좌골 신경 및 쥐의 통증 과민성 시험의 만성 수축

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Summary

수술의 단순하고 강력한 행동 결과로 인해 좌골 신경의 만성적인 수축이 neuropathic 고통의 사전 저명한 동물 모델 중 하나입니다. 수술에 따라 24 시간 내에 통증 과민성 설립되고 양적 폰 프라이 aesthesiometer (기계적 시험)과 발바닥 진통제 측정기 (온도 시험)를 사용하여 측정할 수있다.

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Austin, P. J., Wu, A., Moalem-Taylor, G. Chronic Constriction of the Sciatic Nerve and Pain Hypersensitivity Testing in Rats. J. Vis. Exp. (61), e3393, doi:10.3791/3393 (2012).

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Abstract

만성 neuropathic 고통은 중앙 또는 주변 신경계 손상으로 인한, 인구 1,2의 7~18% 영향을 만연하고 쇠약 조건이다. 증상은 자연 (같은 간지, 굽기, 전기 충격) 고통, dysaesthesia, paraesthesia, allodynia (통증이 보통이 아닌 고통스러운 자극으로 인한) 및 hyperalgesia합니다 (통증 자극에 대한 향상된 응답)가 있습니다. 감각 증상은 불면증과 우울증과 같은 행동 장애와 공동 병적입니다. 만성 neuropathic 고통을 공부하고 말초 신경 손상을 흉내낸 여러 동물 모델이 개발되었고, 가장 널리 사용되는 중 하나는 베넷과 샤오의 (1988) 일방적 좌골 신경 만성 수축 상해 (CCI) 3 (그림 1)입니다. 여기 CCI 및 테스트 고통 과민성을 수행하기위한 방법을 제시한다.

CCI는 다음과 같이함으로써 노출된 한쪽에서 좌골 신경으로 마취하에 수행됩니다친척 절개하고 gluteus superficialis와 팔뚝 femoris 근육 사이의 결합 조직을 통해 절단. 네 삼가의 크롬을 함유하는 제품 내장 ligatures 그냥 윗니와 아랫니가 맞물리다 위해, 1 밀리미터 간격으로 좌골 신경 주위에 느슨하게 연결되어 있지만 epineural 혈류를 체포되지 않습니다. 상처가 피부의 근육 및 스테이플의 봉합으로 닫힙니다. 동물 그때 통증 과민성 시험이 시작되기 전에 24 시간 동안 수술에서 회복하기 위해 허용됩니다.

행동 테스트를 위해 쥐나는 테스트 장치에 배치하고 테스트 절차에 길들 수있게됩니다. 테스트 영역은 좌골 신경 분포에 속하는 hindpaw의 중반 발바닥 표면 (그림 2)이다. 기계 인출 한도는 기계 전자 동적 발바닥 폰 프라이 aesthesiometer 또는 수동 폰 프라이 머리카락 4를 사용하여 부상 및 손상되지 않은 hindpaws을 모두 자극에 의해 평가된다. 기계 인출 한도는 진력 최대 압력(g)를 그것의 발자국이 탈퇴를 실행시킵니다. 첫째 학스다 (1988)에 기술된 열 인출 지연의 측정은 hindpaw는 발바닥 진통제 측정기 5,6를 사용하여 투명한 유리 표면을 통해 복사열의 광선에 노출됩니다. 열 자극에 대한 탈퇴 대기 시간은 부상과 손상되지 않은 hindpaws 모두에서 발자국 철회를위한 시간으로 기록됩니다. 이어 CCI, 부상 한것 땜에 기계적 인출 한도뿐만 아니라 열 인출 지연 시간 기준 측정과 손상되지 않은 앞발로 땅을 차다 (그림 3)에 비해 모두 크게 줄일 수 있습니다. 통증 과민성 테스트와 함께 말초 신경 손상의 CCI 모델은 만성 neuropathic 고통을 수정하는 잠재적인 치료 대리인의 효과를 조사하기위한 모델 시스템을 제공합니다. 저희 연구실에서는 pathogenesis에 신경 면역 상호 작용의 역할을 조사하기 위해 hindpaws의 열 및 기계적 감도와 함께 CCI를 활용neuropathic 고통과 치료.

Protocol

1. 좌골 신경 만성 수축

무균 기술은 수술을 위해 사용해야합니다. 70 % 에탄올로 수술 작업 표면을 소독하고 autoclaving에 의해 사전에 멸균 악기 (예 : 미세 가위, 포셉, 그리고 견인기), gauzes, 스테이플과 면봉으로 준비합니다. 여러 수술의 경우 청소 및 70 % 에탄올이나 쥐 사이에 마른 비드 steriliser와 resterilise 악기. 외과 마스크, 헤어 모자와 멸균 장갑을 착용한다.

신경의 수축 들어, 건조 방지를 위해, 멸균 식염수에 포장되어 약 3 cm 길이의 작은 조각으로 절단하여 삼가의 크롬을 함유하는 장치 내장 봉합사를 준비합니다. 상처를 닫을 경우, 상용 멸균 실크 봉합을 사용합니다.

  1. O 2의 isoflurane 5 %를 사용하는 유도 챔버에 쥐를 Anaesthetise 다음, 안면 만든 사용자 정의를 통해 O 2에서 isoflurane 2 % 제공하고, 절차를 수행하는 동안 anesthetised 동물을 모니터링. 일반적인 대안 anesthetics는 할로탄 또는 intraperitoneal 나트륨은 pentobarbital 흡입됩니다. 이들 수용체는 neuropathic 고통의 개발에 중요한 이후 케타민을은 N-메틸-D-aspartate (NMDA) 수용체 길항제로 피해야한다.
  2. 쥐의 왼쪽 뒷다리 다리를 면도. 그런 다음, 37에서 열 조절 난방 매트에 동물을 배치 ° C와 눈에 윤활 안과 연고를 적용합니다.
  3. 70% 이소 프로필 알코올과 요오드 용액 세 가지 다른 응용 프로그램과 함께 면도 영역을 소독.
  4. 쥐가 가슴 / 흉부에 누워으로 왼쪽 뒷다리 다리를 위로 향하게하고 발을 마스킹 테이프를 사용하여 척추 90 °에서 femor과 위치에 누르고 있습니다.
  5. 피부 병렬 절개하지만 femor 아래 3~4mm, 그리고 결합 조직을 절단하여 절개를 둘러싼 근육에서 무료로 피부를 확인합니다.
  6. gluteus superficialis와 팔뚝 사이의 결합 조직을 잘라 무딘 가위를 이용하여femoris 근육.
  7. 좌골 신경의 명확한 시각화 수 있도록,이 두 근육 사이의 간격을 넓혀 리트 렉터를 사용합니다.
  8. 곡선 야기한 스쳐 포셉 및 마이크로 가위, 주변의 결합 조직에서 좌골 신경의 부드럽게 무료로 약 10 밀리 (좌골 trifurcation에 근위)를 사용.
  9. 현미경과 좋은 광원에서, 이중 매듭으로 좌골 신경의 trifurcation에 근위 간격 1mm를, 넷 ligatures을 (삼가의 크롬을 함유하는 직감 4.0, Ethicon, 미국) 매다. 각각의 끈 들어, 하나의 느슨한 루프로 시작, 다음 루프 가까운 두 끝을 파악하고 루프 살짝만 아늑한되고 봉합사는 신경을 따라 미끄러지게하지 않는까지 조입니다. 의 적절한 위치에 루프를 개최하려면, 매듭을 완성을 가장 먼저 위에 두 번째 루프를 놓으십시오. 마지막으로, 1mm 주위에 묶인의 미심쩍은 부분을 절단. 신경의 수축이 최소화되고, 간단한 떨리는이 관찰되면 즉시 중지, 일 때문에 체포되지 않도록해야전자 epineural 혈액의 흐름. ligatures 단단히 걸쳐 axotomy로 연결하고, autotomy (자동 절단), 성공적인 통증 과민성 테스트를 배제 모두 원치 않는 부작용.
  10. 피부를 고정하는 근육 레이어와 스테이플 (Autoclip, 9 밀리) 닫습 봉합 (Mersilk 5.0, Ethicon)를 사용합니다. 다음, 상처를 소독하기 (Riodine) 요오드 용액을 사용하십시오.
  11. 질식 의식 동물을 방지하기 위해, 마취 회복 기간 동안 긴밀하게 쥐를 관찰하고, 그것이 평평한 종이 침구 (아니라 표준 동물 축산의 침구)와 별도의 새장에 복구할 수 있습니다.
    어떤 수술 진통제의 수사를 제공하기 전에 이것이 통증 과민성 시험을 방해할 수있는 사실을 고려해야합니다. 사실, 부상 당시 마취제, lidocaine의 로컬 응용 프로그램이 neuropathic 고통의 발전을 변경하고, 이전 주 7 hyperalgesia의 정도를 감소 수있다는 증거가있다. 이 m에 대한 논의는베넷 8 시까지 리뷰를보고 atter.

2. 통증 Behaviours의 측정

  1. 실험을 시작하기 전에 며칠 동안 쥐의 일일 처리는 해당 처리기에 쥐가 의히다 스트레스와 물고의 위험을 줄이기 위해 권장합니다.
  2. 행동적 테스트에 앞서, 쥐가 테스트 절차 및 동물 인클로저에게 길들여해야합니다. 테스트 환경은 조용하고 보관하고 잘 일정한 온도 및 습도 수준으로 조절하고, 하루 중 비슷한 시간을 각 테스트 세션에서 수행되어야합니다.
  3. 통증 과민성 테스트는 원하는대로, CCI (기준) 이전과 CCI 후 다른 시간 지점에서 여러 번 수행해야합니다.

3. 기계 탈퇴 임계값

  1. 시험 당일, 장소의 쥐 고가 메쉬 낭패 테스트 케이지로 탈퇴 임계값을 측정하기 전에 15-30분, 새장 탐사 및 groo있게명나라 활동을 중단하고 쥐가 편안하고 고정이 될 수 있습니다.
  2. 직접 hindpaw의 중반 발바닥 표면 바로 아래에 동적 발바닥 폰 프라이 aesthesiometer (우고 Basile, 이탈리아), 위치 필라멘트와 터치 자극기 장치를 사용하여 금속 메쉬 피하 시작 키를 누르십시오. 이것은 기계적으로 증가 힘으로 hindpaw의 발바닥 표면을 자극하기 위해 필라멘트를 올렸으니까요.

수동 폰 프라이의 머리카락은 피부에 적용할 때 특정 무력을 유도하도록 조정되는 직경 필라멘트 증가의 연속입니다. 그들의 발자국이 인출 한도 등 이전 4 설명된 측정을위한 전자 동적 발바닥 폰 프라이의 aesthesiometer의 대안으로 사용될 수 있습니다. 전자 폰 프라이 aesthesiometers (예 IITC, 미국 및 Somedic, 스웨덴)의 여러 다른 제조 업체도 있습니다.

  1. 부상 및 손상되지 않은 두 hindpa에서 기계 탈퇴 임계값을 기록WS, counterbalanced 순서를 유지해야합니다. 이 장치는 웃기고 압력을 적용하고 금단 반응에 따라 시스템이 자동으로 기록하고 (g)을 적용 최강 군사력을 표시합니다. 모호한 응답 (ambulation이나 정리의 경우 IE)가 발생하면, 자극을 반복하고 다시 임계값을 기록합니다. 빠는데 또는 hindpaw의 다음의 자극을 떨고있는 것은 고통과 관련된 행동의 징후입니다.
  2. 기계적 자극에게 자극 사이에 약 5 분 간격으로 3 회 반복 임계값을 기록하고 발자국 탈퇴 임계값의 평균을 계산합니다.

4. 열 탈퇴 대기 시간

발바닥 테스트 악기의 적외선 (IR​​) 가열 강도는 실험을 시작하기 전에 조정해야합니다. 저희 연구실에서는, 우리는 순진 쥐 10 초 정도의 평균 발자국 탈퇴 대기 시간을 제공하기 위해 적외선 강도를 조절, 우리는 조직 댐을 피하기 데는 20 초 컷 - 오프 지연 시간을 설정앞발을 제거하는 실패의 경우 연령.

  1. 시험 당일, 장소 15-30분 지연을 측정하기 전에 유리 낭패 테스트 케이지에 쥐, 케이지 탐사를 허용하고 중단을위한 활동을 정리하고 쥐가 편안하고 고정이되었습니다.
  2. 직접 hindpaw의 중반 발바닥 표면 바로 아래에 열 발바닥 진통제 악기 (우고 Basile, 이탈리아), 위치 적외선 소스를 사용하여 시작 키를 누르십시오. 이것은 투명한 유리 표면을 통해 복사열의 광선에 hindpaw의 발바닥 표면을 제공합니다. 열 발바닥 진통제 악기 (예 : IITC, 미국 및 Stoelting, 미국)의 다른 제조 업체도 있습니다.
  3. counterbalanced 위해 부상과 손상되지 않은 두 hindpaws에서 탈퇴 대기 시간을 기록합니다. 이 장치는 자동으로 열원에서 손 철회에 대한 열 자극의 발병에서 (초) 촬영 시간을 기록합니다. 모호한 반응이 발생하는 경우 (ambula의 경우 즉,기 또는 정리), 자극을 반복하고 다시 대기 시간을 기록합니다. 빠는데 또는 hindpaw의 다음의 자극을 떨고있는 것은 고통과 관련된 행동의 징후입니다.
  4. 열 자극에게 자극 사이에 약 5 분 간격으로 적어도 3 번 반복, 대기 시간을 기록하고 발자국 탈퇴 대기 시간의 평균을 계산합니다.

4. 대표 결과

Wistar 쥐의 (손상되지 않은) ipsilateral (부상)과 contralateral 발냄새의 기계적 인출 한도 및 열 회수 지연의 예제는 앞에 표시 (베이스 라인) 및 2~12일 그림 3A의 CCI, 그리고 그림 3B 이후. 있습니다 이러한 수치에서 그것은 CCI는, 기계적 및 열적 통증 과민성의 존재를 나타내는, 기계 금단 임계값과 ipsilateral hindpaw의 열 인출 대기 모두에서 상당한 감소를 일으키는 것을 볼 수있는 만성 neuropathic 고통의 두 기능 .

그림 1
그림 1. CCI 모델 ligatures의 위치를 보여주는 개략도. neuropathic 고통의이 동물 모델은 중간 허벅지 수준에서 좌골 신경 네개의 느슨한 삼가의 크롬을 함유하는 - 내장 ligatures의 배치를 포함한다. 그것은 hindpaw 기슭와 후속 통증 과민성에가는 afferents의 일부만 손상에 대한 결과입니다.

그림 2
그림 2. 통증이 테스트에 사용 hindpaw 영역의 다이어그램. 같은 빨간색 점선 동그라미로 표시 footpads에서 불과 후부 중반 발바닥 표면은, 고통 테스트에 사용됩니다. 이 지역은 좌골 신경의 말단 지점에서 주로 innervated 있습니다. 뒤꿈치와 footpads는 차동 피부 민감도에 따라 피해야한다.

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쥐의 좌골 신경의 만성적인 수축에 따라 그림 3. 통증 과민성. CCI 후, 기계적 자극 (A)와 (B) 부상에서 열 자극에 발자국 탈퇴 대기 시간 (ipsilateral)에 발자국 탈퇴 임계값에 상당한 감소는 손상되지 않은 (contralateral) hindpaw (P는 <0.01 반복 측정 2로 비교할 hindpaw입니다 방향 ANOVA). 데이터는 뜻 보여주 ± SEM, n은 = 7 Wistar의 쥐.

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Discussion

CCI는 만성 neuropathic 고통의 널리 사용되는 말초 신경 손상 모델입니다. 그것은 수행 비교적 간단하고, 부상 후 최소 한 달 동안 강력하고 안정적​​인 통증 과민성을 생산하고 있습니다. CCI 따라 쥐가 부상 hindpaw (발가락이 함께 개최되어 발바닥 - 근육이 수축과 앞발로 땅을 차다는 everted)뿐만 아니라, 흔들림 지키고 자발적인 고통 9 존재를 암시 부상 hindpaw으로 핥아 반복 비정상적인 자세를 나타냅니다. 감각 장애 외에도 여러 조사관은 CCI와 같은 교란 사회적 상호 작용, 수면 방해, 우울증 같은과 행동 10-13 불안과 같은과 같은 행동 장애를, 끝,을 보였습니다하지만이 같은 행동 장애를 찾기 위해 실패에 대한 대비입니다 다른 14,15 의해. CCI 따라서 일반적으로 pathophysiology 및 neuropathic 고통의 치료를위한 잠재적인 치료 대리인을 모두 조사하는 데 사용됩니다.

우리는 descr왼쪽 좌골 신경의 일방적 조이는 ibe 그러나 그것은 많은 경험과 유사한 통증과 행동 결과로, 오른쪽 좌골 신경에 CCI를 수행한 것을인지해야합니다. 일부 수사관들이 쉽게 handedness로 인해 특정 측면에 수술을 찾을 수 있습니다, 반면 다른 사람은 어떤 편견을 배제하기 위해 실험 이내시켜야했습니다. 그것은 원래의 프로 시저에 대한 몇 가지 변화가 신경 16,17 주위에 단 2 ligatures을 사용하는 등 쥐에서 일반 창자와 polyglactin (vicryl) 18,19 등 삼가의 크롬을 함유하는 배 이외의 봉합 재료를 사용하여 포함해 보고한 것으로 주목할만한 것입니다. 절차는 삼가의 크롬을 함유하는 제품 창자, 나일론, 그리고 prolene 15,20,21 등 다양한 봉합 재료와 2-3 ligatures의 사용을 제외하고 동일 어디 또한, CCI 모델 또한, 마우스에 사용하기 위해 수정되었습니다.

이 모델 중 하나는 제한이 variabili에 의한 CCI 들어서는 쥐 사이의 유사 정도입니다봉합을 함께 묶는 매듭 제작한 constrictions의 죄어져 있음에 티. 이것은 부분적으로 경험 연구자가 일관된 방식으로 수술을 수행함으로써 극복할 수 있습니다. 또한 신경을 ligating 사용 봉합 재료의 종류도 변화에 기여할 수 있고, 그것은 삼가의 크롬을 함유하는 제품 뱃속에서 화학 물질이이 모델 19,22에서 관찰 행동 및 neurochemical 효과의 일부를 중재 것으로 생각됩니다. 특별 고려 사항이 크게 CCI에 따라 통증 과민성의 발전에 영향을 미칠 수 쥐의 성별 (남성 대 여성) 23 세 (젊은이 대 노인) 24,25, 다이어트 26 변형 27의 선택을 부여해야한다.

전자 폰 프라이 aesthesiometer 또는 기계적 인출 한도 및 열 인출 지연을위한 발바닥 진통제 (학스다) m에 대한 수동 폰 프라이의 머리카락을 이용하여 통증 과민성 검사는, 잘 설립하고 다시하고작은 동물의 통증 과민성의 책임을지지 정량 측정. 그들의 사용은, neuropathic 고통의 모델과 결합된, 광범위하고 다양한 치료 옵션에 걸쳐 기계적 및 열 자극에 발자국 감도를 직접 비교를 허용하고, 쥐의 여러 변종 사이. 그것은 같은 핀 녀석 시험과 감기 allodynia 같은 다른 행동 assays는 역시 CCI 유발 통증 과민성 8을 테스트에 사용되는 것을인지해야합니다.

기계적 또는 열적 자극에서 재귀 탈퇴의 사용이 모델과 다른 사람의 neuropathic 고통의 주요 수단이지만, 그것은 최근 인간의 증상과 상당한 실험자 바이어스 28 개입와의 가난한 상관 관계에 대해 비판했습니다. 따라서, 그러한 고통 29 operant 대책 및 자발적 배출 행위 30 다른 패러다임의 사용은 도움이 될 것입니다.

그럼에도 불구하고, 데스이러한 한계를 pite, CCI 모델과 측정 통증 과민성에 대한 발자국 탈퇴 테스트 neuropathic 고통의 메커니즘을 이해하고 새로운 진통제 대상을 식별하는 데 필수적입니다. 저희 연구실에서는 정기적으로 상호 작용 neuropathic 고통 31에 기여할 방법을 신경 면역 이해하고, 통증 과민성을 줄이기위한 modulating 면역 체계의 잠재력을 평가하기 위해, CCI을 수행하고 기계의 발자국 탈퇴 임계값 및 열 발자국 탈퇴 대기 시간을 측정합니다.

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Disclosures

동물 실험은 뉴 사우스 웨일즈, 오스트 레일 리아 대학의 동물 관리 및 윤리위원회의 승인을, 그리고 비탄의 연구를위한 국제 교류 협회에서 발행한 지침을 따라했다.

Acknowledgements

저자는 베넷과 샤오 (1988)에 의해 CCI 모델의 원래 설명을 인정하고 싶습니다.

이 작품은 과학 그리니치 표준시에 의학 연구를위한 국민 건강과 호주의 의료 연구 협의회 (ID # 568637)과 뉴사우스 웨일즈 사무소에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chromic gut Ethicon Inc. G-211 4-0 thickness
Isoflurane Delvet Pty. Ltd., Seven Hills, NSW n/a
Mersilk Ethicon Inc. W-580 5-0 thickness
Autoclip BD Biosciences 427631 9 mm stainless steel
Riodine Orion R1000802F 1% w/v iodine
Thermal plantar analgesia instrument Ugo Basile 37370
Dynamic plantar aesthesiometer Ugo Basile 37400

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References

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Comments

7 Comments

  1. hello sir.

    Sir/Madam,

    I am Deepika Saini from chandigarh, and i m pursuing my Masters in Pharmacy (Pharmacology) from chandigarh college of pharmacy,landran,mohali,punjab (India). As my ²nd year research project i got a topic COMBINED EFFECTS OF NSAIDs AND PKC INHIBITORS IN TREATMENT OF SCIATIC NERVE LIGATION INDUCED NEUROPATHIC PAIN , so i need the procedure for sciatic nerve ligation. Please help me regarding this , i will be really very thankful to you.

    Yours Sincerely,
    Deepika Saini

    Reply
    Posted by: Deepika S.
    June 22, 2012 - 5:34 AM
  2. Dear Deepika,
    The detailed procedure is described in the PDF of the article.
    Gila

    Reply
    Posted by: Gila M.
    June 22, 2012 - 5:28 PM
  3. Hello Gila,

    Can you please email me the full text of the article by Bennett and Xie, 1988, i.e. "A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man." I need it for my thesis work. My email id is deepi.8dec@gmail.com. I shall be highly obliged.

    Deepika Saini.

    Reply
    Posted by: Deepika S.
    January 22, 2013 - 10:55 AM
  4. Hello Paul, Ann and Gila,
    I am writing to you from the University of Sydney Library, I am hoping you might be able to supply me a copy of your article? Many thanks,
    Michele

    Reply
    Posted by: Michele P.
    February 25, 2013 - 4:39 PM
  5. Dear Deepika,

    The detailed procedure is described in the video

    Reply
    Posted by: kang hoon k.
    March 27, 2013 - 2:21 AM
  6. respected sir,
    pls provide me the link for observing Chronic Constriction of the Sciatic Nerve and Pain Hypersensitivity Testing in Rats to my email prashanthkomirishetti@gmail.com

    Reply
    Posted by: prashanth k.
    April 8, 2013 - 6:43 AM
  7. Dear sir,
    I want to research the neuropathic pain in CCI model about MWT and PWL,so I want you can provide me the video to study the details of the research process.my email 244823865@qq.com. Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Gao j.
    December 31, 2013 - 12:48 AM

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