Revelando Topografia Circuito Neural em Multi-Color

Neuroscience

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Summary

Nós fornecemos um guia prático para entregar traçadores

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Reeber, S. L., Gebre, S. A., Filatova, N., Sillitoe, R. V. Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color. J. Vis. Exp. (57), e3371, doi:10.3791/3371 (2011).

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Abstract

Circuitos neurais funcionais estão organizados em mapas topográficos. Para visualizar a arquitetura circuito complexo que nós desenvolvemos uma abordagem para a fiabilidade rótulo o padrão global de múltiplas projeções topográficos. O cerebelo é um modelo ideal para estudar o arranjo ordenado dos circuitos neurais. Por exemplo, a organização compartimental de espinocerebelar fibras musgosas provou ser um sistema indispensável para o estudo de padronização de fibras musgosas. Recentemente, mostrou que aglutinina de gérmen de trigo (WGA), conjugada com Alexa 555 e 488 podem ser usados ​​para rastreamento espinocerebelar projeções de fibras musgosas no desenvolvimento e camundongos adultos (Reeber et al. 2011). Encontramos três principais propriedades que tornam as ferramentas WGA-Alexa traçadores desejável para rotulagem projeções neural. Primeiro, fluoróforos Alexa são intensas e seu brilho permite imagens wholemount diretamente após rastreamento. Segundo, WGA-Alexa traçadores rótulo toda a trajetória de desenvolvimento neural e adultos Projections. Terceiro, WGA-Alexa traçadores são rapidamente transportados nas direções retrógrada e anterógrada. Aqui, descrevemos em detalhes como preparar os marcadores e outras ferramentas necessárias, como executar a cirurgia para rastreamento espinocerebelar ea melhor forma de projeções de imagem traçada em três dimensões. Em resumo, nós fornecemos um protocolo passo a passo de rastreamento que vai ser útil para decifrar a organização e conectividade de mapas funcionais não só no cerebelo, mas também no córtex, tronco cerebral e medula espinhal.

Protocol

1. Entregar tracers in vivo utilizando a cirurgia estéril (Seções 1,1-1,16)

Durante todo o processo, aconselhamos que o padrão estéril técnicas cirúrgicas ser usado. Isso inclui o uso de luvas estéreis, vestido, e máscara. Ferramentas devem ser tanto autoclavado antes da utilização ou limpos cuidadosamente com água e então etanol. Durante a cirurgia, e especialmente entre os animais, fragmentos de tecido limpar as ferramentas e secar esterilizar instrumentos com um hot talão esterilizador (Steri Cat 250. # 18000-45, Ferramentas Ciência Fine). Além disso, é fundamental que você a organizar seu espaço de trabalho de tal forma que você tem áreas designadas para a preparação de animal (de barbear etc), a cirurgia, e uma área de recuperação onde o animal pode ser facilmente monitorado, aquecido, e é fornecido com analgésicos, conforme necessário. A chave para a sobrevivência cirurgias bem sucedidas é o de reduzir o risco de infecção e manter uma estratégia agressiva de cuidados pós-operatórios. Por favor, consulte a tabela onde você pode find todos os equipamentos necessários e reagentes para este protocolo.

