Imaging Neuronal Svar på Slice Varer af Vomeronasal Organ udtryk for en genetisk kodet Calcium Sensor

Published 12/06/2011
3 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Ma, L., Haga-Yamanaka, S., Yu, Q. E., Qiu, Q., Kim, S., Yu, C. R. Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor. J. Vis. Exp. (58), e3404, doi:10.3791/3404 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den vomeronasal organ (VNO) registrerer chemosensory signaler, der bærer information om de sociale, seksuelle og reproduktive status for individer inden for samme art 1,2. Disse intraspecies signaler, feromoner, samt signaler fra nogle rovdyr 3, aktivere vomeronasal sensoriske neuroner (VSNs) med høje niveauer af specificitet og sensitivitet 4. Mindst tre forskellige familier af G-protein koblede receptorer, V1R, V2R og FPR 5-14, er udtrykt i VNO neuroner at mægle påvisning af chemosensory tidskoder. For at forstå hvordan feromon oplysninger er kodet af VNO, er det kritisk at analysere respons profiler af de enkelte VSNs til forskellige stimuli og identificere de specifikke receptorer, der formidler disse svar.

Den neuroepithelia af VNO er ​​indesluttet i et par vomer knogler. Den semi-blind rørformet struktur VNO har en åben ende (vomeronasal kanal) tilslutning tilnæsehulen. VSNs udvide deres dendritter til lumen del af VNO, hvor feromon signaler er i kontakt med de receptorer udtrykt på dendritiske drejeknapper. Cellen organer VSNs formularen pseudo-stratificerede lag med V1R og V2R til udtryk i den apikale og basale lag henholdsvis 6-8. Adskillige teknikker er blevet brugt til at overvåge svar VSNs på sensoriske stimuli 4,12,15-19. Blandt disse teknikker tilbyder akut skive forberedelse flere fordele. Først, i forhold til dissocieret VSNs 3,17, slice præparater opretholde neuroner i deres eget morfologi og dendritter af cellerne forbliver relativt intakt. For det andet, cellen organer VSNs er let tilgængelige i koronale bid af VNO at tillade elektrofysiologi undersøgelser og billedbehandling eksperimenter i forhold til hele epitel og hel-mount præparater 12,20. For det tredje kan denne metode kombineres med molekylær kloning teknikker, der giver receptor identifikation.

Sensorisk stimulation udløser stærke Ca 2 + tilstrømning i VSNs, der er betegnende for receptor-aktivering 4,21. Vi dermed udvikle transgene mus, der udtrykker G-CAMP2 i olfaktoriske sensoriske neuroner, herunder VSNs 15,22. Følsomheden og den genetiske karakteren af sonden i høj grad lette Ca 2 + billeddannelse eksperimenter. Denne metode har fjernet farvestoffet loading proces, der anvendes i tidligere undersøgelser 4,21. Vi har også ansat en ligand delivery system, der muliggør anvendelsen af ​​forskellige stimuli til VNO skiver. Kombinationen af ​​de to teknikker giver os mulighed for at overvåge flere neuroner på samme tid som reaktion på et stort antal stimuli. Endelig har vi etableret et semi-automatiseret analyse rørledning til at hjælpe billedbehandling.

Protocol

1. Løsning forberedelse

  1. Forbered 10X R1, R2 10X og 10X R3 løsninger i henhold til tabellen.
    R1
    Kemikalier MW (g / mol) mM (1X) 10X bestand (g / L)
    NaCl 58,44 125 73,05
    KCl 74,55 2,5 1,86
    MgCl 2 1 M lager 1 10 ml
    CaCl 2 · 2H 2 O 147,02 2 2,94
    NaH 2 PO 4 · H 2 O 137,99 1,25 1,72

