
  6. Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum. J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).
  7. Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map. J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).
  8. Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells. Neuroscience. 130, 735-744 (2005).
  9. Vogel, M. W., Prittie, J. Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant. J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).
  10. Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems. Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).
  11. Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei. J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).

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