  1. Anestesiar ratos adultos com Avertin preparada na hora (2,2,2 tribromoetanol, Sigma, St. Louis MO;. Cat # T48402) através de uma injeção intraperitoneal (ip) com uma dose de 0.2ml/10grams peso corporal. Outros anestésicos, como o isoflurano ou cetamina / xilazina são igualmente eficazes, mas garantir que seu laboratório tem a aprovação institucional necessária e federal antes de usar. Se você estiver usando filhotes (P0 - P10), você pode anestesiá-lo em gelo picado por 10-15 minutos. Garantir que a pele de cada filhote de cachorro não está em contato direto com o gelo (por exemplo, colocando-os nos dedos de luvas de látex), como a água fria rapidamente induzir a um nível letal de hipotermia. Confirmar que o animal está sob uma planície aceitável de anestesia através da realização de uma pitada do dedo do pé com uma pinça ou os dedos para as patas dos animais traseiras. Se houver um reflexo pedal, espere até que o animal não responde a esse estímulo como uma indicação de um profundoplanície de anestesia.
  2. Uma vez que o animal é totalmente anestesiado colocá-lo com o lado dorsal acima em uma compressa de gaze estéril com a cabeça de costas para você e sua cauda virada para você. Raspar a pele com cortar cabelo, a fim de dar-se um campo cirúrgico claro que é grande o suficiente para ganhar acesso ao sistema nervoso central. Limpe a região raspada com dois conjuntos de algodão embebido em álcool, em seguida, álcool a 70% / betadine, e depois limpa mais uma vez com algodão embebido em álcool. Use um padrão circular dentro para fora, quando a limpeza da área cirúrgica. Você pode optar por demarcar claramente o campo cirúrgico, cortando um pequeno buraco em uma compressa de gaze estéril e colocar a abertura em seu site raspada e limpa cirúrgico. Embora mantendo o campo estéril cirúrgica pode ser complicado quando operando em pequenos animais, isso irá ajudar a reduzir o risco de infecção.
  3. Levante a pele usando uma pinça e fazer uma incisão com tesoura na linha média diretamente acima do menor r tóraco-lombar superiorEgion. A região inferior-região torácica superior lombar pode ser identificado por executar o seu dedo ao longo das vértebras para sentir uma corcova na coluna vertebral (Fig. 1).
  4. Corte a fáscia superficial e músculos da coluna vertebral. Se necessário, evitar qualquer sangramento por cauterização dos vasos sanguíneos (Ferramentas Ciência Fine, Foster City, CA;. Cat # 18000-00). Em filhotes, aplicando pressão suave ao redor da incisão com cotonetes é suficiente para parar o sangramento.
  5. Executar uma laminectomia dorsal, removendo os processos espinhosos de um ou dois segmentos de menor torácica - lombar superior espinhal medula após o corte da lâmina de ambos os lados da coluna vertebral no meio do caminho, entre o processo articular eo processo espinhoso dorsal (Fig. 2) . Tenha cuidado para não danificar a medula espinhal, com sua tesoura e sempre remover os fragmentos ósseos pequenos que podiam dilacerar a medula espinhal. Note que a coluna vertebral, no início de filhotes pós-natal não é completamente ossificado, o que significa que os ossos são muitosuave e pode ser cortado facilmente. Portanto, tenha cuidado para não cortar muito fundo, pois pode danificar a medula espinhal.
  6. Se você preferir não realizar uma laminectomia dorsal em ratos adultos, temos verificado que você pode cortar o tecido mole entre os segmentos vertebrais para expor uma pequena região da medula espinhal sem cortar qualquer osso. Embora ambos os métodos são eficazes rotas de entrada para a medula espinhal, evitando uma laminectomia dorsal pode garantir que a medula espinhal permanece intacta.
  7. Preencher um eletrodo de vidro puxado (vidro borosilicato capilares; Cat # 300056, Harvard Apparatus, Holliston, MA;. Estágio de vidro duplo Micropipeta Extrator de Narishige Modelo 001-PC-10) com o seu marcador com uma seringa micrométrica (0,2 mL; Gilmont Instruments Cat . # GS-1100) ou um aparelho de entrega equivalente.
  8. Aperte o microeletrodo de vidro no lugar em um micromanipulador e inserir o eletrodo de 0,1 0,5 mm na região torácica inferior-lombar superior da medula espinhal na metade entre meadoslinha ea borda lateral da medula espinhal. O animal pode ser realizada em um aparelho estereotáxico para a identificação precisa dos loci de injeção e para a estabilização do animal (Small Animal Modelo Instrumento estereotáxica 940-A e modelo Eletrodo Manipulator 960 de Instrumentação Kopf). Alternativamente, se o seu regime anestésico pode ser ajustada para a obtenção de um avião estável, sem movimentos significativos devido à respiração profunda, gentilmente gravando o animal para baixo será suficiente.
  9. Pressão injetar na medula espinhal durante 3-5 minutos aproximadamente 0.5μl de uma solução de 2% do WGA-Alexa 488 (aglutinina de gérmen de trigo, Alexa Fluor 488 conjugado;. Cat # W11261, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 555 (aglutinina de gérmen de trigo, Alexa Fluor 555 conjugado;. Cat # W32464, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 350 (aglutinina de gérmen de trigo, Alexa Fluor 350 conjugado;. Cat # W11263, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA- HRP (aglutinina de gérmen de trigo peroxidase; Sigma, St. Louis, MO Cat # L7017) ou 0.5μl de 10%BDA (biotinilado dextran amine;. Cat # D1956, Invitrogen, Carlsbad, CA) em tampão fosfato salino (PBS; Sigma, St. Louis, MO; Cat # P4417). Injetar esses volumes de resultados traçadores na rotulagem um grande número de fibras. Volumes menores terá de ser injetado para o direcionamento núcleos menores (ou sub-regiões dos núcleos individuais) e cada investigador deve determinar empiricamente o volume ideal para entregar. Iontoforese deve ser considerada para entrega nanolitros preciso para injeções precisas. Normalmente, todas as soluções suplemento marcador com 0,5% Fast Green (Sigma, St. Louis, MO; Cat # F7252) para visualizar o local de injeção durante a cirurgia.
  10. Nós adicionamos 1μl de óleo de milho (Sigma, St. Louis, MO; Cat # C8267) para cada 10μl de solução BDA antes de injetar para evitar a mistura grude nas paredes das pipetas puxado. Se você tiver problemas para ejetar o marcador fora da pipeta, lentamente retrair a ponta para criar uma pequena bolsa no tecido, em seguida, tentar injetar novamente.Não é incomum para a ponta de microeletrodos a entupir. Na maioria dos casos, o bolso também ajuda a criar um reservatório a partir do qual os neurônios vizinhas podem absorver o marcador. Lembre-se sempre de ejectar o marcador lentamente para evitar dano tecidual maciça nas proximidades de sua agulha.
  11. Feche cuidadosamente a pele com grampos de sutura e cola de tecido. Alternativamente, você pode usar suturas para fechar a ferida.
  12. Note-se que com a prática do procedimento cirúrgico, pelo menos até este ponto, pode ser concluído em menos de 20 minutos.
  13. Colocar o animal em uma câmara de recuperação (Vetcare modelo de câmara de Cat 9.16.0. # 340508 Aparelho de Harvard) sobre uma almofada de aquecimento (Cat Pad Aquecimento. # 341241 Aparelho de Harvard) para evitar a hipotermia e acelerar a recuperação. Alternativamente, você pode usar uma das muitas marcas e modelos de câmaras de aquecimento. Monitorar a taxa de respiração e verifique se há sinais de que o animal está tentando mover-se. A maioria dos animais são geralmente sensíveis dentro de 10-15 minutos após a cirurgia.
  14. WGA-Alexa 555, Alexa WGA-488, e WGA-HRP são rapidamente transportados em neurônios e nós descobrimos que em ambos os ratos pós-natal precoce e adultos do Alexa conjugado traçadores robustamente rótulo extensões de fibra longa no prazo de 24 horas (Reeber et al. 2011) . WGA-Alexa 350 também é rapidamente transportado, embora em comparação com o Alexa outros corantes a sua visibilidade é altamente dependente da qualidade e sensibilidade dos conjuntos de filtro (dados não apresentados;. Reeber et al 2011) BDA normalmente exige maior tempo de sobrevida plenamente trace projeções neural e, portanto, para o mapeamento completo de projeções espinocerebelar animais terão de ser sacrificados após aproximadamente 11 dias.

2. Detecção de anterógrada traçado fibras musgosas

  1. Após os períodos de sobrevivência respectivos anestesiar os ratos com Avertin (ou a anestesia preferencial).
  2. Uma vez que não há reflexos no sangue devem ser lavados através do coração irrigando com 0,1 M PBS (pH7.2). Então, corrigir o tecido irrigando o animal com paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS. Além de as regiões que você vai analisar, é sempre necessário para a aquisição de tecido do local da injeção para a análise retrospectiva de quão grande foi a injeção, uma indicação da extensão do dano tecidual causado pelo eletrodo, e para a identificação de rotulagem possível em fibras de passagem (Fig. 3; ver Mesulam, 1982;. Reeber et al 2011).
  3. Postfix do brains de ratos perfundidos por 24-48 horas em PFA 4% e, em seguida, cryoprotect-los em soluções de sacarose diluída em tampão PBS (15% para ~ 2 horas ou até o tecido afunda até o fundo do recipiente e, em seguida, 30% durante a noite ou até o tecido sumidouros). O tecido é então removido a partir da sacarose, gentilmente limpou seco com toalhas de papel e, então, imersas em um molde de tecido contendo OCT (Optimal Temperatura de corte; Sakura Finetech EUA Inc, CA). O tecido é então congelado usando um freezer -80 ° C e armazenadas na mesma temperatura até o seu pronto para ser cortado.
  4. O Alexa fluoróforos são visíveis logo após a rotulagem e não necessitam de coloração adicional. Portanto, após a perfusão do tecido WGA-Alexa traçado pode ser cortado e montado para imagens ou diretamente fotografada em PFA 4% como uma preparação wholemount. Descobrimos que a imagem do tecido em 4% PFA deu o melhor índice de refração para a imagem da topografia das projeções traçadas em wholemounts. Para as seções, corte Coron 40μm de espessura de sérieal seções em um criostato e recolhê-las como de livre flutuação seções em PBS. Dada a toxicidade do PFA, garantir que uma máscara apropriada é usado durante a perfusão e de imagem, mantenha a área bem ventilada, e quando não em uso imediatamente devolver quaisquer PFA ou PFA-fixa tecido para recipientes fechados. É ideal se o seu microscópio está localizado em uma capa adequada de fumos.
  5. Fibras WGA-HRP rotulados pode ser revelado usando tetrametilbenzidina (TMB) como cromógeno. Não vamos descrever o protocolo de coloração HRP aqui uma vez que tem sido descrita em detalhes (Vogel e Prittie 1994;. Sillitoe et al 2010)
  6. BDA fibras marcadas para incubar seções de livre flutuação do tecido por 2 horas em Estreptavidina-Cy3 (Cat. # 434315, Invitrogen, Carlsbad, CA) ou estreptavidina-Alexa Fluor 488 ou 555 (Cat. # S11223 para 488 e Cat. # S21381 para 555, Invitrogen, Carlsbad, CA), lave em PBS e então montar com FLUORO-GEL. Para DAB, incubar secções de tecido durante a noite no ABC tampão de reação (Cat. # PK-4000, Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA), lavar 3 vezes em PBS e então reagir por 5-10 minutos em DAB (0,5 mg, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA), suplementado com 10μl de 30% H 2 O 2 para cada solução DAB 50ml.

3. Imuno-histoquímica

  1. Imuno-histoquímica foi realizada conforme descrito anteriormente (Sillitoe et al. 2008). Brevemente, incubar cortes de tecidos em 0,1 M PBS contendo 10% NGS (NGS, Sigma, St. Louis MO), 0,1% Tween-20 e anticorpos primários (ver abaixo) para 16-18 horas em temperatura ambiente. Lavar as secções de tecido três vezes em PBS e incubar-los em anticorpos secundários (veja abaixo) para um máximo de duas horas em temperatura ambiente. Lave o tecido novamente e revelar a imunorreatividade conforme descrito abaixo.
  2. Para determinar a relação entre as células de Purkinje e fibras musgosas que co-rotulados livre secções de tecido flutuante utilizando métodos convencionais de coloração dupla. Usamos WGA-Alexa 555de rastreio e Alexa 488 conjugado burro anti-ratinho secundário (Invitrogen / Molecular Probes Inc., Carlsbad, CA) para detectar ZebrinII (1:250; presente amável do Dr. Richard Hawkes, University of Calgary, Calgary, Canadá). ZebrinII é um anticorpo monoclonal de camundongo e foi usado diretamente em médio gasto hibridoma cultura. O fluoróforo conjugado anticorpos secundários foram usados ​​em uma diluição de 1:1500. Após a coloração os cortes de tecidos foram montados em lâminas de vidro carregada e, em seguida, as lamínulas com FLUORO-GEL em tampão Tris (Microscopia Eletrônica de Ciências, Hatfield, PA) ou com Vectashield hardset meio de montagem com DAPI (Cat. # H-1200, Vector Laboratories, Burlingame , CA) para imagens de fluorescência de cor triplo.
  3. Nós testamos a especificidade dos anticorpos secundários, processando as secções de tecido, na ausência de anticorpos primários. Nenhum sinal foi detectado em experimentos de controle, indicando que a coloração foi observada não foi devido a sinais inespecíficos de the Alexa anticorpos conjugados (dados não mostrados).

4. Microscopia e análise de dados

  1. Captamos fotomicrografias das secções de tecido usando Leica DFC360 FX (fluorescência) e DFC490 (DAB e TMB reagiu secções de tecido) câmeras montadas em uma Leica DM5500 microscópio.
  2. Nós adquirir e analisar as imagens das secções de tecido usando Leica Application Suite e Leica Application Suite pacotes de software FX.
  3. Fotomicrografias de wholemounts são capturados utilizando uma câmera Leica DFC3000 FX montado em um estereomicroscópio Leica MZ16 FA execução Leica Application Suite software FX.
  4. Ambos os nossos microscópios estão equipados com Cy3 Leica (modelo # 11600231) e FITC (modelo # 11513880) filtros, e DM5500 com um A4 adicionais DAPI / filtro UV (modelo # 11504162).
  5. As imagens são adquiridas após a otimização de sob / sobre-exposição, conforme determinado usando o software Leica. Importamos todos os dados brutos em Adobe Photoshop CS4 e se necessário we corrigir o campo inteiro de cada imagem para nitidez, brilho, contraste, ou apenas os níveis. Softwares de edição de foto pode ser usado como preferido.
  6. Os esquemas apresentados aqui foram tiradas em Adobe Illustrator CS4.
  7. Alexa 555 e Cy3 neurônios corados, que são detectados como vermelho usando nossos filtros, foram pseudo-cor magenta nas imagens apresentadas ao longo do manuscrito.

Animais

Todos os estudos com animais foram realizados sob um protocolo de animais aprovados IACUC acordo com as diretrizes institucionais no Albert Einstein College of Medicine. Masculino e feminino outbred suíço Webster (Taconic, Albany, NY) ou C57BL6J puras (JAX, Bar Harbor, ME) ratos foram mantidos em nossa colônia e utilizada para todos os estudos. Meio-dia no dia um plug vaginal foi detectado era considerado dia embrionário 0,5.

5. Resultados representativos:

Aferentes espinocerebelar terminar em parasagibandas ttal no cerebelo (Fig. 3; Voogd et al 1969;. Grishkat Eisenman e 1995; Vogel e Prittie 1994; Vig et al 2005;. Apps e Hawkes 2009; Sillitoe et al 2010;.. Reeber et al 2011). Injetamos WGA-Alexa tracers para o mais baixo tóraco-lombar da coluna vertebral superior cabo para demonstrar: 1) que estes marcadores podem ser utilizados de forma consistente rótulo subconjuntos específicos de terminais no cerebelo (Fig. 3; Reeber et al 2011), 2). que o WGA-Alexa traçadores são intensamente brilhante e pode ser usado para visualizar o padrão geral de topografia fibras musgosas em todo cerebelos (Fig. 3;. Reeber et al 2011), 3) que o WGA-Alexa 488 e 555 pode ser usado em combinação para traçar vias múltiplas no mesmo animal (Fig. 4), e 4) que o WGA-Alexa traçadores são compatíveis com coloração imuno-histoquímica (Fig. 5). Em recente trabalho nós mostramos que o WGA-Alexa terminais rótulo traçadores no cerebelo tão cedo quanto seis horas após a entrega do traçador para a medula espinhal e são uma excelente opção para a detecção de architecture das vias de desenvolvimento (Reeber et al., 2011).

Figura 1
Figura 1. Setup do equipamento para a entrega de tracers in vivo. A. Uma imagem da nossa área cirúrgica. B. A região torácica inferior-lombar superior podem ser identificados por correndo os dedos ao longo das vértebras para sentir uma corcova na coluna vertebral. A laminectomia dorsal deve ser realizada aproximadamente no meio do "corcunda", que é indicado pela seta amarela.

Figura 2
Figura 2 Ilustração de um menor torácica -... Superior segmento lombar vertebral antes e depois da laminectomia dorsal A. esquemática de um segmento vertebral intacta da região de madeira de baixa-torácica superior da coluna vertebral do mouse B. Um dorsolaminectomia l é realizado através da remoção dos processos espinhosos de um ou dois segmentos vertebral, após o corte da lâmina no meio do caminho entre o processo articular eo processo espinhoso dorsal.

Figura 3
Figura 3. WGA-Alexa traçadores são intensamente brilhante e pode ser usado para visualizar a topografia de projeção aferentes em alta resolução. A. O esquema ilustra a origem ea cessação do WGA-Alexa 555 rotulados neurônios espinocerebelar. B. Imagem de um local da injeção após a entrega WGA-Alexa 555 para o mais baixo torácica região lombar superior da medula espinhal adulta. Wholemount C. imagem do lóbulos anterior após uma injeção de WGA-Alexa 555 na região torácica inferior-lombar superior da medula espinhal. D. WGA-Alexa 555 anterógrada rastreamento do trato espinocerebelar revela faixas de fibras musgosas como visto em uma cosecção de tecido neuronal. Os lóbulos são definidos por algarismos romanos e os números de rótulo bandas fibras musgosas em ambos os lados da linha média (aplica-se a todas as imagens). Barras de escala: B, C 500 mm, 500 mm D, 200 mM.

Figura 4
Figura 4. WGA-Alexa traçadores são eficientes para a rotulagem múltiplas vias neurais no mesmo animal. A. esquemática Wholemount do cerebelo do rato resumindo o padrão geral de espinocerebelar bandas fibras musgosas. WGA-Alexa 555 foi injetada no lado direito da medula espinal e lombar WGA-Alexa 488 no mesmo segmento do lado esquerdo. B. Como visto em uma seção de tecido coronal cortar os lóbulos posterior, ambos os traçadores foram WGA-Alexa transportado para o cerebelo e rotulados com sucesso subconjuntos distintos de terminais (ver também Reeber et al. 2011). Abreviaturas: toupeiracular camada (ml); camada de células Purkinje (PCL); camada de células granulares (GCL); substância branca (ui). Barras de escala: B, 100 mm.

Figura 5
Figura 5. WGA-Alexa traçadores pode ser usado em combinação com imunohistoquímica e histologia de rotulagem triplo de neurônios e projeções. A. WGA-Alexa 555 é depositado nos terminais de fibras musgosas no lóbulo III. B. coloração ZebrinII revela uma série de listras células Purkinje no lóbulo III. C. coloração DAPI dos núcleos neuronais e gliais. D. Merged imagem de painéis A, B e C mostrando rotulagem triplo de bandas aferentes, listras célula de Purkinje, e citoarquitetura geral. EH. Imagens de alta ampliação das regiões em caixa mostrado na AD painéis. Faixas de células Purkinje são numerados conforme descrito anteriormente (revisadoem (Apps e Hawkes 2009)). Abreviaturas: camada molecular (ml); camada de células Purkinje (PCL); camada de células granulares (GCL). Barras de escala: D, 500 mm (para AC); H, 500 mm (para EG).

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Discussion

Nós descrevemos os detalhes cirúrgicos e técnicos necessários para o sucesso rastreamento axonal e dendrite usando uma abordagem baseada em romance fluorescentes para rapidamente rotulagem projeções neurais no desenvolvimento e camundongos adultos. Utilizando-WGA Alexa mostramos como traçadores e marcadores podem ser usados ​​para analisar padrões topografia de circuito em alta resolução e em três dimensões.

Traçadores muitos estão disponíveis para rastrear circuitos neuronais incluindo cólera subunidade B da toxina, Biocytin, Neurobiotin, Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (phal), fluororuby, fluoremerald e fluorogold. Além disso, recentes genéticos e marcadores virais baseadas demonstraram que molecularmente distintos subconjuntos de neurônios são topograficamente ligados a seus alvos com grande precisão. Note que apesar de alguns traçadores neurais são predominantemente transportados em qualquer direção a anterógrada ou retrógrada (por exemplo BDA 10.000 mw 3000 mw contra), as moléculas de traçador são muitas vezes transportados em ambos osdireções. Em nossos estudos, nós introduzimos WGA-Alexa traçadores baseada tão confiáveis ​​ferramentas neuroanatômicas para análises de padrões de projeção topográfico. Nós mostramos que o WGA-fluorescente Alexa brilhantemente, é transportado rapidamente, e é versátil o suficiente para ser emparelhado com marcadores imunoistoquímicos incluindo aqueles para cerebelar compartimentos sagital (Fig. 3).

Foram encontradas várias limitações do uso de WGA-Alexa em comparação a outros disponíveis traçadores neuroanatômicos. Em contraste com a BDA (Wu et al. 1999), que anteriormente mostraram que a WGA-Alexa (e WGA-HRP) não revela toda a morfologia complexa de terminações terminal (Reeber et al. 2011). No entanto, nós melhoramos o valor das informações anatômicas adquirida com os terminais traçado por emparelhamento WGA-Alexa traçado com coloração imuno-histoquímica para o transportador de glutamato vesicular 2 (VGLUT2) e cocaína e anfetamina peptídeo transcrição regulados (CART) imuno-histoquímica (Reeber et al 2011;. Reeber e Sillitoe, 2011). Umdeficiência de outros WGA-Alexa é que o sinal se degrada de forma relativamente rápida em cortes de tecidos, apesar de ser montado na mídia que protegem o sinal fluorescente. Portanto, imagem tipicamente o tecido imediatamente após o corte, embora de imagem dentro de dois dias de cortar ainda permite fibras marcadas e terminais com êxito imagens. Há uma tendência para o sinal de WGA-Alexa a perder intensidade durante a imunocoloração das seções do tecido. Usando lavagens menos e mais curtos durante a coloração pode minimizar este problema. Outra recomendação é sempre a montar e imagem um conjunto de seções de tecido traçado no dia de corte para um conjunto de referência para comparar com seções adjacentes que serão processados ​​para imuno-histoquímica. Em nossas mãos outubro (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA) embutido blocos de tecido mantida a -80 ° C, após a perfusão e crioproteção podem ser armazenados por longos períodos de tempo sem qualquer perda de intensidade do marcador.

Nosso approach de fibras de rastreamento poderia ser facilmente adaptado para rastreamento mapas neurais em vias corticais, tronco cerebral e espinhal. Estamos a explorar a possibilidade de usar WGA-Alexa traçadores de imagem in vivo da formação circuito em animais geneticamente modificados e para o estudo da dinâmica da formação circuito após lesões do trato seletivo e manipulações farmacológicas. Desde o transporte rápido de WGA-Alexa traçadores permite análise a curto prazo a nossa abordagem tem o potencial para revelar as mudanças dinâmicas que ocorrem durante a plasticidade estrutural dos circuitos topográficos.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo investigador novas start-up fundos de Albert Einstein College of Medicine da Yeshiva University de RVS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bead sterilizer Fine Science Tools Model Steri 250 Cat. # 18000-45
Cauterizer Fine Science Tools Cat. # 18000-00
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus Cat. # 300056
Dual stage Glass Micropipette Puller Narishige International Model 001-PC-10
Micrometer syringe Gilmont Instruments Cat. # GS-1100
Small Animal Stereotaxic Instrument Kopf Instruments Model 940-A
Electrode Manipulator Kopf Instruments Model 960
Vetcare chamber Harvard Apparatus Cat. # 340508
Heating Pad Harvard Apparatus Cat. # 341241
Leica DFC360 FX camera Leica Microsystems DFC360 FX
Leica DFC490 camera Leica Microsystems DFC490
Leica DM5500 microscope Leica Microsystems DM5500
Leica DFC3000 FX camera Leica Microsystems DFC3000 FX
Leica MZ16 FA microscope Leica Microsystems MZ16 FA
CY3 Filter Leica Microsystems Model # 11600231
FITC Filter Leica Microsystems Model # 11513880
A4 DAPI/UV filter Leica Microsystems Model # 11504162
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Cat. #W11261
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen Cat. #W32464

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References

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