    R2
    Kemisk MW (g / mol) mM (1X) 10X bestand (g / L)
    NaHCO 3 84,01 25 21

    R3
    Kemikalier MW (g / mol) mM (1X) 10X bestand (g / L)
    NaCl 58,44 125 73,05
    KCl 74,55 2,5 1,86
    MgCl 2 1 M lager 2 20 ml
    CaCl 2 · 2H 2 O 147,02 2 2,94
    HEPES 1 M lager 5 50 ml
  2. Lav 1 liter af mus kunstige cerebrospinalvæsken (mACSF) på dagen af ​​forsøget ved at blande 100 ml 10X R1 og 100 ml 10X R2 med dobbeltdestilleret vand (DDW) og add 1,8 g af dextrose (endelig 10 mm). Denne forberedelse metode forhindrer kalciumkarbonat nedbør ved høje pH-værdi. Osmolaritet mACSF er omkring 310-315 mOsm / L. Juster osmolaritet med dextrose eller vand hvis det er nødvendigt. Luftes løsning med Carboxygen gas (95% ilt og 5% kuldioxid) i mindst 30 minutter før at justere pH-værdien af ​​løsningen på 7,2-7,4.
  3. Lav 1 liter Ringers opløsning på dagen af ​​forsøget ved at blande 100 ml 10X R2 og 100 ml 10X R3 i DDW og tilsæt 1,8 g af dextrose (10 mm). Den osmolaritet og pH af Ringers opløsning bør svare til de af mACSF. Luftes løsning med Carboxygen gas.
  4. Forbered 4% lavt smeltepunkt agarose (LMA) i enten mACSF eller Ringers opløsning. Alikvot det smeltede agarose i Eppendorf rør og opbevares ved 4 ° C indtil brug. LMA, der består af renset polysaccharid, forbliver flydende ved 37 ° C og størkner hurtigt ved temperaturer under 25 ° C. Disse egenskaber gør den ideel til indstøbning VNO og levende væv fysiologi. Andre urene materialer, såsom agar, bør ikke være det foretrukne valg for levende væv eksperiment som uncharacterized komponenter kan forstyrre neuronale respons.
  5. Forbered feromon stimuli i Ringers opløsning. For mus urin, giver 1:100 fortynding anledning til robuste svar.

2. Udarbejdelse af VNO skive

  1. Før ofrer dyret, sætte to rør af LMA på en varmeblok og sæt temperaturen til> 60 ° C for at smelte agarose. Når gelen flydende, overføre rør til en 37 ° C varme blok.
  2. Halshugge en G-CAMP2 mus følgende CO 2 eutanasi. Skær underkæben knogler med en saks for at fjerne underkæben. Skrælle riflede øverste ganen væv for at afsløre næsehulen (Figur 1A). Adskil jawbones ved at indsætte en kirurgisk kniv mellem de to forreste fortænder. Fjern forsigtigt jawbones at eksponere VNO. På dette tidspunkt, kan hele VNO blive løftet op fra nAsal hulrum ved at holde på halen knogle (Figur 1B). Overfør VNO til koldt iltet mACSF løsning straks.
  3. Under dissektion omfang, adskille de to VNOs ved at bruge spidsen af # 5 tænger forsigtigt glide langs væggen i septal knogle (Figur 1C). Skræl væk vomer knoglen at encases VNO væv. Løft forsigtigt hele VNO væv fra knoglerne hulrum. Extreme bør udvises forsigtighed i dette trin ikke at skade neuroepithelium. Små knoglefragmenter tilbage på det væv overfladen skal fjernes helt, inden indlejring. Fragmenter tilbage på væv kan være omfattet af knivene til at trække væv ud af agarose blok.
  4. Brug pincet til at holde den bageste ende af VNO væv og forsigtigt nedsænkes det i den smeltede agarose (Figur 1D). Hurtigt Glasset afkøles på is til at størkne agarose. Den forankring og køling proces bør tage mindre end 2 minutter.
  5. VF300 væv pålægsmaskine (Precisionary Instruments, Greenville, NC) bruges til at lave sektioner. Skær agarose blok indeholder VNO i form og lim det til væv indehaveren (Figur 1E og F). Sæt væv indehaveren i metalcylinder og fylde de resterende kammeret med yderligere LMA. Når LMA størkner på is, videre til sektionering med det samme. Supply koldt iltet mACSF ind i sektionering kammeret og begynde at skære på 180-200 μm tykkelse per skive. Juster de fremrykkende hastighed og vibrationer frekvens, således at vævet ikke er komprimeret under sektionering og VNO ikke falder ud fra agarose. Indsamle og overføre sektioneret skiver til mACSF inkubation kammer (Figur 2A). Skiverne er levedygtige i 6-8 timer i iltet mACSF ved stuetemperatur. Figur 2B og C viser, DIC og 2-foton billeder af en G-CAMP2 VNO skive, hhv.

3. Imaging kammer oprettet

  1. Placer VNO skive i midten af ​​perfusionkammer (Siskiyou, Grants Pass, OR) og hold skive ned med en skive anker (Warner Instruments, Hamden, CT) (figur 3A). Trådene af ankeret skal kun tryk mod LMA del af det udsnit, men ikke VNO væv. Iltet mACSF leveres til perfusion kammeret gennem indløbet på ~ 100 μl / sek og væsken drænes gennem et suge nål via udgangsporten at levere en kontinuerlig strøm af frisk mACSF (Figur 3A og B).
  2. Fyld en 30 ml sprøjte med Ringers opløsning og klemme den på sprøjten pumpen (New Era Pump Systems, Farmingdale, NY). Indstil pumpen hastigheden til 300-600 μl / min til at give en kontinuerlig strøm af Ringers opløsning over slice (figur 3C).
  3. Forbind udgangen fra Ringer til en HPLC injektionssløjfe (Chromtech, Apple Valley, MN) (Figur 3D). Forskellige sløjfe størrelse kan vælges til præcis styring af volumen bliver leveret. Vi bruger en 20 μl loop i Our eksperimenter. Den injektionsloop kontrol har to flow ruter (Figur 3E). Ved "belastning" position, kan prøverne blive indlæst i prøven ring med Hamilton præcision sprøjte. Overskydende prøve afslutter prøve løkken gennem affald stikkontakt. Ringers opløsning indsprøjtes af sprøjtepumpen omfartsveje prøven løkken og går direkte til forretningen, som er forbundet til perfusion spidsen (Figur 3A og E). På "indsprøjtning" position, løber pumpen løsning gennem prøven løkke og skub stimuli i stikkontakten (Figur 3E). Forud for billeddannelse forsøget bør luftbobler blive jaget ud for at sikre en smidig afvikling af perfusionsvæske. Andre kommercielle eller specialfremstillede indsprøjtning systemer kan også gennemføres for stimulus levering.
  4. Juster perfusionen spidsen under et 5x eller 10x objektivet, så spidsen er omkring 1 mm væk fra VNO skive.
  5. Når en ny perfusion system setup, er det tilrådeligt at måle prøven forsinkelse og duration med fluorescerende farvestof. Belastning 0,1% rhodamine 6G farvestof i prøven loop og skifte ventilen at injicere position på 5 sekunder efter start Image Acquisition (Figur 3F). Det fluorescerende signal mellem 10-30 sekunder. Den glatte kurve af fluorescerende signal indikerer også, at der er lidt turbulens skabt under dyppe linsen, og at der er tilstrækkelige perfusion af iltet mACSF når den skive.

4. Time bortfalder billeddannelse

  1. Vi bruger Zeiss AxioSkope FS2 mikroskop med en 10X eller 20X vand-dypning linse til tidsindstilling billeddannelse. Standard GFP båndpasfilter (450-490nm) anvendes til G-CAMP2 signaler. De epifluorescerende Billederne er erhvervet af en CCD-kamera (Zeiss HRM) med 1x1-eller 2x2 binning afhængigt udtryk niveauer af G-CAMP2.
  2. Indstil købet hastigheden til 1 frame per sekund. Juster intensiteten af ​​lyset for at minimere blegning af G-CAMP2 signaler og foto skader på cellerne. For hver exeksperiment, vi normalt får en 60-frame billedstak (~ 60-70 sekunder). Skift ventilen til injektion position på et bestemt tidspunkt (f.eks, 5, andet i Figur 3F) for et sæt af forsøg på at opnå ensartet tidsforskydning i alle forsøg.
  3. Foretag en testkørsel med Ringers opløsning som stimulus. Re-justere perfusionen setup, hvis bevægelsen artefakt er indført under prøve injektion.
  4. Udfør en positiv kontrol køre med musen urin fortyndet på 1:100 i Ringers opløsning. Den typiske maksimale ΔF / F værdien af ​​G-CAMP2 reaktion på musen urin er omkring 20-40%. Hvis det er nødvendigt, kan man bekræfte levedygtighed skive ved at levere 10 mM KCl i Ringers at stimulere skiver i slutningen af ​​forsøgene.
  5. Vask Hamilton sprøjten i Ringers opløsning mindst tre gange, efter at ilægge én stimulus. Vask prøve løkken med Ringers opløsning mindst tre gange mellem forskellige stimuli. Disse skridt undgå krydskontaminering blandt Forskelnt prøver.
  6. Vent for 4-10 min for de VSNs at komme sig, før du anvender den næste stimulus.

5. Dataanalyse

  1. Udfør billede registrering af alle de billeder, erhvervet fra en skive. Vi bruger en brugerdefineret skrevet VBA script i AxioVision (Carl Zeiss, Nordamerika) for at automatisere denne proces. Alle billedkasser inden for samme eksperiment er registrerede mod en fælles valgt referenceramme med elastik registrering (Figur 4A). Elastisk registrering, også kendt som ikke-lineære registrering er en kategori af billedet registrering teknik understreger omdannelsen af ​​en målbilledet ikke-stift til en reference billede. Her brugte vi gennemførelsen af ​​AxioVision.

    Denne referenceramme er valgt vilkårligt fra billedet stakke.
  2. Udfør billede subtraktion at identificere de reagerer cellerne. Vi bruger brugerdefinerede skrevet makroer i ImageJ v1.42 ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ , NIH, Bethesda, MD) for at automatisere denne proces. En minimal fremskrivning billede er genereret for hver stak. Reagere celler opstår efter den minimale projektion trækkes fra den rå stakke (figur 4B).
  3. Identificer region of interest (ROI) fra trækkes stakke og opnå ROI koordinater ved hjælp af Multi-Mål plugin fra ImageJ. Behandle alle stakke til et eksperiment, og gemme alle ROI koordinater på en ROI mester liste (figur 4C).
  4. Brug ROI master listen for at måle celle respons fra rå billede stakke med custom-skrevet makro og Multi-Mål plugin fra ImageJ (figur 4D). Plot respons kurver og Heatmap i Matlab (MathWorks Inc., Natick, MA).

6. Repræsentative resultater

Et eksempel på VNO imaging eksperiment ved hjælp af urinprøver indsamlet fra fire individuelle mus er vist i figur 5. Den skive reagerer på urin stimulation med forskellige patterns af aktivering. Omkring 80 celler er identificeret viser reaktion på mindst én af urinen stimuli og deres reaktion ΔF / F værdier er plottet i Heatmap (Figur 5A). Svaret spor af celler 1, 2 og 3 er plottet i figur 5B viser tiden kurset aktivering af urin stimuli. Celle 1 viser reaktion på både kvindelige urinprøver, men ikke den mandlige prøverne, mens celle 2 viser det modsatte mønster af aktivering og reagerer på både mandlige prøver alene. Celle 3 aktiveres af både mandlige og kvindelige prøver. Celler 1 og 2 viser karakteristiske reaktion på køn specifikke tidskoder i urinen 15.

Figur 1
Figur 1 Skematisk illustration af VNO dissektion proces. A. anatomiske placering af VNO i musen hovedet. Lederen af ​​en G-CAMP2 mus er blevet dissekeret, og lægges på hovedet med den bløde tspørgsmål fjernes fra ganen at eksponere VNO. Inlet viser et fluorescerende billede af det samme billede. Den neuroepithelia af VNO er lyse grønt. B. fra siden den isolerede VNO, der er omsluttet i vomer knogle (øverst) og den fluorescerende billede af samme VNO (nederst). C. En koronal udsigt over VNO og dissektion proces. Et VNO er adskilt fra septum og vomer knoglen kan derefter fjernes for at vikle den neuroepithelium. D. VNO er indlejret i LMA. E. indlejrede blok er limet til vævet holder til sektionering. Vævet indehaveren er fremskreden på 180-200 μm per skive skubbe agarose blokken ud af metal tønde til sektionering. Den skærende klinge er placeret tæt på metal tønde. F. Side udsigt over VF300 væv pålægsmaskine system. BV, blodkar. NE, neuroepithelium.

Figur 2
A. VNO skiver fastholdes i iltet mACSF ved stuetemperatur. B. En DIC billede af VNO skive. C. En 2-foton billede af VNO fra G-CAMP2 mus. Skala bar, 50 μm.

Figur 3
Figur 3 Illustration af perfusion systemopsætning. A. En typisk perfusion kammer med ind-og udløb. VNO skive er placeret i midten af ​​kammeret og presses ned med en serviet anker. Den midterste tråde fjernes fra vævet anker, så VNO væv er ikke trykket ned. B. perfusion kammeret er placeret på mikroskop scenen under dyppe mål. Den mACSF indløb, suge-afgang og perfusion spidsen er angivet. C. Den fælles tønde sprøjtepumpe giver kontinuerlig strøm af Ringers gennem perfusion spidsen. D. HPLC injeIndsatsen loop system er vedtaget til praktisk stimulus prøve lastning og injektion. E. Skematisk illustration af flowet retninger ved pålæsning og injektion positioner. Ringers, grøn. Stimulus prøve, magenta. Pile angiver flowretningen. F. Delay og vaske tid måling af perfusion systemet. Rhodamine 6G fluorescerende farvestof er lastet til prøven løkke og ventilen er skiftet til injektion position ved 5th sekund, hvilket er indikeret med en pil. Den fluorescerende signal ændring er påvist mellem 10-30 sekunder og mindskes bagefter.

Figur 4
Figur 4 Billedbehandling pipeline. A. Alle billedkasser for én skive er registrerede mod en referenceramme. B. Subtraktion af minimal fremskrivning af en stak fra sine rå frames. Reagerer cellerne bliver fremtrædende efter fradrag. C. ROIS er udvalgt og deres koordinater er opgjort i standardaftaler listen. D. Måling af reagere celler ved hjælp af ROI mester liste fra rå stakken.

Figur 5
Figur 5 Et repræsentativt G-CAMP2 VNO billeddannelse eksperiment. A. ΔF / F reaktion Heatmap fra en skive stimuleret med individuelle mandlige og kvindelige urin. Urinprøver er indsamlet fra individuelle mandlige og kvindelige mus. X-aksen, svarer celler identificeret fra den skive. Y-aksen, urinprøver brugt i eksperimentet. Color bar viser ΔF / F-værdi. B. Svartid løbet af 3 repræsentative felter markeret med A. Pile angiver tidspunktet for stimulus ansøgning. F-FVB, kvindelige FVB; F-CBA, kvindelige CBA, M-FVB, mandlige FVB; M-BL6, mandlige C57BL / 6.

Tabel over specifikke reagenser og udstyr:

Navn påreagens Firma Katalog nummer Kommentarer (valgfri)
perfusion kammer Siskiyou PC-H vandret
skive hold-down Warner Instrumenter SHD-22CL
perfusion port holder ALA videnskabelige, Inc. MPIOH-S
sprøjtepumpe New Era Pump Systems, Inc. NE-300
lavtryk indsprøjtningsventil Chromtech V-451
PEEK slange Chromtech 1531 1 / 16 "OD, 0,25 mm ID
PEEK prøve loop Chromtech 1803 20 μL
Hamilton sprøjte Chromtech 80630 100 μL

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

References

  1. Birch, M. C. Pheromones. North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).
  2. Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. Cambridge University Press. (2003).
  3. Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141, 692-703 (2010).
  4. Leinders-Zufall, T. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
  5. Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83, 195-206 (1995).
  6. Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90, 763-773 (1997).
  7. Matsunami, H., Buck, L. B. A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals. Cell. 90, 775-784 (1997).
  8. Ryba, N. J., Tirindelli, R. A new multigene family of putative pheromone receptors. Neuron. 19, 371-379 (1997).
  9. Pantages, E., Dulac, C. A novel family of candidate pheromone receptors in mammals. Neuron. 28, 835-845 (2000).
  10. Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies. Genomics. 83, 802-811 (2004).
  11. Liberles, S. D. Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).
  12. Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
  13. Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats. Genomics. 86, 306-315 (2005).
  14. Rodriguez, I., Punta, D. el, Rothman, K., Ishii, A., T,, Mombaerts, P. Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors. Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).
  15. He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ. Science. 320, 535-538 (2008).
  16. Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli. Science. 289, 1569-1572 (2000).
  17. Chamero, P. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450, 899-902 (2007).
  18. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
  19. Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437, 898-901 (2005).
  20. Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
  21. Leinders-Zufall, T. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306, 1033-1037 (2004).
  22. He, J. Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).
  23. Haga, S. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466, 118-122 (2010).
  24. Boschat, C. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).
  25. Hendel, T. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in. 28, 7399-7411 (2008).
  26. Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators. J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).
  27. Jayaraman, V., Laurent, G. Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies. Front Neural Circuits. 1, (3), (2007).
  28. Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).

Comments

3 Comments

  1. Dear Minghong,
    How is it possible to see your video?

    Reply
    Posted by: Patricia D.
    January 14, 2014 - 5:20 AM
  2. Dear Minghong,
    How is it possible to see your video?

    Reply
    Posted by: Patricia D.
    January 14, 2014 - 5:35 AM
  3. please email cry@stowers.org for a copy.

    Reply
    Posted by: Limei M.
    January 14, 2014 - 12:00 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats