Selektiv Viral nervsystemet av vuxna födda Olfactory Neuroner för kronisk In vivo Optogenetic Stimulering

Neuroscience

GE Global Research must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vuxna födda nervceller i luktloben kan optogenetically kontrolleras med Channelrhodopsin2-uttryckande Lentiviral injektion i rostralt flyttande strömmen och kronisk photostimulation med en inopererad miniatyr lysdiod.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380, doi:10.3791/3380 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lokala interneuronen ständigt återskapas i luktloben av vuxna gnagare 1-3. I denna process, som kallas vuxen neurogenes, neurala stamceller i väggarna i den laterala ventrikeln ger upphov till neuroblaster att migrera flera millimeter längs rostralt vandrande ström (RMS) för att nå och införliva luktbulben. För att studera de olika stegen och effekterna av vuxna födda neuron integration i redan existerande lukt kretsar, är det nödvändigt att selektivt märka och manipulera aktiviteten hos denna specifika populationen av nervceller. Den senaste tidens utveckling av optogenetic teknik ger möjlighet att använda ljus för att exakt aktivera denna specifika kohort av nervceller utan att påverka omgivande nervceller 4,5. Här presenterar vi en rad förfaranden för att viralt uttrycka Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP i en tidsmässigt begränsad kohort av neuroblaster i RMS innan de når luktbulben och bli vuxna födda neurons. Dessutom visar vi hur implantatet och kalibrera en miniatyr LED för kronisk in vivo stimulering av ChR2-uttryckande nervceller.

Protocol

1. Stereotaxic injektioner

  1. Det virus som används i dessa experiment är en replikering-brist Lentiviral vektor baserad på hiv-viruset att uttrycka Channelrhodopsine2-YFP (gul fluorescerande protein) Fusion konstruera drivs av en synapsin promotor 6. Den plasmid var generöst tillhandahålls av K. Deisseroth forskargrupp ( http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Lentiviruses kan erhållas från kommersiella källor eller tillverkas i labbet enligt fastställt protokoll 7. Genomsnittlig vektor titrar var i storleksordningen 10 10 transduktion enheter / ml. Viral alikvoter lagras vid -80 ° C och ska tinas strax före pipett lastning. Flera frys / tö cykler bör undvikas. Aldrig exponering viruset lösningen direkt till torris.
  2. Förbered glaspipetter med borosilikatglas kapillärerna på standard pipett avdragare (Sutter P-97 Pipett avdragare). Den drar inställningen bör vara väl kalibrerad för att ge en lång och stel pipett. Därefter skär toppen av pipetten med hjälp av en sax för att få ett tips på 30-40 mikrometer i diameter. Förvara drog pipetter i en dammfri box.
  3. Ställ in Nanoject II microinjector med tillverkarens anvisningar för leverans av 50 NL. Förbered injektionen pipetten genom back-fyllning med mineralolja och sätt in det i den microinjector kolven. Fäst microinjector på en stereotaxic ram. Delvis tom olja från glaspipett innan du fyller med viruset lösningen
  4. Med en mikropipett, överföring 2 l virus lösningen på en steril bit Parafilm. Lägg försiktigt ner glaspipett i droppe av viruset lösning och fyller pipetten med 1-2 l. Se till att det inte finns några luftbubblor i pipetten.
  5. Bedöva en mus med 100 mg / kg ketamin och 10 mg / kg Xylazine, utspätt i steril koksaltlösning. Ta bort håret från hårbotten idjur med hjälp av gnagare klippare, rakhyvel, sax, eller kemiska depilitory agent. Desinficera hårbotten med tre tillämpningar av alternerande 70% etanol och Betadine. Alla kirurgiska instrument bör också autoklaveras och sedan desinficeras med 70% etanol. Placera djuret i stereotaxic ramen med öron barer och näsa bar, som garanterar att huvudet är säker. Applicera ögonsalva att förhindra uttorkning av hornhinnor.
  6. Med en skalpell skära hårbotten från mellan ögonen till mellan öronen. Dra huden åt sidan för att exponera skallen och förankra huden med ett par klämmor. Rengör ytan av skallen. Den stereotaxic apparaten nollställs med spets glaspipett på bregma. Då spetsen är placerad vid injektionsstället (Antero-posterior, 3,30; Mellaneuropeiska Lateral, ± 0,82 för både höger och vänster hjärnhalva, respektive). Placeringen av näsan baren måste anpassas till beräkningen av stereotaxic koordinater. I vårt experiment är näsan bar justerat until bregma och injektionsstället anpassas till samma höjd.
  7. Identifiera injektionsstället. Med hjälp av en snabb kirurgisk borr, försiktigt borra hål i skallen. Med en böjd sprutnålen hakas i spetsen, ta bort resterna av tunna ben att exponera dura mater. Kontrollera att hålet är centrerat på rätt plats. Se till att inte fartyg brista blod på ytan av hjärnan under borrningen. Om blodkärl brustit, tryck försiktigt på ytan av hjärnan med en liten bomullspinne eller vävnad för flera sekunder tills blodflödet stoppar.
  8. Sänk pipett och noll Dorso-på magen höjd när spetsen på pipetten vidrör ytan av hjärnan. Sedan lägre till rätt Dorso-på magen djup (Dorso-på magen, 2,9 från hjärnan yta) och vänta 30 sekunder för tryck jämvikt. Injicera 4 gånger 50 nl virus för sammanlagt 200 nl. Vänta 30 sekunder mellan varje injektion.
  9. En minut efter den sista injektionen, långsamt dra rörettte. Upprepa punkt 1,6-1,8 för de andra halvklotet. Ta bort djuret från stereotaxic apparater, rena snittet och sy snittet huden med hjälp av kirurgiska trådar. Låt djuret att återhämta sig på uppvärmning pad innan han återvände till buren. Dessutom kan djuren ges en icke-steroida antiinflammatoriska smärtstillande (t.ex. Karprofen 4mg/kg) omedelbart efter och 3 dagar efter operation.

