مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Biology
 

Summary

مدى متجر يعمل على الكالسيوم

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Pan, Z., Zhao, X., Brotto, M. Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber. J. Vis. Exp. (60), e3415, doi:10.3791/3415 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

مخزن تعمل كا 2 + دخول (SOCE)، ووصف في وقت سابق capacitative كا 2 + دخول، هي آلية تنظيم محكم لتدفق الكالسيوم خارج الخلية 2 + في الخلايا لتجديد الشبكة الإندوبلازمية المنضب (ER) أو شبكية الهيولى العضلية (ريال) كا 2 + مخازن 1،2. منذ الكالسيوم 2 + هو رسول في كل مكان الثانية، فإنه ليس من المستغرب أن نرى أن SOCE يلعب دورا هاما في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية، بما في ذلك، وانتشار الخلايا النسخ الجيني، والحركة. بسبب وقوعها واسعة في أنواع خلية تقريبا كل شيء، بما في ذلك الخلايا الظهارية وعضلات الهيكل العظمي، وتلقى هذا المسار اهتماما كبيرا 3،4. ومع ذلك، فإن عدم تجانس الخصائص SOCE في أنواع مختلفة من الخلايا وظيفة فسيولوجية لا يزال غير واضح 5-7.

ويمكن الكشف عن الخصائص الفنية للقناة SOCE من قبل التصحيح، المشبك دراسات، في حين أن مجموعة كبيرة من المعارف حول ثيوقد اكتسبت ق مسار مضان من قبل القائم على الخلايا القياسات الكالسيوم + 2 بسبب الراحة وجدوى عالية الإنتاجية الفرز. والهدف من هذا التقرير هو تلخيص بعض مضان المستندة إلى أساليب لقياس تفعيل SOCE في الخلايا أحادي الطبقة، مع وقف التنفيذ وخلايا الألياف العضلية 5،8-10. الأكثر شيوعا من هذه الأساليب الاستشعاع لمراقبة مباشرة ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا 2 باستخدام نسبة F 340nm 380nm و F (510 نانومتر الطول الموجي للانبعاث) من الكالسيوم ratiometric 2 + مؤشر Fura-2 +. لعزل نشاط SOCE أحادي الاتجاه من داخل الخلايا كاليفورنيا الافراج + 2 والكالسيوم 2 + قذف، ويستخدم بشكل متكرر تبريد المنغنيز + 2 الفحص. ومن المعروف MN 2 + لتكون قادرة على تتغلغل في الخلايا عن طريق SOCE بينما هو منيع لعمليات قذف سطح غشاء أو لامتصاص الكالسيوم من ER 2 + مضخات بسبب خفة دم لها قابلية عالية جداح Fura-2. ونتيجة لذلك، والتبريد من مضان-2 Fura الناجم عن دخول المنغنيز 2 + خارج الخلية إلى خلايا يمثل قياس نشاط SOCE 9. لا يمكن أن يؤديها قياس Ratiometric والمقايسات المنغنيز تبريد +2 على مقياس التألق الطيفي كفيت مقرها في زنزانة وضع السكان أو في نظام المجهر القائم على تصور خلايا مفردة. في الاستفادة من القياسات خلية واحدة هي التي يمكن اختيارها الخلايا الفردية التعرض للتلاعب الجيني باستخدام GFP أو طلب تقديم العروض للصحفيين، مما يسمح للدراسات في الخلايا المعدلة وراثيا أو تحور. لا يمكن أن يتحقق الخصائص المكانية من SOCE في الهيكل العظمي والعضلات الهيكلية المتخصصة في ألياف العضلات البشرة من خلال رصد في وقت واحد من اثنين من مضان الكالسيوم منخفضة تقارب 2 + المؤشرات المستهدفة لمقصورات معين من الألياف العضلية، مثل Fluo-5N في ريال وRhod- 5N في الأنابيب عرضية 9،11،12.

Protocol

1. بين الخلايا كا 2 + قياس الخلايا الفردية

  1. KYSE-150، من حقوق الإنسان الخلايا الحرشفية سرطان المريء (ECSS) وزرعها في خلية خط 5٪ CO 2 في الجو 37 درجة مئوية في مختلط RPMI 1640/Ham الصورة متوسطة 12 F (1:1) التي تحتوي على نسبة 5٪ من مصل بقري جنيني.
  2. وtransfected KYSE-150 الخلايا مع البلازميدات إما تحتوي على shRNA تحديدا ضد Orai1 أو تسلسل تدافعت. والبلازميدات وشملت أيضا الجين ببروتين يضيء بضوء أحمر الترميز (RFP) كمراسلة، والتي يقودها أحد المروجين منفصلة.
  3. وتزرع هذه الخلايا في أسفل الزجاج أطباق (زجاج رقم غطاء 1.5، ماتيك، MA) لمدة 48 ساعة.
  4. إزالة المتوسطة وشطف الخلايا مع محلول ملحي متوازن (BSS) (140 ملم كلوريد الصوديوم، و 2.8 ملي بوكل، 2 مم CaCl 2 مم MgCl HEPES 10 ملم، ودرجة الحموضة 7.2).
  5. إضافة 1 مل من محلول BSS يحتوي على 2 ميكرومتر Fura-2 استر acetoxymethyl (المسابر الجزيئية) في طبق والتفاف طبق كامل مع احباط إلى المتواجدط م بعيدا عن الضوء.
  6. احتضان الخلايا لمدة 40 دقيقة في 37 درجة مئوية، ثم تركها لفترة إضافية 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح أن يتم الانتهاء المائي استر. غسل الخلايا مع BSS مرتين.
  7. تركيب طبق على مرحلة مجهر TE200 نيكون مقلوب، وهذا مرتبط إلى مقياس التألق الطيفي برس تراست أوف إنديا، مع موجات الإثارة في 350 و 390 نانومتر، والانبعاثات في 510 نانومتر. يمكن للموجات الإثارة الدقيق لاستخدامها تختلف قليلا تبعا للبصريات من كل نظام على حدة. ويتم تحديد موجات مع اثنين من أفضل نسبة ديناميكية من قبل طيف من الإثارة مسح Fura-2 الملح في الحلول التي تحتوي على الكالسيوم 2 + تتراوح 0-39،8 ميكرومتر (أو أعلى تركيز على الذي مشبعة Fura-2 مضان).
  8. اقامة نظام نضح خطورة مع 4 حلولا مختلفة في BSS: كا 2 + (2 مم)، EGTA (0.5 ملم)، EGTA-TG (thapsigargin، 5 ميكرون)، كاليفورنيا 2 +-2-APB (أ المانع SOCE، 75 ميكرومتر). الكمبيوتر التي تسيطر عليها الآلي perfusiويمكن أيضا أن تستخدم في أنظمة.
  9. حدد الخلايا معربا عن طلب تقديم العروض في وضع التصور.
  10. وضع طرف افتتاح نظام نضح في التكبير 10x حتى غيض هو الحق فوق المنطقة ذات الاهتمام بزاوية 45 درجة.
  11. في وقت واحد تسجيل الاشارات مضان F 350nm 390nm و F. يتم عرض نسبة (F 350nm / F 390nm) في النافذة الثالثة. تغيير الحلول نضح في الترتيب التالي: كا 2 +؛ EGTA؛ كا 2 +؛ EGTA-TG، كا 2 +، كا 2 +-2-APB.

يمكن تعديل بروتوكول أعلاه لقياس الكالسيوم داخل الخلايا 2 + في نظام التعليق الخلية.

  1. ثقافة KYSE-150 الخلايا في قارورة T25 مع حالة الثقافة نفسها على النحو الوارد أعلاه.
  2. عندما تصل إلى نقطة التقاء الخلايا 90٪، وإزالة المتوسطة وشطف الخلايا مع حل BSS.
  3. إضافة 2.5 مل من محلول BSS يحتوي على 2 ميكرومتر Fura-2 صباحا واحتضانهذه الخلايا لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية ثم بواسطة deesterification.
  4. إزالة BSS، إضافة 2.5 مل التربسين في قارورة واحتضانها عند 37 درجة مئوية حتى فصل الخلايا. ثم يضاف 2.5 مل ثقافة المتوسط ​​لوقف trypsinization وحصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
  5. غسل الخلايا مع ثقافة المتوسط ​​مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي واعادة تعليق بيليه الخلايا "إلى حل BSS (بدون إضافة 2 مم CaCl وتحتوي على مجموعة ميكرومتر الكالسيوم 2 +)، وحساب عدد الخلايا باستخدام مقياس الهيموغلوبين.
  6. إضافة ~ 10 6 الخلايا في كوفيت الكوارتز (10 مم، خلايا Starna)، وملء وحدة التخزين لتصل إلى 2 مل مع BSS.
  7. وضع كوفيت (التحريك مع شريط مغناطيسي) في مقياس التألق الطيفي.
  8. في وقت واحد تسجيل الاشارات مضان F 340nm 380nm و F مع الطول الموجي الانبعاثات في 510 نانومتر. بروتوكول تشغيل هو: BSS، بالإضافة إلى ذلك من 0.5 EGTA ميكروليتر (0.25 م الأوراق المالية)، بالإضافة إلى ذلك من 1 thapsigargin ميكرولتر(TG، و 10 سهم ملم)، بالإضافة إلى ذلك من 4 ميكرولتر الكالسيوم 2 + (1 M الأوراق المالية).

2. مليون فحص التبريد في الخلايا المستزرعة

  1. إجراء مسح الطول الموجي الإثارة من Fura-2 في الحلول التي تحتوي على الكالسيوم مختلف 2 + تركيز تتراوح بين 0 حتي 39،8 ميكرومتر لتحديد الطول الموجي تركيز الكالسيوم مستقل كنقطة isosbestic. عادة، وهذه النقطة هي isosbestic في أو حوالي 360 نانومتر.
  2. تستزرع KYSE-150 الخلايا في أسفل الزجاج أطباق ومحملة Fura-2 صباحا.
  3. إعداد نظام نضح مع 5 حلول BSS مختلفة: كا 2 + (2 مم)، EGTA / TG (0.5 ملم و 5 ميكرومترات، على التوالي)، مينيسوتا 2 + (0.5 ملم، من دون إضافة أو EGTA كا 2 +، التي تحتوي على مجانا كاليفورنيا 2 + في مجموعة ميكرومتر)، مينيسوتا 2 + / 2-APB (75 ميكرومتر)، EGTA / تريتون X-100 (0.1٪).
  4. تركيب الطبق على مرحلة من مراحل المجهر وحدد "نسبة الإثارة" واسطة مع موجات الإثارة عند 360 نانومتر و 390 و 510 في الانبعاثاتنانومتر.
  5. في وقت واحد تسجيل الاشارات مضان F 360nm 390nm و F مع نسبة (F 360nm / F 390nm) المعروضة في الإطار الثالث. بروتوكول تشغيل هو: كا 2 + ل 1 دقيقة لتحقيق الاستقرار في مضان، المنغنيز 2 + لمدة 30 ثانية، EGTA / TG لمدة 10 دقيقة، المنغنيز 2 + لمدة 2 دقيقة، EGTA-تريتون X-100 (0.1٪) لمدة 1 دقيقة للحصول على خلفية القراءة. ويمكن استخدام MN 2 + / 2-APB حل بدلا من المنغنيز 2 + لفحص التبريد ألغت مضان، مما يدل على أن دخول المنغنيز + 2 هو من خلال مسار SOCE.

3. مليون فحص التبريد في خلايا العضلات

  1. يتم تربيتها C2C12، خط الماوس خلية المنشأ العضلي، على الزجاج القاع أطباق في 5٪ CO 2 في الجو 37 درجة مئوية في المتوسط ​​DMEM التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، و 10٪ مصل الحصان.
  2. بعد الوصول إلى نقطة التقاء للخلايا، يتم تغيير الثقافة المتوسطة والمتوسطة التمايز (إزالة مصل بقري جنيني وreducه سيرم الحصان إلى 2.5٪). سوف myoblasts C2C12 تفرق في myotubes بعد 4 أيام.
  3. تحميل C2C12 myotubes مع تركيز النهائي من 5 ميكرومتر Fura-2 صباحا كما هو موضح في 1،4-1،6.
  4. إضافة تركيز النهائي من 20 sulphonamide N-بنزيل-P-التولوين ميكرومتر (BTS) لمنع تقلصات العضلات والحركة الفنية التي تسببها لهم والسماح لمدة 15 دقيقة قبل بدء التجربة.
  5. تركيب الطبق على مرحلة من مراحل المجهر متصلا جهاز برس تراست أوف إنديا وتحميل ما يلي حلول BSS في النظام نضح: 2 كا 2 + (2 مم)، 0 كا 2 +، المنغنيز 2 + (0.5 ملم)، 2 + المنغنيز / TG (0.5 مم، 20 ميكرون، على التوالي).
  6. إعداد نظام نضح على النحو المبين أعلاه.
  7. في وقت واحد تسجيل الاشارات مضان F 360nm 390nm و F مع نسبة (F 360nm / F 390nm) المعروضة في الإطار الثالث. بروتوكول تشغيل هي: 2 كا 2 + ل 1 دقيقة، 0 كا 2 + ل 1 دقيقة إلى فلوريداالعش بعيدا كا 2 +، المنغنيز 2 + 0.5 دقيقة، والمنغنيز 2 + / TG لمدة 10 دقيقة، والمنغنيز 2 + /-EGTA تريتون X-100 (0.1٪).

4. المكان والزمان حل SOCE في ألياف العضلات البشرة

  1. إعداد الحلول التالية.
    متساوي التوتر Tyrode العازلة: 140 ملم كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 10 HEPES مم، 2 مم MgCl 2.5 ملم CaCl ودرجة الحموضة 7.2، 290 mosm
    ثقافة المتوسط: DMEM مع سيرم الحصان 2٪ و 1٪ البنسلين والستربتوميسين
    غسل حل # 1: 109.6 ملي K-الغلوتامات، 2 مم EGTA-KOH، 6.7 ملي MgCl 2 مم للاعبي التنس المحترفين، 6 فوسفات الكرياتين ملم (CP)، و 20 ملي N، N-مكررا (2-هيدروكسي إيثيل)-2-aminoethanesulfonic حامض (BES)، KOH، ودرجة الحموضة 7.0
    غسل الحل رقم 2: 140 ملم K-الغلوتامات، 5 مم EGTA-KOH، 6.5 ملم MgCl 2 مم للاعبي التنس المحترفين، 6 مم CP، و 20 ملي BES-كوه، ودرجة الحموضة 7.0
    السلخ حل: 140 ملم K-الغلوتامات، 6.5 ملم MgCl 2 مم للاعبي التنس المحترفين، 6 مم CP، و 20 ملي BES-كوه، ودرجة الحموضة 7.0
    TT-التحميلالحل: 90.6 ملي K-الغلوتامات، 18 مم نا الغلوتامات، و 0.55 ملي CaCl 2 مم EGTA-KOH، 6.7 ملي MgCl 5.4 ملي مول ATP، 15 مم CP، 0.0025 ملغ / مل كيناز الكرياتين (CK)، و 20 ملي BES-KOH، 5 ميكرومتر الكربونيل السيانيد ف trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)، 7.0 درجة الحموضة، PCA 7.0
    ريال التحميل الحل: 107.8 ملي K-الغلوتامات، 0.98 ملي CaCl 2 مم EGTA-KOH، 6.6 ملم MgCl 5.4 ملي مول ATP، 15 مم CP، 0.0025 ملغ / مل CK، 20 ملي BES-KOH، 5 FCCP ميكرون، الرقم الهيدروجيني 7.0، 6.6 PCA
    ريال حل للأوزون: 100 مم K-الغلوتامات، 40 مم نا الغلوتامات، 10 ملي EGTA-KOH، 10 ملي 1،2 مكرر (O-aminophenoxy) الايثان-N، N، N '، N'-tetraacetic حامض (BAPTA )، 0.35 ملم MgCl 0.5 مم للاعبي التنس المحترفين، 1 ملم CP، و 20 ملي BES-KOH، 5 FCCP ميكرومتر، ودرجة الحموضة 7.0. يتم إضافة 25 مم caffeine/20 thapsigargin ميكرومتر (TG) قبل التجارب.
  2. لتشريح العضلة الباسطة الطويلة لأصابع (EDL) في العضلات، ووضع الأولى على الفئران وترتيب المحطة في موقف جانبي، ثم إزالة الجلد من منطقة الكاحل حتى الركبة، وخفضطبقات من الأنسجة العضلية السطحية لفضح مؤسسة كهرباء لبنان، وقطع كل الأوتار العلوية والسفلية للافراج عن عضلة سليمة مؤسسة كهرباء لبنان، ومن المهم للحفاظ على الأوتار لأطول فترة ممكنة. يتم تحويل مؤسسة كهرباء لبنان في التوصل إلى حل Tyrode التي تحتوي على الكالسيوم 0 2 + و 0.1 EGTA ملم إلى منع أي انكماش.
  3. تحت stereomicroscope، استخدام اثنين من ملاقط لعقد الأوتار أدنى الإدراج وتقسيم العضلات مؤسسة كهرباء لبنان الى قسمين حزم. تكرار هذه العملية للحصول على 4 و 8 ثم حزم. فمن الأهمية بمكان أن تبقى الأوتار لكل من حزم 8 في نهاية العملية. إذا ما خسروا من بعض حزم، التخلص منها.
  4. تحت stereomicroscope، وgriped كل قطاع حزمة مؤسسة كهرباء لبنان على حد سواء في الأوتار والمشدود بعناية حتى 3 ~ وتترك 4 فصل الألياف العضلية واحدة سليمة مع وتر على كلا الجانبين.
  5. وضع 1 قطرة من الكالسيوم 2 + العازلة tyrode الحرة في وسط صحن زجاج القاع، تضع شرائط مؤسسة كهرباء لبنان مباشرة على طبق، وإزالة بسرعة اكبر قدر ممكن منحل، ثم شريط أسفل كل الأوتار باستخدام شريط المياه سكوتش المقاوم، وتأكد من أن الشريط هو ضيق. غسل الألياف الأولى مع حل الكالسيوم 0 + 2 ثم مع 2.5 ملم كا 2 + حل 2 مرات. إذا لاحظت الألياف فرط العقود والضرر، ويتخلص من الألياف.
  6. إذا لزم الأمر، يمكن زرعها الألياف لمدة تصل إلى 96 ساعة، والسماح للتلاعب الجيني. غسل الألياف 3 مرات مع الثقافة المتوسطة كاملة وإضافة 2 مل المتوسطة في طبق، مكان في 5٪ CO 2 و 37 حاضنة درجة مئوية. قبل كل تجربة، ودراسة ألياف العضلات والتخلص من أولئك الذين لا العتابي واضح أو مع وجود علامات للتلوث، أو مع وجود علامات التلف مثل انكماش الغشاء sarcolemmal. الألياف الجيدة الرد على التحفيز، بوكل الكهربائية، والتحفيز الكافيين.
  7. تغسل ألياف العضلات واحدة 3 مرات مع الحل غسيل رقم 1 واستحم في حل السلخ الخلايا الشبيهة مع 500 ميكرومتر Rhod-5N و 0.5 ملي كا 2 + لمدة 5 دقائق.
  8. <لى> استخدام إبرة التنجستن تعلق على حامل دبوس، ميكانيكيا الجلد والألياف تحت stereomicroscope، مما يسمح الأنابيب عرضية (تي تي) إلى إعادة الختم تلقائيا، وإلى اعتراض مترافق Rhod-5N مع كا 2 + في ترينيداد وتوباغو، وغسل ألياف البشرة مرتين مع غسيل حل # 2. عملية السلخ الميكانيكية هو الأمثل عند إزالة أقل من 25٪ من عرض الخلية أثناء عملية السلخ.
  9. لتحميل ريال سعودي، يتم تحضين ألياف البشرة مع الحل السلخ التي تحتوي على 20 ميكرومتر Fluo-5N صباحا ل1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ثم يغسل واسعة النطاق باستخدام محلول الغسيل # 2، واحتضانها ل30 دقيقة إضافية للسماح كاملة دي الأسترة للصباغة.
  10. بعد 30 دقيقة، والألياف البشرة وتصور تحت هدف 60X من المجهر متحد البؤر. يتم الحصول على الصور مضان في موجات من الأصباغ المقابلة (الإثارة في 543 نانومتر، وتعد الانبعاثات من 570 نانومتر لRhod، 5N، والإثارة في 488 نانومتر، والانبعاثات في 530-560 نانومتر لFluo-5N). ريجيإضافات من الفائدة (رويس) ويتم اختيار لمناطق كل المحملة صبغ.
  11. البروتوكول التجريبي هو على النحو التالي: TT-تحميل حل ل 120 ق حل ريال التحميل، لمدة 120 ق حل SR-نضوب، ل400-750 ق إلى تستنفد كاليفورنيا ريال مخزن + 2. خلال هذه العملية، يتم تسجيل التغيرات في كثافة Rhod-5N (TT الكالسيوم 2 +) وFluo-5N كثافة (SR الكالسيوم 2 +)، وخلق مسار تحديد زمن التغيرات مضان النسبي في ترينيداد وتوباغو، وريال. ويتم تحليل مزيد يعني قيم كثافة مضان من ألياف متعددة. يتم تطبيع كثافة التحميل القصوى في نهاية التحميل SR-TT / الى 100٪.

5. ممثل النتائج

درسنا نشاط SOCE في خلايا-150 KYSE باستخدام الكالسيوم داخل الخلايا 2 + القياس (الشكل 2). باستخدام RFP كمراسلة، ونحن يمكن تحديد الخلايا الفردية transfected مع shRNA البلازميد معينة تحتوي ضد orai1، جين ترميز ج SOCEhannel. مقارنة مع الخلايا transfected مع البلازميدات المحتوية على shRNA التدافع (أسود التتبع)، و. هدمت النتائج بروتين Orai1 في نشاط SOCE انخفض (التتبع الحمراء)

وأكد أيضا في الخلايا SOCE-150 KYSE مع المنجنيز 2 + فحص التبريد (الشكل 3). طول موجة الإثارة من 360 نانومترا تقارير نقطة isosbestic من Fura-2، حيث تألق بشكل مستقل عن تركيز الكالسيوم + 2. بعد TG المنضب تماما ER كا 2 + مخازن، ونضح من المنغنيز 2 + أدى إلى انخفاض كبير ومضان. ويمكن قياس النشاط SOCE الشامل وفقا لمعدل انخفاض Fura 2-كثافة مضان مع منحدر حاد مما يدل على أن SOCE أكثر نشاطا، في حين أن معنى ضحالة منحدر SOCE أقل نشاطا. ويبدو المنحدر من انخفاض في مضان 2-APB الخلايا المعالجة لتكون أقل عمقا بكثير، والتي أشارت إلى أن تم حظر نشاط SOCE هذا المركب. والمنغنيز2 + تم تحديد معدلات التبريد من محضر 10 ثانية الأولي، حيث التبريد كان لا يزال في نطاق الخطية بدون التشبع.

وقد تم إجراء مماثل المنغنيز تبريد + 2 فحص في العضلات (الشكل 4). في هذه الحالة تم تطبيق المنغنيز 2 + مع TG. في حين كان TG استنزاف الكالسيوم ريال 2 + مخازن، المنحدر تبريد مضان تغيرت تدريجيا حتى وصلت سعر الفائدة القصوى. المنحنى السيني يشير إلى تنشيط متدرجة من SOCE في ظل هذه الظروف التجريبية.

وأظهرت صحية سليمة واحدة الألياف العضلية في ثقافة العتابي واضحة وموحدة، أي علامات على التلوث، وليس هناك علامات على الانكماش الناجم عن الضرر. وكانت هذه الألياف قادرة على التعاقد مع ردا على التحفيز الكهربائي أو حلول depolarizing. تحت التصوير متحد البؤر، وأظهرت البشرة محاصرة من الألياف Rhod-5N صبغ في مقصورة TT ما يميز نمط صدرة الثدييات (visualized في القناة الحمراء). بعد تحميل للريال مع Fluo-5N صباحا، وكان نمط نموذجي ريال تتخللها مرئية (في القناة الخضراء). على نضح من الألياف البشرة مع حل التحميل TT / ريال، وزيادة كثافة مضان من كلا Rhod-5N وFluo 5N؛ على نضح مع حل نضوب ريال سعودي، ومستويات مضان في المقصورة ريال ومقصورة TT بدأت في الانخفاض، مشيرا إلى اقتران ضيق بين ريال كا 2 + مخزن نضوب وتفعيل SOCE، على التوالي (الشكل رقم 5).

الشكل 1
الشكل 1. تفعيل مخزن تديرها كا 2 + دخول (SOCE). Orai1، يقع المسام قناة تشكيل وحدة، على غشاء البلازما (بعد الظهر) وSTIM1، كاليفورنيا (أ) 2 + الاستشعار، ويقع على الشبكة الإندوبلازمية أو الهيولى العضلية (ER / ريال) الأغشية. عندما ER / ريال كا 2 + يتم تخفيض مخازن إما بسبب حجب ER / ريال كا 2 + مضخة (SERCA) أو كا 2 + من خلال إطلاق مستقبلات 3 الملكية الفكرية أو مستقبلات ryanodine، يتم تنشيط STIM1. تنشيط STIM1 جزيئات تشكل البقع وحمل تجميع Orai1، الأمر الذي يؤدي كذلك إلى تفعيل SOCE.

الشكل 2
الشكل 2. قياس الكالسيوم داخل الخلايا 2 + في خلايا-150 KYSE. تبادل حل خارج الخلية من 0 كا 2 + (0.5 مم EGTA) إلى 2 ملم كا 2 + لم لحث على أي تغيير في الكالسيوم داخل الخلايا 2 +. 5 ميكرون TG في 0 كا 2 الافراج + + حمام حل السلبي الناجم عن ER كا 2. بعد كا 2 ER تم استنفاد + مخازن (> 10 دقائق)، بالإضافة إلى ذلك من الكالسيوم خارج الخلية 2 + (2 ملم) تنشيط المستمر داخل الخلايا كا 2 + من خلال ارتفاع SOCE، والتي يمكن أن يكون قد تم حظره من قبل مثبطات SOCE، على سبيل المثال SKF-96365 و 2 - APB (البيانات لا تظهر). خلايا transfected مع البلازميدات المحتوية على وجه التحديد ضد shRNAتظاهر orai1 (الحمراء) SOCE تخفيضها بشكل ملحوظ من خلايا transfected مع تسلسل التدافع (أسود).

الشكل (3)
الشكل 3. MN 2 + فحص التبريد من SOCE في خلايا-150 KYSE. تم قياس التبريد من Fura 2-مضان من قبل المنغنيز 2 + (0.5 ملم) في الكالسيوم 2 + المستقلة الطول الموجي من الإثارة Fura-2 (360 نانومتر). تم علاج الخلايا مع 5 ميكرون TG لمدة 10 دقيقة في استنزاف تماما ER كا 2 + المخازن. المنحدر من الاضمحلال مضان-2 Fura على المنغنيز 2 تمثل + إضافة (خطوط اندفاع، وذلك في أول 10 ثانية) وتفعيل SOCE، والذي يعبر عنه انخفاض في المئة في مضان في وحدة الزمن (القيمة الأولية الى 100٪). تأسست إشارة تطفأ الحد الأقصى مضان في نهاية التجربة التي lysing الخلايا مع 0.1٪ تريتون X-100 (ك 0٪). أظهرت خلايا تعامل مع APB-2 (75 ميكرومتر) وأقل عمقا بكثيرتم منع انحدار، SOCE يوحي هذا المركب في خلايا-150 KYSE.

الشكل 4
الشكل 4. تفعيل متدرجة من SOCE في خلايا العضلات التي كشفت عنها المنغنيز 2 + فحص التبريد يمكن. تكون مسجلة تفعيل SOCE بينما كان TG أوزون ريال كا 2 + المخازن. التي يسببها تطبيق في وقت واحد من المنغنيز 2 + (0.5mM) وTG (20 ميكرون) نقصان متدرج والسيني من الخلايا Fura-2 + تبريد مضان (السماوي خط اندفاعة لإظهار نقطة أسرع تبريد)، والتي كانت متميزة من المنغنيز الأولية 2 معدل (الخط الازرق شرطة). بقي 2 مليون + منحدر تبريد تقريبا نفس المستوى القاعدي في الخلايا المعالجة 2-APB (75 ميكرومتر)، مشيرة الى انه يحول دون أن SOCE.

الشكل 5
الشكل 5. المكان والزمان حل SOCE في الالياف العضلية البشرة. (A) رهتم تحميل تم تحميل OD-5N الملح في ترينيداد وتوباغو وAM Fluo-5N إلى ريال. (B) بعد تطبيق كا 2 + حل نضوب، انخفض التألق في كل من ترينيداد وتوباغو ومقصورات ريال. وأشارت إلى فقدان Fluo-5N مضان صدر بسرعة ريال كا 2 + محتوى وفقدان Rhod-5N مضان اقترح تفعيل SOCE.

Discussion

على الرغم من أن موجات الإثارة لكا 2 + ملزمة والكالسيوم 2 + مجانا Fura-2 هي 340 نانومتر و 380، على التوالي، ومجموعة أفضل نسبة دينامية Fura-2 لكا 2 قد + قياس تركيز تحدث في موجات أخرى في خاص مجهر النظام. هذه التحولات في الطول الموجي وعادة ما تكون نتيجة للتغيرات في مسار بصري مع إضافة المكونات البصرية المختلفة. في هذه الدراسة تم تحديد موجات الإثارة لFura-2 الى 350 نانومتر و 390 عن طريق إجراء التحليل الطيفي من Fura-2 مضان.

وبين الخلايا الكالسيوم مستوى + 2 في نتائج العصارة الخلوية من التوازن بين مصادر عدة، بما في ذلك داخل الخلايا كا 2 + الإفراج عنهم، خارج الخلية كا 2 + دخول، وكذلك استبعاد الكالسيوم + 2 آلية على غشاء ER والبلازما. لعزل اتجاه شركة نفط الجنوب بوساطة كا 2 + من تدفق الكالسيوم داخل الخلايا الافراج + 2 والكالسيوم 2 + extrusion، يمكن استخدامها في تبريد المنغنيز + 2 الفحص. ومن المعروف MN 2 + لتكون قادرة على تتغلغل في الخلايا عن طريق SOCE بل هو منيع إلى قذف سطح غشاء أو امتصاص الكالسيوم من ER 2 + مضخات. ولذلك، تبريد مضان يمثل قياس اتجاه والمنغنيز 2 + تدفق إلى الخلايا التي تقدر درجة تفعيل SOCE. 2 مليون تتم + فحص التبريد في نقطة isosbestic، في الطول الموجي مثل Fura-2. كثافة مضان مستقلة عن كا 2 + تركيز وينبغي تحديد نقطة isosbestic لكل نظام بواسطة المسح الضوئي طيف. بدلا من ذلك، يمكن تسجيل المنغنيز 2 + التبريد بواسطة مضان المعدلة في أي موجات اثنين في مثل هذه الطريقة أن القيمة النهائية هي مستقلة عن كا 2 + تركيز 13.

للحصول على المعلومات المكانية والزمانية لنشاط SOCE في عضلات الهيكل العظمي، استخدمنا طريقة المزدوجة صبغ، والذي يسمح measureme في وقت واحدNT النشاط SOCE وريال كا 2 + محتوى البالغين في الثدييات البشرة ألياف العضلات مؤسسة كهرباء لبنان. لا يمكن للعلاقة بين التغيرات في كا 2 ريال يتم رسم + المحتوى وSOCE نشاط للدلالة على عتبة وحساسية تفعيل SOCE إلى استنزاف الكالسيوم ريال 2 + تخزين. تم تحسين حل TT-تحميل لتحميل وبالإضافة إلى ذلك تي الأنابيب مع كا 2 + وفتيلة من T-الأنابيب والحل SR-التحميل تم تصميمه لتعزيز القصوى ريال التحميل + كا وبالإضافة إلى ذلك ليتم تحميلها على تي الأنابيب مع ~ 500 ميكرومتر كا 2 +. يتم تضمين FCCP في حل TT / SR-التحميل وحل ريال للأوزون من أجل القضاء على آثار من الميتوكوندريا.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر الدكتور نوح يسليدر لقراءة وتحرير هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل UMDNJ مؤسسة أبحاث المنح 62-09 إلى ZP، جمعية القلب الأميركية SDG2630086 إلى XZ، 0535555N إلى ميغابايت، والمعاهد الوطنية للصحة RC2AR058962-01 إلى ميغابايت.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Mediatech 10-040-CV
Ham's F-12 Mediatech 10-080-CV
DMEM Mediatech 10-013-CV
Glass Bottom Dish MatTek P35G-1.5-14-C
Fura-2 AM Invitrogen (Molecular Probes) F1221 -20 °C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO
Fluo-5N AM Invitrogen (Molecular Probes) F14204 -20 °C, seal tight, protected from light
Rhod-5N Invitrogen (Molecular Probes) R14207 -20 °C, seal tight, protected from light
Quartz Cuvette Starna Cells 3-Q-10
thapsigargin Tocris 1138
2-Amin–thoxydiphenylborane (2-APB) Tocris 1224
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) Sigma-Aldrich 435600
Collagenase Type I Sigma C0130

Equipment:

  1. A spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): xenon arc lamp, computer-controlled high-speed random access monochromator, cuvette-based emission monochromator, Nikon TE-200 inverted fluorescence microscope, S Fluor 40x/1.30 oil objective, PMT detectors.
  2. Laser Scanning Confocal Microscope (BioRad Radiance2100): argon laser 453/477/488/514, HeNe laser 543nm, Nikon TE2000 inverted microscope, 60X objective (N.A. 1.4, oil).
  3. A stereomicroscope with a magnification power > 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Parekh, A. B., Putney, J. W. Jr Store-operated calcium channels. Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).
  2. Ma, J., Pan, Z. Retrograde activation of store-operated calcium channel. Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).
  3. Feske, S. ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond. Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).
  4. Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
  5. Pan, Z. Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29. Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).
  6. Shin, D. W. A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).
  7. Ma, J., Pan, Z. Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells. Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).
  8. Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor. J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).
  9. Hirata, Y. Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes. Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).
  10. Zhao, X. Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice. Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).
  11. Zhao, X. Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor. J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).
  12. Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).
  13. Shuttleworth, T. J. Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell. Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics