Fluorescens-baserede Måling af Store betjente Calcium indtastning i levende celler: fra kulturperler kræftcellen til at Skeletmuskel Fiber

Biology
 

Summary

Omfanget af butikken betjente Ca

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pan, Z., Zhao, X., Brotto, M. Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber. J. Vis. Exp. (60), e3415, doi:10.3791/3415 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Store drives Ca2 + indgang (SOCE), tidligere betegnet kapacitive Ca2 + indgang, er et stramt reguleret mekanisme til indstrømning af ekstracellulært Ca2 + i celler for at genopfylde depleteret endoplasmatiske reticulum (ER) eller sarcoplasmatisk reticulum (SR) Ca 2 + lagrer 1,2. Idet Ca2 + er et ubikvitært anden messenger, er det ikke overraskende at se, at SOCE spiller vigtige roller i en række af cellulære processer, herunder proliferation, apoptose, gentranskription og motilitet. På grund af dets udbredte forekomst i næsten alle celletyper, herunder epitelceller og skeletmuskulatur, har denne vej modtaget stor interesse 3,4. Imidlertid er heterogenitet SOCE egenskaber i forskellige celletyper og den fysiologiske funktion endnu ikke klart 5-7.

De funktionelle kanal egenskaber SOCE kan afsløres ved patch-clamp-forsøg, mens en stor mængde viden om this pathway er opnået ved fluorescens-baserede intracellulær Ca2 + målinger på grund af dens bekvemmelighed og gennemførligheden til high-throughput screening. Formålet med denne rapport er at opsummere nogle fluorescens-baserede metoder til at måle aktiveringen af SOCE i monolag celler, suspenderede celler og muskelfibre 5,8-10. Den mest almindeligt anvendte af disse fluorescens metoder til direkte at overvåge dynamikken af intracellulær Ca2 + under anvendelse af forholdet mellem F 340 nm og F 380 nm (510 nm for emission bølgelængde) af det ratiometrisk Ca2 + indikator Fura-2. At isolere aktiviteten af ensrettede SOCE fra intracellulære Ca2 +-frigivelse og Ca2 +-ekstrudering, er en Mn2 +-quenching assayet anvendes ofte. Mn2 + vides at være i stand til at trænge ind i celler via SOCE mens det er uigennemtrængeligt for overflademembranen ekstruderingsprocesser eller ER optagelse af Ca 2 + pumper på grund af sin meget høje affinitet vidh Fura-2. Som et resultat heraf repræsenterer quenching af Fura-2 fluorescens induceret ved optagelse af ekstracellulær Mn2 + i cellerne en måling af aktiviteten af SOCE 9. Ratiometrisk måling og Mn +2 afkølende assays kan udføres på en kuvette-baseret spektrofluorometer i en cellepopulation tilstand eller i et mikroskop-baseret system til at visualisere enkelte celler. Den fordel, encellede målinger er, at individuelle celler udsat for gen manipulationer kan vælges ved hjælp af GFP eller RFP reportere, så studier i genetisk modificerede eller muterede celler. De spatiotemporal karakteristika SOCE i strukturelt specialiserede skeletmuskel kan opnås i isolerede muskelfibre ved samtidig overvågning af fluorescensen af to lave affinitet Ca2 + indikatorer rettet mod specifikke rum i musklen fibre, såsom Fluo-5N i SR og Rhod- 5N i den tværgående tubuli 9,11,12.

Protocol

1. Intracellulær Ca2 + måling for individuelle celler

  1. Kyse-150, en human esophageal pladecellecarcinom (ECSS) cellelinie dyrkes i 5% CO2-atmosfære ved 37 ° C i blandet RPMI 1640/Ham 's F-12 medium (1:1) indeholdende 5% føtalt bovint serum.
  2. Kyse-150-celler transficeret med plasmiderne enten indeholder shRNA specifikt mod Orai1 eller et kodet sekvens. Plasmiderne også et gen, der koder rødt fluorescerende protein (RFP) som en reporter, som drives af en separat promotor.
  3. Cellerne dyrkes i glas-bund retter (nr. 1,5 dækglas, Mattek, MA) i 48 timer.
  4. Fjernelse af mediet og skylles cellerne med en balanceret saltopløsning (BSS) (140 mM NaCl, 2,8 mM KCI, 2 mM CaCI 2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,2).
  5. Tilsæt 1 ml BSS indeholdende 2 uM Fura-2 acetoxymethylester (Molecular Probes) i skålen og pak hele skålen med folie til protect mod lys.
  6. Inkubér cellerne i 40 minutter ved 37 ° C og derefter lade dem i yderligere 15 min periode ved stuetemperatur for at tillade esterhydrolyse afsluttet. Vask cellerne med BSS to gange.
  7. Montere parabol på scenen af ​​Nikon TE200 omvendt mikroskop, som er forbundet til PTI spektrofluorometer, med excitationsbølgelængder på 350 og 390 nm og emission ved 510 nm. De nøjagtige excitationsbølgelængder, der skal anvendes, kan variere lidt alt efter optik for hvert enkelt system. De to bølgelængder med bedste forhold dynamisk bestemmes ved ekscitationsspektret scanning af Fura-2-salt i opløsninger indeholdende Ca2 + i området fra 0 til 39,8 uM (eller højere koncentration, ved hvilken Fura-2-fluorescens er mættet).
  8. Etablere et tyngdekraft perfusionssystem med 4 forskellige opløsninger i BSS: Ca 2 + (2 mM), EGTA (0,5 mM), EGTA-TG (thapsigargin, 5 uM), Ca2 +-2-APB (en SOCE inhibitor, 75 uM). Computer-kontrollerede automatiseret perfusipå systemer kan også anvendes.
  9. Marker de celler, der udtrykker RFP i visualisering tilstand.
  10. Placere åbningen spidsen af ​​perfusionssystemet til 10x forstørrelse indtil spidsen er lige over området af interesse i en 45 graders vinkel.
  11. Samtidig registrerer fluorescenssignaler F 350 nm og F 390 nm. Forholdet (F 350 nm / F 390 nm) er vist i det tredje vindue. Ændre perfusionsopløsninger i følgende rækkefølge: Ca2 +, EGTA; Ca2 +, EGTA-TG, Ca2 +, Ca2 +-2-APB.

Den ovennævnte protokol kan modificeres til måling af intracellulær Ca2 + i cellesuspension system.

  1. Kultur Kyse-150 celler i en T25 kolbe med den samme kultur betingelser som ovenfor.
  2. Når cellerne når 90% konfluens, fjernes mediet og skylles cellerne med en BSS opløsning.
  3. Tilsættes 2,5 ml BSS indeholdende 2 uM Fura-2 AM og inkuberescellerne i 40 minutter ved 37 ° C efterfulgt af deesterificering.
  4. Fjerne BSS, tilsættes 2,5 ml trypsin i kolben og inkuber ved 37 ° C, indtil cellerne løsnes. Derefter tilsættes 2,5 ml dyrkningsmedium for at standse trypsinisering og høste cellerne ved centrifugering ved 800 rpm i 5 min.
  5. Vask cellerne med dyrkningsmedium en gang ved centrifugering og genopslæmmes cellernes pellet i BSS opløsning (uden tilsætning af 2 mM CaCl2, som indeholder um Ca2 +) og tælle celler nummeret med en hematometer.
  6. Tilsættes ~ 10 6 celler i en kvartskuvette (10 mm, Starna celler) og fylde volumenet op til 2 ml med BSS.
  7. Anbring kuvette (omrøring med en magnetisk stang) i spektrofluorometer.
  8. Samtidigt registrerer fluorescenssignaler F 340 nm og F 380 nm med emissionsbølgelængde på 510 nm. Driften protokol er: BSS, tilsætning af 0,5 pi EGTA (0,25 M stamopløsning), tilsætning af 1 pi thapsigargin(TG, 10 mM stamopløsning), tilsætning af 4 gl Ca2 + (1 M stamopløsning).

2. Mn quenching assayet i dyrkede celler

  1. Udføre excitationsbølgelængden scanning af Fura-2 i opløsninger indeholdende forskellige Ca 2 +-koncentration i området fra 0 til 39,8 uM at bestemme Ca uafhængig af koncentrationen bølgelængde som det isosbestiske punkt. Sædvanligvis det isosbestiske punkt er ved eller omkring 360 nm.
  2. Kyse-150-celler dyrkes i glas-bund skåle og fyldt med Fura-2 AM.
  3. Opsætte perfusionssystem med 5 forskellige BSS opløsninger: Ca2 + (2 mM), EGTA / TG (0,5 mM og 5 uM, henholdsvis), Mn2 + (0,5 mM, uden tilsætning af EGTA eller Ca 2 +, som indeholder fri Ca2 + i um), Mn2 + / 2-APB (75 uM), EGTA / Triton X-100 (0,1%).
  4. Montere parabol på scenen af ​​mikroskopet og vælg "Excitation Ratio" mode med excitationsbølgelængder på 360 nm og 390 nm og emission ved 510nm.
  5. Samtidig registrerer fluorescenssignaler F 360 nm og F 390 nm med Ratio (F 360 nm / F 390 nm), der vises i det tredje vindue. Driften protokol er: Ca2 + i 1 minut for at stabilisere fluorescens, Mn2 + i 30 sek, EGTA / TG i 10 minutter, Mn2 + i 2 min, EGTA-Triton X-100 (0,1%) i 1 min til opnåelse af baggrunden aflæsning. Mn2 + / 2-APB-opløsning kan anvendes i stedet for Mn2 + for at undersøge afskaffet fluorescensundertrykkelse, hvilket indikerer, at Mn2 + indgang gennem SOCE pathway.

3. Mn quenching assayet i muskelceller

  1. C2C12, en muse myogene cellelinie, der dyrkes på glas-bund retter i 5% CO2-atmosfære ved 37 ° C i DMEM-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum, 10% hesteserum.
  2. Efter at cellerne når konfluens, er dyrkningsmediet skiftet til differentiering medium (fjern føtalt bovint serum og reduktione hesteserum til 2,5%). De C2C12 myoblaster vil differentiere til myotuber efter 4 dage.
  3. Indlæse C2C12 myorør med en endelig koncentration på 5 uM Fura-2 AM som beskrevet i 1,4-1,6.
  4. Tilføje en slutkoncentration på 20 uM N-benzyl-p-toluen-sulfonamid (BTS) til at inhibere muskelsammentrækninger og bevægelsen artefakter forårsaget af dem og tillade 15 min før initiering af forsøget.
  5. Montere parabol på scenen af mikroskopet er forbundet til PTI enheden og indlæse følgende BSS løsninger i perfusionen systemet: 2 Ca 2 + (2 mM), 0 Ca 2 +, Mn 2 + (0,5 mM), Mn 2 + / TG (0,5 mM, 20 pM, henholdsvis).
  6. Oprettet perfusionssystem som beskrevet ovenfor.
  7. Samtidig registrerer fluorescenssignaler F 360 nm og F 390 nm med Ratio (F 360 nm / F 390 nm), der vises i det tredje vindue. Driften protokol er: 2 Ca2 + i 1 min, 0 Ca2 + i 1 min til flUSH væk Ca2 +, Mn2 + i 0,5 min, Mn2 + / TG i 10 minutter, og Mn2 + / EGTA-Triton X-100 (0,1%).

4. Rumligt og tidsligt løst SOCE i flået muskelfibre

  1. Forbered følgende løsninger.
    Isotonisk Tyrode-puffer: 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, pH 7,2, 290 mOsm
    Dyrkningsmedium: DMEM med 2% hesteserum og 1% penicillin og streptomycin
    Vaskeopløsning # 1: 109,6 mM K-glutamat, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM creatinphosphat (CP), 20 mM N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsyrepuffer syre (BES)-KOH, pH 7,0
    Vaskeopløsning # 2: 140 mM K-glutamat, 5 mM EGTA-KOH, 6,5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7,0
    Flåning opløsning: 140 mM K-glutamat, 6,5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7,0
    TT-loadingOpløsningen: 90,6 mM K-glutamat, 18 mM Na-glutamat, 0,55 mM CaCl2, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 mM MgCl2, 5,4 mM ATP, 15 mM CP, 0,0025 mg / ml kreatinkinase (CK), 20 mM BES-KOH, 5 uM carbonyl cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), pH 7,0, PCA 7,0
    SR belastning opløsning: 107,8 mM K-glutamat, 0,98 mM CaCl2, 2 mM EGTA-KOH, 6,6 mM MgCl2, 5,4 mM ATP, 15 mM CP, 0,0025 mg / ml CK, 20 mM BES-KOH, 5 uM FCCP, pH 7,0, PCA 6,6
    SR nedbrydende opløsning: 100 mM K-glutamat, 40 mM Na-glutamat, 10 mM EGTA-KOH, 10 mM 1,2-bis (o-aminophenoxy) ethan-N, N, N ', N'-tetraeddikesyre (BAPTA ), 0,35 mM MgCl2, 0,5 mM ATP, 1 mM CP, 20 mM BES-KOH, 5 uM FCCP, pH 7,0. 25 mM caffeine/20 uM thapsigargin (TG) tilsættes før eksperimenterne.
  2. At dissekere den extensor digitorum longus (EDL) muskel, først fastlægge de mus og arrangere benet på lateral position, så fjern skindet fra anklen området op til knæet, skæresde overfladiske muskel lag af væv for at blotlægge EDL, og afskære både de øvre og nedre sener at frigøre den intakte EDL muskler, er det vigtigt at holde sener så længe som muligt. EDL overføres til en Tyrode-opløsning indeholdende 0 Ca2 + og 0,1 mM EGTA for at undgå kontraktioner.
  3. Under et stereomikroskop, skal du bruge to pincet til at holde lavere indsættelse sener og dele EDL muskel i to bundter. Gentag processen for at opnå 4 og derefter 8 bundter. Det er kritisk, sener forbliver for hver af de 8 bundter ved slutningen af ​​processen. Hvis de bliver tabt fra nogle bundter, kassere dem.
  4. Under et stereomikroskop, hver EDL bundt strimmel griped på både sener og omhyggeligt strakte sig indtil 3 ~ 4 adskilte enkelte muskelfibre står tilbage intakt med sener på begge sider.
  5. Put 1 dråbe af Ca 2 + Tyrode buffer i midten af glasset bund fad, fastsætter EDL strimler lige på fadet, hurtigt at fjerne så meget som muligt afløsning, så tape ned på begge sener med vandafvisende tape, og sørg for båndet er stramt. Vaskes fiberen først med 0 Ca2 +-opløsning og derefter med en 2,5 mM Ca2 + opløsningen 2 gange. Hvis fiberen hyper-kontrakter, og skaden er bemærket, kasseres fiber.
  6. Hvis det er nødvendigt, kan fiberen dyrkes i op til 96 timer, hvilket giver genetiske manipulationer. Vask fiberen 3 gange med komplet dyrkningsmedium, og der tilsættes 2 ml medium i skålen, sted i 5% CO2 og 37 ° C inkubator. Før hvert forsøg, undersøger muskelfibre, og smid dem uden klare striation eller med tegn på forurening, eller med tegn på skader såsom kontraktur af sarcolemmal membranen. Gode ​​fibre reagere KCI, elektrisk stimulering, og koffein stimulering.
  7. Enkelte muskelfibre vaskes 3 gange med vaskeopløsningen # 1 og badet i intracellulær-lignende afhudning opløsning med 500 pM Rhod-5N og 0,5 mM Ca2 + i 5 minutter.
  8. <li> Ved hjælp af en Wolfram nål fastgjort til en stift holder, mekanisk huden fiber under et stereomikroskop, så tværgående tubuli (TT) til automatisk reseal og at fange den Rhod-5N konjugeret med Ca 2 + i TT, vaske de flåede fibrene to gange med vask løsning # 2. Den mekaniske flåningen proces er optimal, når mindre end 25% af cellens bredde fjernes under flåningen processen.
  9. At indlæse SR er isolerede fibre inkuberes med flåning opløsning indeholdende 20 pM Fluo-5N AM i 1 time ved stuetemperatur, efterfulgt af omfattende vask med vaskeopløsningen # 2, og inkuberes i yderligere 30 minutter for at tillade fuldstændig de-esterificering af farvestoffet.
  10. Efter 30 minutter er isolerede fibre visualiseret under 60X formål konfokalt mikroskop. Fluorescensbilleder erhverves ved bølgelængder i de tilsvarende farvestoffer (excitation ved 543 nm og emission længere end 570 nm for Rhod-5N, excitation ved 488 nm og emission ved 530-560 nm for Fluo-5N). Regions af interesse (ROIs) er valgt for hvert farvestof belastede områder.
  11. Den eksperimentelle protokol er som følger: TT-loading opløsning til 120 s, SR-loading opløsning til 120 s, SR-depletion opløsning 400-750 s til nedbryder SR Ca2 +-lagre. Under denne proces, er ændringer i Rhod-5N intensitet (TT Ca2 +) og Fluo-5N intensitet (SR Ca2 +) registreres, hvilket skaber et tidsforløb bestemmelse af relative fluorescens ændringer i TT og SR. Middelværdierne for fluorescensintensitet fra multiple fibre analyseres yderligere. Den maksimale belastning intensitet ved udgangen af ​​TT / SR-lastning normaliseres til 100%.

5. Repræsentative resultater

Vi undersøgte SOCE aktivitet Kyse-150-celler under anvendelse intracellulær Ca2 +-måling (figur 2).. Anvendelse RFP som reporter, kan man vælge de individuelle celler transficeret med plasmid indeholdende specifikke shRNA mod orai1, et gen kodende for SOCE channel. Sammenlignet med celler transficeret med plasmider indeholdende scramble shRNA (sort spor) er vælte af Orai1 protein resulterer i nedsat SOCE aktivitet (rød spor).

SOCE i Kyse-150-celler blev også bekræftet med Mn2 + quenching assayet (figur 3).. Excitationsbølgelængden 360 nm rapporterer det isosbestiske punkt af Fura-2, hvor fluorescens er uafhængig af Ca2 +-koncentration. Efter TG fuldstændigt udtømt ER Ca2 + butikker, perfusionen af Mn2 + resulterede i en signifikant fluorescens fald. Den samlede SOCE aktivitet kan måles ved et fald på Fura-2 fluorescensintensitet med en stejlere hældning indikerer en mere aktiv SOCE, mens en fladere hældning betydning en mindre aktiv SOCE. Hældningen af ​​fluorescens fald i 2-APB behandlede celler viste sig at være meget fladere, hvilket indikerede, at SOCE aktivitet blev blokeret af denne forbindelse. Mn2 + quenching satser blev bestemt ud fra registreringen af de første 10 sekunder, hvor quenching var stadig i lineære område uden mætning.

En lignende Mn2 + quenching assayet blev udført i musklen (figur 4).. I dette tilfælde Mn2 + blev anvendt sammen med TG. Mens TG blev nedbryder SR Ca2 + butikkerne, fluorescensstandsning hældningen gradvist ændret sig, indtil det nåede sin maksimale hastighed. Den sigmoidal kurve angiver det graduerede aktivering af SOCE under disse eksperimentelle betingelser.

Sund og intakt enkelte muskelfibre i kultur viste klar og ensartet striation, ingen tegn på forureninger, og ingen tegn på nedgang-induceret skade. Disse fibre var i stand til at trække sig som reaktion på elektrisk stimulation eller depolariserende løsninger. Under konfokal billeddannelse viste flået fiber indfangning af Rhod-5N farvestof i TT rum, karakteristiske pattedyr dublet mønster (visualized i den røde kanal). Efter læsning af SR med Fluo-5N AM, var den typiske afbrudt SR mønster synligt (i grøn kanal). Efter perfusion af hud fiber med TT / SR lastning opløsning forøget fluorescensintensitet af både Rhod-5N og Fluo-5N, ved perfusion med SR depletion opløsning begyndte niveauer af fluorescens i SR kammeret og TT rum at falde, hvilket indikerer tæt kobling mellem SR Ca2 +-lagre opbrug og SOCE aktivering, henholdsvis (figur 5)..

Figur 1
Figur 1. Aktivering af store-Ca2 +-optagelse (SOCE). Orai1 er en kanal poredannende enhed placeret på plasmamembranen (PM) og STIM1 en Ca2 +-sensor, der er placeret på det endoplasmatiske eller sarcoplasmatisk reticulum (ER / SR) membraner. Når ER / SR Ca2 +-lagre reduceres enten på grund af blokering af ER / SR Ca2 +-pumpe (SERCA) eller Ca2 +-frigivelse via IP 3-receptor eller ryanodine receptor, STIM1 aktiveret. Aktiverede STIM1 molekyler danner patches og inducere aggregering af Orai1, hvilket yderligere fører aktivering af SOCE.

Figur 2
Figur 2. Måling af intracellulær Ca2 + i Kyse-150 celler. Udveksling af ekstracellulær opløsning fra 0 Ca2 + (0,5 mM EGTA) og 2 mM Ca2 + inducerede ikke nogen ændring i intracellulær Ca2 +. 5 uM TG i 0 Ca 2 + badopløsningen induceret passiv ER Ca 2 + frigivelse. Efter ER Ca2 +-lagre blev udtømt (> 10 min), tilsætning af ekstracellulær Ca2 + (2 mM) aktiveres en vedvarende intracellulær Ca2 + lodret gennem SOCE, som kan blokeres af SOCE inhibitorer, fx SKF-96.365 og 2 - APB (data ikke vist). Celler transficeret med plasmider indeholdende shRNA specifikt modorai1 (rød) viste signifikant reduceret SOCE end celler transficeret med scramblesekvens (sort).

Figur 3
Figur 3. Mn2 + quenching assayet SOCE i Kyse-150 celler. Quenching af Fura-2-fluorescens ved Mn2 + (0,5 mM) blev målt ved Ca2 +-uafhængig excitationsbølgelængde på Fura-2 (360 nm). Cellerne blev behandlet med 5 pM TG i 10 minutter til fuldstændig nedbryder ER Ca 2 + butikker. Henfald Hældningen af Fura-2 fluorescens efter Mn2 + tilsætning (stiplede linier, indenfor de første 10 sek) repræsenterede aktivering af SOCE, der blev udtrykt som procent reduktion i fluorescens pr tidsenhed (den oprindelige værdi som 100%). Den maksimalt bratkølede fluorescenssignal blev etableret ved slutningen af ​​forsøget ved lysering af cellerne med 0,1% Triton X-100 (som 0%). Celler behandlet med 2-APB (75 uM) viste en meget fladerehældning, hvilket tyder SOCE blokeres af denne forbindelse i Kyse-150-celler.

Figur 4
Figur 4. Gradueret aktivering af SOCE i muskelceller afsløret ved Mn2 + quenching assayet. Aktivering af SOCE kan registreres, medens TG nedbryder SR Ca2 +-lagre. Samtidig anvendelse af Mn2 + (0,5 mM) og TG (20 uM) inducerede en gradueret-og S-formet fald i intracellulært Fura-2-fluorescens (cyan stiplet linie for at vise den hurtigste bratkøling point), der var forskellig fra den første Mn2 + quenching sats (blå streg linje). Mn2 + quenching hældning var næsten det samme som basisniveauet i celler behandlet 2-APB (75 uM), hvilket antyder, at SOCE blev inhiberet.

Figur 5
Figur 5. Rumligt og tidsligt løst SOCE i flået muskelfiber. (A) RhOD-5N-salt blev fyldt i TT og Fluo-5N AM blev fyldt i SR. (B) Efter påføring Ca2 + depletion opløsning faldt fluorescensen i både TT og SR rum. Tabet af Fluo-5N fluorescens angivet hurtigt frigives SR Ca2 +-indholdet og tab af Rhod-5N fluorescens foreslået aktivering af SOCE.

Discussion

Skønt de excitationsbølgelængder for Ca2 +-bindende og Ca2 +-fri Fura-2 er 340 nm og 380 nm, det bedste forhold dynamikområde Fura-2 for Ca2 +-koncentration kan forekomme ved andre bølgelængder i en bestemt mikroskopsystem. Sådanne ændringer i bølgelængden er normalt på grund af ændringer i den optiske vej med tilsætning af forskellige optiske komponenter. I denne undersøgelse blev excitationsbølgelængder for Fura-2 bestemmes som 350 nm og 390 nm ved at udføre spektralanalyse af Fura-2-fluorescens.

Den intracellulære Ca2 +-niveauet i cytosolen resultaterne fra en balance af flere kilder, herunder intracellulære Ca2 +-frigivelse, ekstracellulær Ca2 + indgang, samt Ca 2 + udelukkelsesmekanisme på ER og plasmamembranen. At isolere ensrettede SOC-medieret Ca2 +-indstrømning fra intracellulære Ca2 +-frigivelse og Ca2 + Udvindingusion kan Mn2 + quenching assayet anvendes. Mn2 + vides at være i stand til at trænge ind i celler via SOCE men er uigennemtrængeligt for overflademembranen ekstrudering eller ER optagelse af Ca2 + pumper. Derfor fluorescensundertrykkelse repræsenterer en måling af ensrettet Mn2 + flux i celler, der estimerer graden af aktivering af SOCE. Mn2 + quenching assayet udføres på det isosbestiske punkt, ved en sådan bølgelængde Fura-2 fluorescensintensitet er uafhængig af Ca2 +-koncentration. Det isosbestiske punkt for hvert system bør bestemmes af spektret scanning. Alternativt kan Mn2 + quenching registreres af justerede fluorescens ved enhver to bølgelængder på en sådan måde, at den endelige værdi er uafhængig af Ca2 +-koncentration 13.

For at få den rumlige og tidsmæssige oplysninger om aktivitet SOCE i skelet muskler, vi ansat en dobbelt-farvestof metode, der giver mulighed for samtidig Måleperiodent af SOCE aktivitet og SR Ca2 +-indholdet i isolerede voksne mammale EDL muskelfibre. Korrelationen mellem ændringer i SR Ca2 +-indholdet og SOCE aktivitet kan afbildes at angive tærsklen og følsomheden af SOCE aktivering til nedbrydning af SR Ca2 + opbevaring. TT-loading opløsning optimeret til yderligere indlæse T-tubuli med Ca2 + og til priming af T-tubuli og SR-lastning løsning er designet til at fremme maksimal SR Ca2 +-lastning og yderligere indlæse T-tubuli med ~ 500 uM Ca2 +. FCCP er inkluderet i TT / SR-loading opløsning og SR-depleterende opløsning for at fjerne effekter fra mitokondrier.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Noah Weisleder for læsning og redigering af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af Research Grants UMDNJ Foundation 62-09 til ZP, American Heart Association SDG2630086 til xz, 0535555N til MB, og National Institutes of Health RC2AR058962-01 til MB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Mediatech 10-040-CV
Ham's F-12 Mediatech 10-080-CV
DMEM Mediatech 10-013-CV
Glass Bottom Dish MatTek P35G-1.5-14-C
Fura-2 AM Invitrogen (Molecular Probes) F1221 -20 °C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO
Fluo-5N AM Invitrogen (Molecular Probes) F14204 -20 °C, seal tight, protected from light
Rhod-5N Invitrogen (Molecular Probes) R14207 -20 °C, seal tight, protected from light
Quartz Cuvette Starna Cells 3-Q-10
thapsigargin Tocris 1138
2-Amin–thoxydiphenylborane (2-APB) Tocris 1224
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) Sigma-Aldrich 435600
Collagenase Type I Sigma C0130

Equipment:

  1. A spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): xenon arc lamp, computer-controlled high-speed random access monochromator, cuvette-based emission monochromator, Nikon TE-200 inverted fluorescence microscope, S Fluor 40x/1.30 oil objective, PMT detectors.
  2. Laser Scanning Confocal Microscope (BioRad Radiance2100): argon laser 453/477/488/514, HeNe laser 543nm, Nikon TE2000 inverted microscope, 60X objective (N.A. 1.4, oil).
  3. A stereomicroscope with a magnification power > 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Parekh, A. B., Putney, J. W. Jr Store-operated calcium channels. Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).
  2. Ma, J., Pan, Z. Retrograde activation of store-operated calcium channel. Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).
  3. Feske, S. ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond. Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).
  4. Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
  5. Pan, Z. Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29. Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).
  6. Shin, D. W. A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).
  7. Ma, J., Pan, Z. Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells. Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).
  8. Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor. J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).
  9. Hirata, Y. Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes. Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).
  10. Zhao, X. Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice. Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).
  11. Zhao, X. Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor. J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).
  12. Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).
  13. Shuttleworth, T. J. Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell. Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics