Kraniofasial mezenşimin, Elektroporasyon

Biology
 

ERRATUM NOTICE

Summary

Kraniofasial kıkırdaklar diğer dokuları ile yakın temas içinde gelişir ve canlı hayvan işlemek için zordur. Elektroporasyon erken embriyonik etkileri atlayarak kraniyofasiyal iskeletin büyüme sırasında moleküler araçlar sunmak için kullanıyor. Bu yaklaşım, aday moleküllerin etkin bir şekilde test etmek için bize izin verecek

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tabler, J. M., Liu, K. J. Electroporation of Craniofacial Mesenchyme. J. Vis. Exp. (57), e3381, doi:10.3791/3381 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Elektroporasyon, hassas zaman noktalarında dokulara ve hassas yerlerde DNA ve diğer ücret makromoleküllerin teslim etkili bir yöntemdir. Örneğin, elektroporasyon Xenopus sinir ve retina gelişimini incelemek için büyük bir başarı ile kullanılan, tavuk ve fare 1-10. Ancak, tüm bu çalışmalarda, araştırmacılar yumuşak dokuların hedefleyen çalışmalar olduğunu not etmek önemlidir. Kraniyofasiyal gelişim ile ilgilenen, çünkü biz bir yöntem yüz mezenşimin hedef uyarladı.

Edebiyat aradı, biz, bizim için sürpriz, kıkırdak dokusu içine başarılı gen transferi çok az raporlar bulundu. Bu çalışmaların çoğu, gen terapisi çalışmaları, chondrogenic hücre hatları içine siRNA veya protein teslimat, ya da artrit 11-13 hayvan modelleri gibi . , Tavuk ya da fare gibi diğer sistemleri, yüz mezenşimin elektroporasyon zorlu olmuştur (kişisel HABERLEiyonlar, Kraniofasial Geliştirme Bölümü, KCL). Biz Xenopus procartilaginous ve kıkırdak dokulara elektroporasyon daha iyi çalışması olabileceği varsayımında bulunduk. Çalışmalarda, biz yüz kıkırdaklar gen transferi yüz primordium hala kıkırdak farklılaşması önce yumuşak doku oluşur erken evrelerinde (28), verimli bir şekilde oluşur.

Xenopus kraniyofasiyal gelişim analizi için çok erişilebilir omurgalı sistemi. Xenopus embriyoların en erken aşamalarında analizler sağlayan, dışarıdan döllenmiş ve canlı tek bir hücre çözünürlükte görüntüleme yanı sıra annelere 14 yeniden kolaylaştırılması Kraniofasial yapıları nedeniyle daha kolay görünür Xenopus başka herhangi bir omurgalı modeli daha, öncelikle. Dışarıdan gelişmekte olan omurgalı modeller arasında, Xenopus larvaları di daha büyük ve daha kolay olarak Xenopus zebrafish daha kraniyofasiyal analizi için daha yararlı .ssect ve gelişmekte olan yüz bölgesine balık eşdeğer bölgesi dışında görüntüleme için daha erişilebilir. Buna ek olarak, Xenopus zebrafish (~ 100 milyon yıl yakın) 15 daha insanlar için evrimsel olarak yakın. Son olarak, bu aşamada, Xenopus tetarlar şeffaf ve floresan proteinlerle veya moleküller eşzamanlı ifade gelişmekte olan kıkırdaklar daha kolay görsellik sağlayacaktır. Biz bu yaklaşımı bize daha hızlı ve verimli bir şekilde in vivo model sistem bir aday molekülleri test etmek için izin olacağını tahmin ediyoruz.

Protocol

Bölüm 1A. Ekipman

Mikroskop: düşük güç amacı ile dik stereo diseksiyon kapsamı

  • Gerilim / Pulse Generator: BTX ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon Sistemi
  • Pipet çektirmesi: P-87 Mikropipet Çektirme (Sutter Instrument Company, CA)
  • Manipulator: kaba, ya da kombine kaba ve ince hazırlık bağlı.
  • Mikropipet sahibi: Güzel Bilim Araçları
  • Elektrot: ev yapımı
  • Elektroporasyon kamara: ev yapımı

L-şekilli elektrotlar:

  1. Yüksek saflıkta 8 cm 0.4 mm tungsten tel (Goodfellow) ve orta noktasında yapıştırmayın kesin 1ml şırınga kullanarak bir macun (Blu-Tack). 4 cm tungsten tel L şekline bend ucu ve şırınga ucu açık bırakın, ucundan 1 cm (Şekil 1A).
  2. Ucu sonuna kadar uzunluğu 0.5 mm boyutlarında kesin. Tonun ucu elektrot uçtur.
  3. Şırıngaya aşırı tungsten tel paralel ve elektrot nabız jeneratörü bağlamak için onu kullanabilirsiniz.
  4. Bir çift elektrot verme işlemi tekrarlayın.
  5. DC kablolar üzerinden kare dalga darbe jeneratörü elektrotları takın.

Elektroporasyon kamara

  1. Hat alt ~ 5 mm non-toksik hamuru ile 90 mm çanak.
  2. Elektroporasyon medya ile çanak doldurun.
  3. No: 5 saatçilik forseps T-şekilli bir kuyu (Şekil 2) bölmek. ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm ve kısa ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm uzun iyi ölçmelidir. Elektroporasyon bulaşık yıkanır ve tekrar kullanılabilir.

Bölüm 1B. Reaktifler

DNA veya tahsil makromoleküllerin

  • Mikropipetler: 1 mm genişliğinde 4 "uzun borosilikat cam kapilerleri (TEFE, TW100-F)
  • Kültür medya: Normal Amfibi Medya (NAM)
  • > 10 X stoğu: 1100 mM NaCl, 20mM KCL, 10 mM Ca (NO 3) 2 • 4H 2 O, 1 mM EDTA.
    • 4 ° C'de Otoklav ve mağaza
    • 1 X NAM: 10x stok, tampon 0.1 mM NaHCO 3 ve 0.2 mM Na 3 PO 4 ile seyreltilir.
  • Xenopus laevis tetarlar, sahne 28

DNA hazırlığı:

  1. Ifade plazmid standart protokolleri kullanarak hazırlayın.
  2. Nükleaz serbest H 2 0 1 mcg / ml final konsantrasyonda DNA tekrar

* PCS2 gibi güçlü bir CMV organizatörü içeren vektörler, başarı vardı + [16]. Soy analizi için, biz genellikle son bir 0.1 mg / ml konsantrasyonda yeşil floresan proteininin (pCS2 GFP) kodlayan DNA içerir. [0.1-3 mg / ml arasında DNA konsantrasyonları da test edildi. Biz bulduğu konsantrasyonları 0.8 mg / ml verimsiz etiketli hücre altında, daha fazla DNA konsantrasyonları ise 2 mg / mu; l elektroporasyon verimliliğini artırmak vermedi].

Morfolino oligonükleotid hazırlanması:

(Not:. Pratisyenler fluoresceinated gerekir (3'-carboxyfluorescein değiştirilmiş) veya başka bir ücret)

  1. Süspanse edin morfolino oligonükleotidler (MOS) (Genetools, www.genetools.com nükleaz serbest H 2 0 2 mM konsantrasyonda).
  2. Isı kısım stok solüsyonu 65 ° C'de 5 dakika.
  3. Son konsantrasyonu 0.5 mM nükleaz ücretsiz su sulandırınız.

* 0.1-1mm MO çözümleri test edildi. 0.5 mM MO çözümler birçok mezenkimal hücreler elektroporasyon için yeterli oldu.

Mikropipetler

  1. Borosilikat cam kılcal damarlar (1 mm genişliğinde, 4 "uzun, TEFE yok. TW100-F) mikropipetler hazırlayın. Mikropipetler hazırlamak, 8-12 mm uzunluğunda konik ve ince uçlu iğne çektirmesi kullanın.
  2. Crush ucu ~ 2 mmucundan, forseps kullanarak pürüzlü bir duraklama.

Medya

  1. Kuluçka medya: 1x stok taze 3 / 4 Normal Amfibi Medya (NAM) hazırlayın. 0.025 mg / ml gentamisin ekleyin.
  2. Elektroporasyon medya: yukarıdaki gibi,% 0.1 Benzocaine (Sigma, 06.950).

2. Elektroporasyon

Mikropipet kurulum

  1. Mikropipet ~ 1 ul enjeksiyon solüsyonu ile doldurun.
  2. Mikromanipülatör mikropipet Güvenli ve mikroenjektör (Picospritzer II) ekleyin.
  3. Masa üstü ile 50 ° açı mikropipet.
  4. Enjeksiyon basıncı 20 PSI olarak ayarlayın.
  5. Puls başına 30 nl enjekte mikropipet kalibre edin.

Tadpole hazırlık

  1. 5 dakika elektroporasyon medya kuluçka aşamasında 28 Xenopus larvaları anestezisi.
  2. Elektroporasyon medya ile dolu elektroporasyon odasına anestezi larva transferi. Pozisyonu embriyoUzun içinde baş, aşağı dorsal tarafına ve ventral tarafta maruz T kavşak aittir. Kafa, kuyruk göre biraz yüksek olmalıdır.
  3. Forseps kullanarak, hafifçe hamuru çevreleyen ile larva güvenli. (Not:. Larva güvenli değilse, seğirme ve elektroporasyon sırasında elektrot ile irtibata Bu durumda yüz dokular ciddi hasar görecek olması, tetra atmak)

Elektroporasyon

  1. Mikropipet ucu hemen çimento bezi ve arka yüz mezenşimin içine yerleştirin.
  2. 30 nl çözüm mezenşimin içine enjekte edilir.
  3. Mikropipet geri çekin.
  4. Hızla embriyonun kafası (Şekil 3) paralel elektrot uçları aynı hizaya getirin.
  5. 8 50 ms, 20mV kare darbeleri uygulayın.
  6. Elektrotlar geri çekin.
  7. Forseps kullanarak dikkatli bir şekilde larva serbest ve 3 / 4, NAM, 0.025 mg / ml gentamisin transfer.
  8. 3 / 4, NAM, 0.025 mg / ml overn tetarlar inkübe edilmelidir.ight, ya da daha uzun.
  9. 24 saat sonra floresan mikroskobu ile verimli elektroporasyon Ekran embriyolar.

3. Temsilcisi Sonuçlar:

Floresan moleküllerin electroporated embriyoların kullanımı kolay tarama sağlar. Şekil 4 14.5 inkübe MO electroporated tetarlar ~ 12, 48 ve 96 saat sonra elektroporasyon tipik bir parti, ° C Floresan mikroskobu kullanarak, katille elektroporasyon sonra hemen görüntülenebilmekte ve elektroporasyon sonra birkaç gün süreyle devam edilebilir. Bizim tecrübelerimize göre, floresan aşamada 46 (~ 5 gün sonra) zayıf açıktır. Kıkırdaklar, floresan farklılaşma (~ St 42) başladıktan sonra dramatik bir şekilde azalır, ancak MO floresan gibi faringeal endoderm gibi diğer hücre tiplerinde daha güçlü devam. Floresan mikroskopi oligonükleotidler kıkırdak dahil olmak üzere birçok kraniyofasiyal dokular dahil olduğunu gösterir. Oligonükleotid floresans cgenellikle başın iki tarafında doku görüntülenebilmekte. Bu büyük olasılıkla elektroporasyon önce gevşek kraniyofasiyal mezenşimin boyunca enjeksiyon solüsyonu hızlı difüzyon nedeniyle.

Şekil 1
Şekil 1 Homemade elektrotlar. L-şekilli tungsten tel, toksik olmayan kil veya macun kullanarak 1 ml şırınga eklenir. (A) elektrot terminus, 5 mm. (B) Termini paralel olarak, bir çift elektrot takın. Elektrotlar DC kabloları ile darbe jeneratörüne bağlı.

Şekil 2
Şekil 2 Elektroporasyon kamara. (A) hamuru ile kaplı 90 mm çanak medya ve No 5 saatçilik forseps ile oyulmuş bir T-şeklindeki haznesi ile doludur. (B) uzun kenarı 2 mm X 2 mm X10 mm boyutlarındakısa önlemleri 2 mm X 2 mm x 5 mm iken. Embriyonun baş T-kavşak, ventral tarafta aittir.

Şekil 3
Şekil 3 şematik gösteren elektroporasyon prosedür. St 28 larva ventral yüzü yukarı, elektroporasyon odasında yerleştirilir. Mikropipet yüz mezenşimin yatan çimento bezi içine yerleştirilir. Enjekte edilir. Mikropipet kaldırılır ve L-şekilli elektrotlar kafa paralel yan hizalanır. Sekiz 50 ms, 20 mV kare darbeleri uygulayın. Elektrotlar geri çekin. Istenilen safhalarında tetarlar büyütün. Pratisyenler veya floresan mikroskobu kullanarak GFP ifade görselleştirin.

Şekil 4
Şekil 4 Temsilcisi tetarlar 12 (A), 48 (B) ve 96 (C) saat elektroporasyon (sırasıyla aşamaları 30, 34 ve 44). (A-B ") Floresan MO geyik kraniyofasiyal mezenşimin içinde görüntülenebilmektees 30 ve 34. Floresans aşamada 44 (ok ucu, C'-C ") az kıkırdaklar tespit edilebilir. Gut yüksek autofluorescent.

Discussion

Bu video, Xenopus iribaşların yüz mezenşimin elektroporasyon aracılı gen teslim fizibilite göstermiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, bize daha sonraki zaman noktalarında belirli dokuları hedef sağlayan genin fonksiyonu manipüle erken gelişimsel etkileri atlayabilir. Çalışmalar bize electroporated hücrelerin yanı sıra ilgi proteinlerin hücre özerk gereksinimleri soy incelemek için izin, heterojen toplumlarda kraniyofasiyal mezenkimal hücreler etkilenmiş olabileceğini göstermektedir. Canlı görüntüleme ile birlikte, biz kraniyofasiyal gelişimi sırasında, zaman içinde gen fonksiyonunu incelemek için bu yaklaşımı kullanabilirsiniz. Bu yeni bir yöntem organogenez çalışma Xenopus tractability vurgulamaktadır. Biz genel olarak bu yöntem de morfolojilerinden ve diğer dokulara farklılaşma çalışma adapte edilebilir olduğunu tahmin ediyoruz.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Biz Nancy Papalopulu ve Boyan BONEV Xenopus elektroporasyon ile yardım için teşekkür ediyoruz. Ayrıca, eleştirel okuma, Jeremy Green ve John Liu laboratuar verdikleri destek için yararlı tartışmalar ve üyeleri Wallingford Marc Dionne teşekkür ederim. Bu çalışma BBSRC (BB/E013872/1) ve Wellcome Trust (081880/Z/06/Z) KJL hibe tarafından finanse edildi.

References

  1. Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis. Dev. Cell. 20, 19-32 (2011).
  2. Haas, K. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
  3. Calegari, F. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
  4. Drinjakovic, J. E3 ligase Nedd4 promotes axon branching by downregulating PTEN. Neuron. 65, 341-357 (2010).
  5. Falk, J. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC. Dev. Biol. 7, 107-107 (2007).
  6. Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain. J. Vis. Exp. (17), e705-e705 (2008).
  7. Kuriyama, S. Tsukushi controls ectodermal patterning and neural crest specification in Xenopus by direct regulation. of BMP4 and X-delta-1 activity. Development. 133, 75-88 (2006).
  8. Mende, M., Christophorou, N. A., Streit, A. Specific and effective gene knock-down in early chick embryos using morpholinos but not pRFPRNAi vectors. Mech. Dev. 125, 947-962 (2008).
  9. Neumann, E. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. Embo. J. 1, 841-845 (1982).
  10. Price, S. R. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109, 205-216 (2002).
  11. Grossin, L. Direct gene transfer into rat articular cartilage by in vivo electroporation. Faseb. J. 17, 829-835 (2003).
  12. Khoury, M. A comparative study on intra-articular versus systemic gene electrotransfer in experimental arthritis. J. Gene. Med. 8, 1027-1036 (2006).
  13. Takahashi, D. Down-regulation of cathepsin K in synovium leads to progression of osteoarthritis in rabbits. Arthritis. Rheum. 60, 2372-2380 (2009).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratories Press. (2000).
  15. Wheeler, G. N., Brandli, A. W. Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: lessons from zebrafish and Xenopus. Dev. Dyn. 238, 1287-1308 (2009).
  16. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes. Dev. 8, 1434-1447 (1994).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme
Posted by JoVE Editors on 06/28/2013. Citeable Link.

The units for the voltage were incorrectly entered in, Electroporation of Craniofacial Mesenchyme, in two places.

  1. Apply 8 50 ms, 20mV square pulses.
  2. Apply eight 50 ms, 20 mV square pulses.

These were corrected to:

  1. Apply 8 50 ms, 20 V square pulses.
  2. Apply eight 50 ms, 20 V square pulses.

Comments

4 Comments

  1. The protocol worked, but there is a mistake. The voltage that the square pulse generator needs to be set to is ²0 volts, not Millivolts as listed throughout the protocol. Other than that, the procedure worked well.

    Reply
    Posted by: Tejas A.
    June 18, 2013 - 11:48 PM
  2. You are right! We made the error when writing the script. The appropriate voltage is ²0 volts. (The BTX ECM 830 has a voltage of 5V to 3000V.) I shall correct the protocol.

    Many thanks for alerting us,
    Karen Liu

    Reply
    Posted by: Karen L.
    June 21, 2013 - 6:02 AM
  3. Something funny about the display in the commenting system. The correct voltage is indeed TWENTY volts.
    -Karen Liu

    Reply
    Posted by: Karen L.
    June 26, 2013 - 4:15 AM
  4. I would like to know if you've been able to perform this protocol with younger embryos like st 16/17?

    Reply
    Posted by: Maria Belen P.
    January 25, 2018 - 4:01 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics