Constrição crônica do nervo ciático e Teste de Hipersensibilidade dor em ratos

Medicine

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Summary

Devido à simplicidade da cirurgia e os resultados robusto comportamental, constrição crónica do nervo ciático é um dos modelos pré-eminentes animais de dor neuropática. Dentro de 24 horas após a cirurgia, hipersensibilidade à dor é estabelecido e pode ser medida quantitativamente utilizando um von Frey aesthesiometer (teste mecânico) e medidor de analgesia plantar (teste térmico).

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Austin, P. J., Wu, A., Moalem-Taylor, G. Chronic Constriction of the Sciatic Nerve and Pain Hypersensitivity Testing in Rats. J. Vis. Exp. (61), e3393, doi:10.3791/3393 (2012).

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Abstract

Dor neuropática crônica, resultante de danos ao sistema nervoso central ou periférico, é uma condição prevalente e incapacitante, afetando 7-18% da população 1,2. Os sintomas incluem dor (queimação, formigamento, choque elétrico como) espontânea, disestesia, parestesia, alodinia (dor resultante de normalmente não dolorosos estímulos) e hiperalgesia (um aumento de resposta a estímulos dolorosos). Os sintomas sensoriais são co-mórbidas com deficiências comportamentais, tais como insônia e depressão. Para estudar a dor neuropática crónica vários modelos animais que imitam a lesão do nervo periférico têm sido desenvolvidos, um dos mais amplamente utilizado é Bennett e (1988) unilateral de Xie lesão do nervo ciático constrição crónica (ICC) 3 (Figura 1). Aqui apresentamos um método para executar ICC e teste de hipersensibilidade a dor.

ICC é realizada sob anestesia, com o nervo ciático de um lado exposto fazendo comoincisão parentes, e cortando o tecido conjuntivo entre as superficial glúteos e bíceps femoral. Quatro ligaduras intestino crômico são amarrados frouxamente ao redor do nervo ciático em intervalos de 1 mm, apenas para ocluir, mas não deter o fluxo de sangue epineural. A ferida é fechada com suturas no músculo e grampos na pele. O animal é então permitido recuperar da cirurgia durante 24 horas antes do teste de hipersensibilidade dor começa.

Para os testes comportamentais, os ratos são colocados no dispositivo de ensaio e são permitidos para habituar o procedimento de teste. A área de teste é a superfície mid-plantar da pata posterior (Figura 2), que cai dentro da distribuição do nervo ciático. Limiar de retirada mecânica é avaliado por ambas as patas traseiras mecanicamente estimulando lesadas e usando um eletrônico dinâmico plantar von Frey aesthesiometer ou manual von Frey cabelos 4. O limiar de retirada mecânica é a pressão máxima exercida(Em gramas) que desencadeia retirada da pata. Para a medição da latência de retirada térmica, primeiro descrito por Hargreaves et ai (1988), a pata posterior é exposta a um feixe de calor radiante através de uma superfície de vidro transparente com um medidor de analgesia plantar 5,6. A latência de retirada ao estímulo de calor é registrado como o tempo para retirada da pata nas duas patas traseiras lesadas e não lesadas. ICC sequência, limiar de retirada mecânica, bem como a latência de retirada térmica na pata lesada são ambos significativamente reduzido, em comparação com as medições de linha de base e da pata não lesionado (Figura 3). O modelo ICC de lesão do nervo periférico combinados com testes de hipersensibilidade à dor fornece um sistema modelo para investigar a eficácia de agentes terapêuticos potenciais para modificar a dor neuropática crônica. No nosso laboratório, nós utilizamos ICC ao lado de sensibilidade térmica e mecânica das patas traseiras para investigar o papel das interacções neuro-imunes na patogénesee tratamento da dor neuropática.

Protocol

1. Constrição do nervo ciático crônica

Técnicas assépticas deve ser utilizado para o procedimento cirúrgico. Desinfectar a superfície de trabalho cirúrgico com etanol a 70% e em preparar Advance Instruments estéril (por exemplo, tesouras finas, fórceps e afastador), gazes, grampos e esfregaços por autoclavagem. Para cirurgias múltiplas, limpar e instrumentos reesterilizar com etanol a 70% ou um esterilizador seco grânulo entre ratos. Uma máscara cirúrgica, gorro cabelo e luvas estéreis devem ser usadas.

Para constrição do nervo, preparar a sutura intestino crómico cortando-o em pequenos pedaços de cerca de 3 cm de comprimento imersos em solução salina estéril, para evitar a secagem. Para fechar a ferida, usar comercialmente disponíveis suturas de seda estéreis.

  1. Anestesiar o rato em uma câmara de indução usando 5% de isoflurano em O 2, em seguida, entregar 2% de isoflurano em O 2 através de uma máscara facial feitos, e monitorar o animal anestesiado durante o procedimento. Anestésicos comuns alternativos são inalados halotano ou pentobarbital sódico intraperitoneal. A cetamina, como um antagonista do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA), deve ser evitado uma vez que estes receptores são importantes no desenvolvimento de dor neuropática.
  2. Raspar a pata traseira esquerda do rato. Em seguida, coloca o animal sobre uma esteira de aquecimento termo-regulada a 37 ° C e aplicar pomada oftálmica lubrificante para os olhos.
  3. Esterilizar a área rapada com três aplicações alternadas de 70% de álcool isopropílico e uma solução de iodo.
  4. Com o rato deitado no seu peito / tórax, elevar a perna esquerda e segure na posição com o Femor a 90 ° para a coluna usando fita adesiva no pé.
  5. Fazer uma incisão na pele paralelamente, mas 3-4 mm abaixo da Femor, ea pele do livre a partir do músculo circundante da incisão através do corte através do tecido conjuntivo.
  6. Com uma tesoura sem corte, cortam o tecido conjuntivo entre os glúteos superficial e os bícepsfemoris.
  7. Utilize um afastador para alargar o fosso entre os dois músculos, permitindo a visualização clara do nervo ciático.
  8. Usando curvas atraumáticas, fórceps e micro-tesouras, suavemente cerca de 10 mm livre do nervo ciático (proximal à trifurcação ciática) a partir do tecido conjuntivo circundante.
  9. Sob o microscópio e uma boa fonte de luz, amarrá quatro ligaduras (crómico intestino 4,0, Ethicon, EUA) com um nó duplo, 1 mm entre si, proximal à trifurcação do nervo ciático. Para cada ligadura, comece com um único laço solto, segure as duas extremidades perto do loop e apertar até que o loop é apenas um pouco confortável ea ligadura não deslizar ao longo do nervo. Para segurar o lacete na sua posição correcta, colocar uma segunda alça no topo da primeira para completar o nó. Por fim, corte as pontas soltas da ligadura para cerca de 1mm. Constrição do nervo deve ser mínima, e imediatamente interrompido se uma contração breve é ​​observado, para evitar a prisão de the fluxo de sangue epineural. O aperto excessivo das ligaduras leva a axotomia e autotomia (auto-mutilação), ambos os indesejados efeitos colaterais que impedem teste de hipersensibilidade sucesso dor.
  10. Use suturas (Mersilk 5,0, Ethicon) para fechar a camada muscular e grampos (Autoclip, 9 mm) para prender a pele. Em seguida, utilizar solução de iodo (Riodine) para esterilizar a ferida.
  11. Observar o rato intimamente durante o período de recuperação da anestesia, e permitir que ele se recuperar numa gaiola separada com cama de papel plano (não o padrão da cama criação animal), a fim de impedir que o animal inconsciente asfixia.
    Antes de dar qualquer investigadores analgesia pós-operatória deve considerar o fato que pode interferir com o teste de hipersensibilidade à dor. De facto, há evidências de que a aplicação local de anestésico, lidocaína, no momento da lesão pode alterar o desenvolvimento de dor neuropática, e diminuir o grau de hiperalgesia nas semanas anteriores 7. Para mais discussão sobre esse mAtter ver revisão por Bennett et al 8.

2. Medidas de Comportamentos Dor

  1. Manipulação diária de ratos durante vários dias antes do início do experimento é recomendado para acostumar os animais ao seu manipulador, reduzir o estresse eo risco de morder.
  2. Antes dos testes comportamentais, os ratos têm de ser habituados ao procedimento de teste e do invólucro animal. O ambiente de teste deve ser mantido calmo e bem controlado, com temperatura constante e os níveis de umidade e realizado em um tempo similar de dias de cada sessão de teste.
  3. Teste de hipersensibilidade a dor deve ser realizada várias vezes antes de ICC (linha de base) e em pontos de tempo diferentes após ICC, como desejado.

3. Limiar de retirada mecânica

  1. No dia do teste, os ratos colocá-las no elevada gaiola de testes de malha floored 15-30 minutos antes de medir limiares de retirada, permitindo gaiola de exploração e Grooatividades ming para cessar e ratos para tornar-se relaxado e parado.
  2. Usando uma dinâmica plantar von Frey aesthesiometer (Ugo Basile, Itália), a posição da unidade de contato estimulador com o filamento diretamente abaixo da superfície meados de plantar da pata traseira, evitando a malha de metal, e pressione a tecla start. Este levanta o filamento para mecanicamente estimular a superfície plantar da pata posterior do com uma força crescente.

Cabelos de von Frey manuais são uma série de filamentos aumentando de diâmetro que são calibrados para induzir uma força específica quando aplicado à pele. Eles podem ser utilizados como uma alternativa para uma electrónica plantar von Frey dinâmica aesthesiometer para a medição de limiar de retirada da pata, como descrito anteriormente 4. Existem também vários fabricantes alternativos de von Frey eletrônico aesthesiometers (por exemplo IITC, EUA e Somedic, Suécia).

  1. Registre o limiar de retirada mecânica de hindpa tanto lesadas ews, em ordem contrabalanceada. Este dispositivo aplica-se pressão para a pata e após reacção de retirada o sistema automaticamente grava e exibe a força máxima aplicada (em gramas). Se uma resposta ambígua ocorre (isto é, no caso de deambulação ou preparação), repetir o estímulo e gravar o limiar de novo. Lamber ou agitação da estimulação seguinte pata é um sinal de comportamento associadas à dor.
  2. Repita a estimulação mecânica 3 vezes com um intervalo de cerca de 5 min entre os estímulos, registrar os limiares, e depois calcular a média dos limiares de retirada da pata.

4. Latência Retirada térmica

A intensidade de calor de infravermelhos (IR) do instrumento de teste plantar deve ser ajustado antes de iniciar a experiência. Em nosso laboratório, nós ajustar a intensidade IR para dar uma latência média de abandono pata de cerca de 10 segundos em ratos ingênuos, e vamos definir a latência de corte, 20 segundos para evitar danos tecidoidade em caso de falha para remover uma pata.

  1. No dia do teste, os ratos lugar no interior da gaiola de testes de vidro com piso de 15-30 minutos antes de medir a latência, permitindo a exploração gaiola e tosa actividades de cessar e ratos para se tornar relaxado e estacionários.
  2. Usando um instrumento de analgesia térmica plantar (Ugo Basile, Itália), a posição da fonte de infravermelho diretamente abaixo da superfície meados de plantar da pata traseira, e pressione a tecla start. Isto expõe a superfície plantar da pata posterior do a um feixe de calor radiante através de uma superfície de vidro transparente. Há também fabricantes alternativos de térmicas instrumentos de analgesia plantar (por exemplo, IITC, EUA e Stoelting, EUA).
  3. Registre a latência de retirada de patas traseiras tanto lesadas e não lesadas, em ordem contrabalanceada. Este dispositivo regista automaticamente o tempo decorrido (em segundos) a partir do início do estímulo térmico para a retirada da pata da fonte de calor. Se uma resposta ambígua ocorre (isto é, no caso de ambulação ou grooming), repita o estímulo e gravar a latência novamente. Lamber ou agitação da estimulação seguinte pata é um sinal de comportamento associadas à dor.
  4. Repita a estimulação de calor, pelo menos, 3 vezes com um intervalo de cerca de 5 min entre estímulos, gravar as latências e, em seguida o cálculo da média das latências de retirada da pata.

4. Os resultados representativos

Um exemplo de limiar de retirada mecânica e latência de retirada térmica nas patas ipsilateral (lesionado) e contralateral (não lesionado) de ratos Wistar é mostrado antes (linha de base) e 2-12 dias após ICC na Figura 3A, e Figura 3B. A partir destes dados pode ser visto que a CCI, provoca uma redução significativa em ambos os limiares de retirada mecânicas e as latências de retirada térmicas da pata posterior ipsilateral, indicando a presença de hipersensibilidade dor mecânica e térmica, ambas as características de dor neuropática crónica .

A Figura 1
Figura 1. Um esquemático que ilustra o posicionamento das ligaduras no modelo de ICC. Este modelo animal de dor neuropática envolve a colocação de quatro soltas crômico intestino-ligaduras sobre o nervo ciático, no meio da coxa nível. Isso resulta em ferindo apenas uma porção das fibras aferentes que vão para o hipersensibilidade dor no pé e subsequente da pata posterior.

A Figura 2
Figura 2. Diagrama da área pata posterior utilizado para testes de dor. A superfície meados de plantar apenas posterior para as patas, como indicado pelo círculo vermelho pontilhado, é utilizado para testes de dor. Esta área é inervada principalmente pelos ramos terminais do nervo ciático. O calcanhar e patas devem ser evitados devido à sensibilidade da pele diferencial.

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Figura hipersensibilidade Dor 3. Após constrição crônica do nervo ciático em ratos. Depois de ICC, há uma redução significativa no limiar de retirada da pata a estímulos mecânicos (A) e latência de retirada da pata a estímulos térmicos (B) na ferida (ipsilateral) pata posterior comparação com o não lesionado (contralateral) pata posterior (P <0,01 medidas repetidas 2 -way ANOVA). Os dados mostram média ± EPM, n = 7 ratos Wistar.

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Discussion

CCI é amplamente utilizado modelo de lesão de nervo periférico da dor neuropática crônica. É relativamente simples de executar, e produz hipersensibilidade dor robusta e estável durante pelo menos um mês após a lesão. Após CCI, os ratos apresentam postura anormal da pata ferida (dedos unidos e plantar-flexionados e pata evertido), bem como repetidos tremores, guarda e lambendo da pata ferida sugerindo a presença de dor espontânea 9. Além disso a disfunção sensorial, vários investigadores demonstraram que evoca ICC deficiência comportamentais, tais como rompidas interacções sociais, distúrbios do sono, depressão e ansiedade-like-like comportamentos 10-13, no entanto, este está em contraste com a falta de encontrar tais deficiência comportamentais por outros 14,15. ICC é, por conseguinte, normalmente usado para investigar tanto a patofisiologia, e agentes terapêuticos potenciais para o tratamento da dor neuropática.

Nós descrIBE constrição unilateral do nervo ciático esquerdo, no entanto, deve notar-se que muitos experimentadores ter realizado ICC sobre o nervo ciático direito, com dor semelhante e os resultados comportamentais. Alguns pesquisadores podem achar mais fácil para realizar a cirurgia em um lado específico devido a lateralidade, enquanto outros mudaram de lados dentro de experimentos para afastar qualquer viés. É de notar que várias variações para o procedimento original foram relatados incluindo o uso de apenas 2 ligaduras em torno do nervo 16,17 e utilizando material de sutura com excepção do intestino crómico, tais como intestino simples e poliglactina (Vicryl) 18,19, em ratos. Além disso, o modelo de ICC também foi modificada para utilização em ratinhos, em que o procedimento é idêntico, excepto para o uso de 2-3 ligaduras com vários materiais de sutura, incluindo intestino crómico, nylon, e prolene 15,20,21.

Uma limitação deste modelo é o grau de variação entre os ratos submetidos a ICC, devido à variability, no aperto das constrições produzidas por amarrar laços com as suturas. Isto pode ser parcialmente superada por ter um investigador experiente realizar a cirurgia de uma forma consistente. Além disso, o tipo de material de sutura utilizado para ligação do nervo pode também contribuir para a variabilidade, e acredita-se que os produtos químicos a partir do intestino crómico mediar alguns dos efeitos comportamentais e neuroquímicas observadas neste modelo 19,22. Uma consideração especial deve ser dada à escolha do gênero de rato (homens vs mulheres) 23, idade (jovens contra velhos) 24,25, dieta 26 e cepa 27, que pode influenciar significativamente o desenvolvimento de uma hipersensibilidade dor após a CCI.

Testes de dor de hipersensibilidade, usando uma electrónica de von Frey aesthesiometer ou os cabelos de von Frey manuais para limiar de retirada mecânica e uma plantar analgesia metros (Hargreaves) para a latência de retirada térmica, estão bem estabelecidos e resusceptíveis medidas quantitativas de hipersensibilidade à dor em pequenos animais. A sua utilização, em combinação com modelos de dor neuropática, são difundidas e permitir comparações directas de sensibilidade da pata a estímulos mecânicos e térmicos que as opções de tratamento diferentes, e entre as diferentes estirpes de ratos. Deve notar-se que outros ensaios comportamentais, tais como o teste de picada de agulha e alodinia frio, são também utilizados para testar ICC dor induzida por hipersensibilidade 8.

Embora o uso de retirada reflexiva a partir de estímulos mecânicos ou térmicos é a principal medida da dor neuropática neste modelo e outros, foi recentemente criticado por sua baixa correlação com os sintomas humanos eo envolvimento de preconceito de experimentador considerável 28. Portanto, a utilização de paradigmas adicionais, tais como medidas operante da dor 29 e os comportamentos espontaneamente emitidos 30 seria benéfica.

No entanto, despite essas limitações, o modelo de CCI e os testes de retirada da pata de hipersensibilidade a dor de medição são fundamentais para a compreensão dos mecanismos da dor neuropática e identificação de novos alvos analgésicos. Em nosso laboratório, nós rotineiramente ICC e medir os limiares das patas mecânicas de abstinência e latências de retirada térmicas da pata, a fim de compreender como neuro-imune interações contribuem para a dor neuropática 31, e avaliar o potencial de modulando o sistema imunológico para reduzir a hipersensibilidade à dor.

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Disclosures

Experimentos com animais foram aprovados pelo Animal Care e Comitê de Ética da Universidade de New South Wales, Austrália, e seguiu as orientações formuladas pela Associação Internacional para o Estudo da Dor.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a descrição original do modelo de CCI por Bennett e Xie (1988).

Este trabalho foi financiado parcialmente por concessões do National Health and Medical Research Council da Austrália (ID # 568637) e do Instituto NSW para a Ciência e Investigação Médica ao GMT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chromic gut Ethicon Inc. G-211 4-0 thickness
Isoflurane Delvet Pty. Ltd., Seven Hills, NSW n/a
Mersilk Ethicon Inc. W-580 5-0 thickness
Autoclip BD Biosciences 427631 9 mm stainless steel
Riodine Orion R1000802F 1% w/v iodine
Thermal plantar analgesia instrument Ugo Basile 37370
Dynamic plantar aesthesiometer Ugo Basile 37400

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References

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Comments

7 Comments

  1. hello sir.

    Sir/Madam,

    I am Deepika Saini from chandigarh, and i m pursuing my Masters in Pharmacy (Pharmacology) from chandigarh college of pharmacy,landran,mohali,punjab (India). As my ²nd year research project i got a topic COMBINED EFFECTS OF NSAIDs AND PKC INHIBITORS IN TREATMENT OF SCIATIC NERVE LIGATION INDUCED NEUROPATHIC PAIN , so i need the procedure for sciatic nerve ligation. Please help me regarding this , i will be really very thankful to you.

    Yours Sincerely,
    Deepika Saini

    Reply
    Posted by: Deepika S.
    June 22, 2012 - 5:34 AM
  2. Dear Deepika,
    The detailed procedure is described in the PDF of the article.
    Gila

    Reply
    Posted by: Gila M.
    June 22, 2012 - 5:28 PM
  3. Hello Gila,

    Can you please email me the full text of the article by Bennett and Xie, 1988, i.e. "A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man." I need it for my thesis work. My email id is deepi.8dec@gmail.com. I shall be highly obliged.

    Deepika Saini.

    Reply
    Posted by: Deepika S.
    January 22, 2013 - 10:55 AM
  4. Hello Paul, Ann and Gila,
    I am writing to you from the University of Sydney Library, I am hoping you might be able to supply me a copy of your article? Many thanks,
    Michele

    Reply
    Posted by: Michele P.
    February 25, 2013 - 4:39 PM
  5. Dear Deepika,

    The detailed procedure is described in the video

    Reply
    Posted by: kang hoon k.
    March 27, 2013 - 2:21 AM
  6. respected sir,
    pls provide me the link for observing Chronic Constriction of the Sciatic Nerve and Pain Hypersensitivity Testing in Rats to my email prashanthkomirishetti@gmail.com

    Reply
    Posted by: prashanth k.
    April 8, 2013 - 6:43 AM
  7. Dear sir,
    I want to research the neuropathic pain in CCI model about MWT and PWL,so I want you can provide me the video to study the details of the research process.my email 244823865@qq.com. Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Gao j.
    December 31, 2013 - 12:48 AM

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