2. Kronisk LED-implantation för in vivo optogenetic stimulans i luktloben

  1. Djur injiceras med Lentiviral Particles bilateralt är nästa kroniskt implanteras med en miniatyr blå LED (Osram, LED CMS 4.6W blå). Löd LED stift till en kvinnlig miniatyr elektriska uttag så att kontakten är placerad på motsatt sida av LED. Kontrollera att det finns ingen elektrisk genväg och identifiera de positiva och negativa stift på kontakten. Testa lampan genom att ansluta den till en aktuell controller för LED men en riktig kabel.
  2. För att mäta och / eller ställa in den absoluta ljuset makt LED, montera lampan på ett mikromanipulator och placera LED i direkt kontakt med fotodetektor med en effekt meter en topp ljusintensitet på 470 nm. Borra ett hål på 3 mm i diameter i en ogenomskinlig PVC styrelse. Anbringa detta hål till wattmetern och bygga en standardkurva av optisk effekt kontra inströmmen att beräkna effekt per mm 2.
  3. För att mäta ljusets spridning genom hjärnan, skära bitar av färsk hjärnvävnad på 300, 500, 1000, 1500 och 2500 ìm tjocklek på 0-4 ° C ACSF med en vibratome 14. Placera en bit av skallen med en kraniotomi identisk med den som utförs i levande möss under lysdioden. Först mäter ljuset strömmen utan vävnad centrerad på LED. Sedan placera varje block av vävnad mellan LED och fotodetektor av kraftmätare och mäta strömmen. Bygg en kurva av vävnad tjocklek kontra relativ överföring bråkdel, beräknad som kvotenmellan den uppmätta effekten genom vävnad och utan vävnad.
  4. Bedöva en mus med 100 mg / kg ketamin och 10 mg / kg Xylazine, utspätt i steril koksaltlösning. Rengör och desinficera LED med 70% etanol. Ta bort håret från hårbotten av djuret och desinficera hårbotten med tre tillämpningar av alternerande 70% etanol och Betadine. Placera sedan djuret i stereotaxic ramen. Applicera ögonsalva att förhindra uttorkning av hornhinnor. Fäst sändaren på en stereotaxic innehavare. Placeringen av näsan baren bör justeras tills ytan av skallen ovanför luktbulben är helt horisontell och parallell med ytan i miniatyr LED.
  5. Med en skalpell skära hårbotten från 3 mm främre till ögonen till 3 mm posteriort om öronen. Dra huden åt sidan och förankra den med ett par klämmor. Skrapa bort hinnor på ytan av skallen med hjälp av ett rakblad. Rengör och torka skallen. Applicera ett tunt täcka av cyanoakrylatlim att tillåta efterföljande annonsmanhållning av dentala akryl.
  6. Med hjälp av en snabb kirurgisk borr, utför en rektangulär kraniotomi (1 mm stjärt och 3 mm i sidled, centrerad på 5,1 mm caudal, 0 mm i sidled från bregma) över lukt glödlampor. För att göra detta noggrant tunna skallen tills bara ett tunt lager av ben kvar. Ta försiktigt bort resterande ben med hjälp av en böjd sprutnålen. Särskild försiktighet bör iakttas för att undvika att punktera dura ärendet och spricker de stora blodkärl som ligger mellan de två hjärnhalvorna och i den bakre kanten av luktsinnet glödlampor. Blod ackumulering och koagulation vid hjärnans yta utesluter optimalt ljus tränger in i vävnaden. Skölj kraniotomi och ytan av hjärnan med steril koksaltlösning och torka sedan skallen.
  7. Fäst miniatyr LED till kontakten. Sänk miniatyr LED på toppen av luktsinnet glödlampor. Den främsta axel miniatyr LED bör vara parallell med rostralt-caudal axel musen, rengör med steril koksaltlösning och dry skallen. Sedan säker LED till skallen med en första lagret av akryl (dvs polycarboxylate cement), följt av ett andra lager av dentala akryl. Tillskottet av två små skruvar kan krävas för att fixa LED. Skruvarna bör införas på skallen (posteriort om LED-läge) och täcks med både akryl. Medan akryl är fortfarande flytande, dra tillbaka och limma fria kanter i hårbotten på ytan av det dentala akryl. Var noga med att inte tillämpa någon akryl på kontakten. Efter akryl har hårdnat, ta bort djuret från stereotaxic apparater och låt den återhämta sig på en uppvärmning pad innan han återvände till buren. Djur finns kvar isolerade i sin bur för att återhämta sig från operationen i minst sju dagar. Dessutom kan djuren ges en icke-steroida antiinflammatoriska smärtstillande (t.ex. Karprofen 4mg/kg) omedelbart efter och 3 dagar efter operation. Lysdioderna bör testas innan implantation och efter uppsägningen experimenten.
  8. Ett ljus elcal kabeln används för att tjudra djuren till en aktuell controller för LED kopplad till en pulsgenerator (Master-8) för att styra tidpunkten och intensiteten på lysdioden. Den tunna kabeln tillåter full rörelsefrihet. Var noga med att respektera polariteten på kontakten. Vända polariteten kan bryta LED.

3. Representativa resultat:

ChR2-YFP uttrycks i transduced nervceller cirka 48 timmar efter injektionen, och förblir stabila i flera månader 7. Figur 1 är en representativ bild av en sagittala del av en paraformaldehyd fasta djur 15 dagar efter injektion. Notera den täta märkning och storleken på injektionsstället i RMS. Ett stort antal nyfödda celler har migrerat längs RMS att kolonisera de olika lagren av luktbulben (Fig. 1). Den fusionsprotein uttrycks i alla neuron fack, inklusive soma, dendriter, och ryggar.

Miniature LED impla ntation gör storskalig och billig optisk stimulering av ett brett område av intresse. Djuret är tjudrad till LED controller med en lätt elektrisk kabel som gör att en fullständig rörelsefrihet. Genom karakteriserar ljusspridning i hjärnvävnaden och tröskeln ChR2 aktivering, uppskattar vi att optiska aktiveringen kan utlösas på ett djup av ~ 2 mm under ytan på LED (bild 2A). För att övervaka den funktionella aktivering av ChR2-uttryckande nervceller in vivo, kan uttrycket av c-fos, en markör för nervaktivitet, analyseras efter repetitiva ljus stimulering (Fig. 2B). Som ett alternativ kan in vitro elektrofysiologiska inspelningar av ChR2-uttryckande nervceller kopplade till centrum ljus stimulering ske 14. Slutligen har två-photon riktade lös-patch inspelningar använts för att studera den funktionella aktivering av ChR2-uttryckande kortikala neuroner av liknande miniatyr LED in vivo 9.

ntent "> Figur 1
Figur 1. ChR2-YFP uttryck från Lentiviral injektion i rostralt flyttande strömmen. Representant konfokala bilder av en saggital delar av luktbulben med musen 15 dagar efter injektioner av ett lentivirus i rostralt RMS. Notera förekomst av spridda YFP nyfödda nervceller migrerar från slutet av RMS till de olika lagren i OB. De flesta av nyfödda celler (95%) är granulat celler som soma ligga i Granule cellager (GCL) och dendriter arborize för yttre Plexiform Layer (EPL). En liten population av nyfödda nervceller vandrar upp till den mest ytliga lagret av OB, av glomerulär Layer (GL). Skala bar, 100μm. Inset, hög förstoring på en nyfödd granulat cell, visar membranet uttryck för ChR2-YFP i dendriter och i ryggar. Skala bar, 20 mikroM.

Figur 2 Figur 2. Diagram över implanterade LED på toppen av luktbulben och lätta framkallat c-FOS uttryck i ChR2-YFP uttrycka nya granule celler.
A, Schematisk bild av LED implanterade ovanför olfactory glödlampor.
B, representant konfokala bilder som visar dubbel-märkta ChR2-YFP + c-fos + granulat celler en timme efter ljus stimulering av luktbulben. C-FOS uttryck avslöjas med hjälp av en kanin anti-c-FOS primära antikroppen (Calbiochem, 1:5000) och A568-konjugerat anti-kanin sekundär antikropp (Invitrogen, 1:1000). Skala bar, 10μm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Optogenetic verktyg har nyligen ökat vår kontroll över selektiv neuronal befolkningar, inklusive vuxna född nervceller i luktsinne. Här beskriver vi hur du utför en stereotaxic injektion av en Lentiviral vektor som uttrycker ChR2-YFP i en viss population av vuxna födda nervceller. Genom att noggrant övervaka perioden efter injektion, kan vi analysera och manipulera aktiviteten hos en kohort av vuxna födda nervceller med en relativt homogen ålder.

Grund av deras låga spridning spridning, deras höga transduktion effektivitet och deras relativa goda tropism för neuroblaster av RMS bör Lentiviral vektorer gynnas jämfört med andra virala vektorer som retrovirus eller Adeno-associerad virus (AAV). Eftersom de selektivt infektera delande celler, som stamceller eller progenitorceller, måste retrovirus vektorer injiceras i subventrikulära zonen och transduce en mindre population av nyfödda nervceller. Jämfört med Lentiviral vectors, AAV vektorer ger en mycket högre smittspridning. Bör dock AAV transduktion av neuroblaster i RMS undvikas på grund av transduktion av omgivande strukturer som tillbehör lukt kärnan, en region som projekt axoner tillbaka in i luktbulben. Slutligen, användning av implanterade lysdioder kan tillämpas på andra ytliga strukturer i hjärnan, såsom kortikala regioner där ChR2 uttryck drivs i specifika populationer av nervceller via virala vektorer eller via en transgen mus linje 10.

Med LED-implantation, kan vi använda kroniska optisk stimulering för att studera den funktionella rollen för luktbulben vuxen neurogenes i vaken beter djur. Denna enkla ljuskälla ger ett snabbt tidsmässig styrning av ljus tack vare det sig är snabb på / av hastighet av lysdioder. Förutom att vara billig, producerar en miniatyr LED-ljuskälla tillräcklig effekt (~ 100 mW) för ChR2 aktivering i en stor volym i hjärnanvävnaden 11, även bilateralt i fallet med luktsinnet lampor. Detta är särskilt viktigt i detta hjärnan område där betydande lesioner kan vara utan inverkan på lukt kvalitet uppfattning på grund av en hög grad av redundans i de inlägg som luktepitel 12. Tack vare sin makt och dess spektrala bandbredd (25nm) kan dessa miniatyr lysdioder användas för lättare framkallat-excitation med ChR2 liksom andra versioner av channelrhodopsins som Cheta eller fånga. Miniatyr gul (597nm) och rött (624 eller 637nm) lysdioder är tillgängliga att användas för röda förskjuts-rhodopsins som halorhodopsin och VChR1 13.

Miniatyr lysdioder visar också begränsningar. För att undvika uppvärmning av hjärnan, måste en kompromiss hittas mellan pulslängd, pulsfrekvens, och ljusintensitet. Till exempel är korta ljuspulser av 5 millisekunder rekommenderas vid höga frekvenser (> 20 Hz) och ljusintensitet på 100 mW. Ovanför denna tid, en signifikantamyra förhöjning av temperaturen (~ 1-4 ° C) i den omgivande vävnaden kan mätas. Denna parameter bör beaktas för längre ljuspulser (> 5 ms) eller kontinuerligt ljus stimulans, särskilt när det gäller ljuset framkallade-hyperpolarisering med halorhodopsin. Dessutom ger den nuvarande leverera LED starka elektriska artefakt, som kan utesluta in vivo elektrofysiologiska inspelningar när lysdioden är i direkt kontakt med vävnaden. Laser-kopplade optiska fibrer utgör ett möjligt alternativ, vilket gör att en mindre och mer begränsad optisk stimulering. Dock kan den stela optiska fibrer störa vissa beteenden.

Efter kännetecknar ljusets penetration och funktionell stimulering av nervceller med ljus, kan in vivo optisk stimulering utlösas i kombination med beteendeterapi experiment. Särskild försiktighet bör iakttas när det gäller tidpunkten för stimulans. Synkronisering av photostimuning med ett specifikt beteende eller uppgift i ett beteende-apparat, särskilt under operant betingning, kan vara avgörande för att fastställa ett orsakssamband mellan cellens aktivering och beteende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av livbolaget "Novalis-Taitbout", Ecole des Neurovetenskap de Paris (ENP), Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-neur-004" inom ramen för "ERA-NET NEURON" av FP7-program från Europeiska kommissionen, "Stiftelsen pour la Recherche médicale", den Letten Foundation och Pasteur stiftelsen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Merial Imalgène 1000
Xylazine Bayer AG Rompum 0.2%
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Glass Capillaries (3.5") Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Nanoject II Microinjector Drummond Scientific 3-000-204
High speed surgical drill Fine Science Tools 18000-17
Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter Fine Science Tools 19008-07
LED CMS blue 4.6 W OSRAM LBW5SN
Female electrical connector (2.54 mm) Fisher Scientific BL5.36Z
Current controller for LED (max: 1A) A1W Electronik HKO-KL50-1000
Pulse generator AMPI Master-8
Optical power meter Thorlabs Inc. PM100
Cyanoacrylate adhesive Loctite 454
Polycarboxylate cement (first layer cement) Septodont Selfast (#0068Q)
Methacrylate cement (second layer cement) GC International Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114)
Carprofen Pfizer Pharma GmbH Rimadyl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
  2. Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ. J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).
  3. Mouret, A. Learning and survival of newly generated neurons: when time matters. J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).
  4. Bardy, C. How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).
  5. Haubensak, W. Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear. Nature. 468, 270-276 (2010).
  6. Zhang, F. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  7. Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).
  8. Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature protocols. 5, 247-254 (2010).
  9. Huber, D. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature. 451, 61-64 (2010).
  10. Arenkiel, B. R. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 Forthcoming.
  11. Albeanu, D. F. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).
  12. Slotnick, B., Bodyak, N. Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs. J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).
  13. Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
  14. Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons. J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics