Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus E13-Mäusen

Neuroscience
 

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus fötalem Rückenmark und gehalten in vitro entweder für die Transplantation oder für die Untersuchung von oligodendrocytic Linie.

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Phillips, A. W., Falahati, S., DeSilva, R., Shats, I., Marx, J., Arauz, E., Kerr, D. A., Rothstein, J. D., Johnston, M. V., Fatemi, A. Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice. J. Vis. Exp. (64), e3462, doi:10.3791/3462 (2012).

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Abstract

Dies ist ein Protokoll für die Ableitung von Gliazellen eingeschränkten Vorläufer (GFK) Zellen aus dem Rückenmark von E13 Maus-Föten. Diese Zellen sind in der frühen Vorläufer oligodendrocytic Zelllinie. In jüngster Zeit wurden diese Zellen als potentielle Quelle für die restaurative Therapien in der weißen Substanz Krankheiten untersucht worden. Periventrikuläre Leukomalazie (PVL) ist die führende Ursache für nicht-genetische Erkrankung der weißen Substanz in der Kindheit und betrifft bis zu 50% der extrem unreifen Frühgeborenen. Die Daten deuten auf eine erhöhte Anfälligkeit des sich entwickelnden Gehirns zu Hypoxie-Ischämie, oxidativen Stress und Exzitotoxizität, der selektiv auf entstehende weiße Substanz. Glial eingeschränkten Vorläufer (GFK), Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) und unreifen Oligodendrozyten (preOL) scheinen wichtige Akteure bei der Entwicklung von PVL sein und sind Gegenstand weiterer Untersuchungen. Darüber hinaus haben jüngste Untersuchungen eine Teilmenge von ZNS-Gewebe, die Empfindlichkeit erhöht hat, um Exzitotoxizität als Glutamat identifiziertsowie ein Entwicklungsmuster zu dieser Anfälligkeit. Unser Labor untersucht derzeit die Rolle der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen in PVL und Nutzung Zellen an der GFK-Stadium der Entwicklung. Wir verwenden diese abgeleitet GFK-Zellen in verschiedenen experimentellen Paradigmen, um ihre Reaktion auf Belastungen im Einklang mit PVL wählen zu testen. GFK-Zellen können in vitro in OPCs und preOL werden für die Transplantation Experimenten mit Maus PVL-Modelle und in vitro-Modelle von PVL-ähnliche Beleidigungen einschließlich Hypoxie-Ischämie manipuliert. Durch die Verwendung von kultivierten Zellen und in vitro Studien gäbe Variabilität zwischen Experimenten, die Interpretation der Daten erleichtert reduziert werden. Kultivierte Zellen ermöglicht auch für die Anreicherung des GRP Bevölkerung bei gleichzeitiger Minimierung der Auswirkungen von kontaminierenden Zellen von nicht-GFK-Phänotyp.

Protocol

Einführung

In diesem Protokoll zeigen wir, wie zu extrahieren, wählen und Glia-Platte eingeschränkten Vorläufer (GFK) Zellen aus dem Rückenmark von E13 Maus-Föten. Diese Zellen sind frühe Vorläufer innerhalb der oligodendrocytic und astrozytären Zelllinien und zeichnen sich durch ihre Expression von A2B5 definiert. In der GFK-Medium mit FGF-2 ergänzt, werden die A2B5 + GRPs beginnen Ausdruck der frühen oligodendrocytic Linie Marker PDGFαR und NG2 1,2. Diese Linie Oligodendrozyten Zellen durchlaufen eine Reihe von unterschiedlichen phänotypischen Stufen, jede von ihnen durch morphologische Veränderungen, sowie Expression von Markern für bestimmte Entwicklungsstadien gekennzeichnet.

Diese Vorläuferzellen werden derzeit als potentielle Quelle für Zell-basierte Therapieansätze bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems weißen Substanz, einschließlich Multiple Sklerose, Leukodystrophien und periventrikuläre Leukomalazie (PVL) 3,4,5,6 studierte 6,7,8,9 berichtet. Diese glialen Vorläuferzellen wurden auch in anderen Studien Erkrankung der weißen Substanz Modelle wie Rückenmarksverletzungen und amyotrophe Lateralsklerose 10,11,12,13 verwendet.

Unser Labor hat einen frühen postnatalen Hypoxie-Ischämie Mausmodell, mit denen wir zur Beurteilung der Wirksamkeit dieser Rückenmark abgeleitet GFK-Zellen als eine restaurative Ansatz in PVL, die häufigste Ursache der Zerebralparese 14,15,16 entwickelt werden. Es gibt auch ein Nagetier Gehirn stammenden OPC-Modell, das in großem Maße für das Studium der weißen Substanz Verletzungen verwendet werden, da die GFK-Zellen eine Tendenz, in die Astrozyten-Weg 17 zu differenzieren. Die OPC-Phänotyp hat bereits die Oligodendrozyten Linie Weg, ein Phänomen, das irreve scheint eingegebenenrsible. Wir sind jedoch daran interessiert, die Beurteilung der Reaktion eines breiteren Spektrums von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen einschließlich GRPs und möglicherweise sogar den NEPs bei E10.5 abgeleitet. Aus diesem Grund haben wir das Rückenmark abgeleitet GFK-Modell für unsere Arbeit angenommen.

Neben der Verwendung von GFK zur Zellersatztherapie, erlaubt die Ableitung dieser Zellen von Wildtyp und transgenen Nagetier-Modellen der weißen Substanz Krankheiten weitere Studie glialen Differenzierung unter normalen oder Krankheitszuständen in einem in vitro-Einstellung. Frühere Veröffentlichungen zeigen Beweise für selektive Anfälligkeit von oligodendrocytic Abstammung Vorläuferzellen zu verschiedenen externen Stressoren wie Reifung abhängig Glutamatexzitotoxizität, oxidativer Stress, und wählen Faktoren in Neuroinflammation 18,19 verwickelt. Unsere Studien haben auf das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen hinter der Entwicklung dieser weißen Substanz Verletzungen konzentriert, die Bewertung der Anfälligkeit von Zellen inder Oligodendrozyten-Linie Spektrum zu beleidigen sowie die Analyse putative therapeutische Ansätze.

Materialien

Alle Verfahren, die Tiere entsprechen den PHS-Politik und der JHU IACUC. Alle Verfahren sollte in einem Abzug mit laminarer Strömung durchgeführt werden, um sterilem Zustand zu halten. Üblicherweise Sektionen in einer horizontalen Werkbank und in vitro Arbeit in einer vertikalen Strömung Abzug durchgeführt. Alle verwendeten Medien bei Dissektionen kalt. Die Mäuse in unserer Studie verwendeten sind ein Wildtyp-CD-1-Stamm und ein transgener GFP in einem C57/BL6 Hintergrund. Eine CD-1 Maus Staudamm liefert typischerweise 10 + Föten, die genug, um Samen 1-2 T25-Flaschen sind. Typischerweise werden zwei Dämme zu einer Zeit und fetalen Rückenmark gebündelt und in ein T25-Flasche pro Muttertier überzogen geopfert. Sobald Zellen abgeleitet wurden sie erweitert werden können und dadurch in vitro für nachfolgende Studien.

1. Vorbereitung der Medien und Flaschen

  • GFK-Lager; N2 (100x; Invitrogen) Ergänzungen und Rinderserumalbumin (BSA; 0,5% w / v) DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (Invitrogen 50x): Medium wird als die Dissektion Medium verwendet.
  • Dissoziation Medium: wie Dissektion Medium.
  • Kulturmedium: GFK-Aktie mittel + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) und Heparin (1 pg / ml, Sigma).
  • PLL / Laminin-beschichtete 75 cm 2 oder 25 cm 2-Kolben (T75 oder T25).
  • In destilliertem H 2 O bei 37 ° C für 1 Stunde inkubiert und dann aspiriert; Zellkulturflaschen (75 cm 2, Falcon) mit 15-20μg/ml Poly-L-Lysin (Sigma PLL) beschichtet ist. Die Kolben werden mit PBS 1X dann mit 15-20 ug / ml Laminin (Sigma) in PBS bei 37 ° C für 1 Stunde beschichtet, dann abgesaugt und frisches PBS oder Medium zugegeben, bis die Zellen bereit zu plattierenden sind gewaschen. Nach Beschichtung, sollten Flaschen nie trocknen gelassen werden, sondern kann in PBS oder Medium bei 4 ° C aufbewahrt werden für kurze Zeit vor dem Gebrauch.

2. Instrumente und Other Material

  • Petrischalen: 4 pro Muttertier: 3 Petrischalen für die Dissektion (75 mm), eine 20 mm-Schale zum Auffangen der geernteten Rückenmark.
  • Große Schere (43 mm Betriebstemperatur Schere, Roboz) und chirurgische Pinzette zum Öffnen der Damm s Bauch.
  • Kleinen Schere zum Präparieren der Gebärmutter und das Entfernen der Föten (15 mm Micro Präparierschere, Roboz).
  • Micro Dissecting Frühjahr Schere (6 mm) zu sezieren das Rückenmark der Feten.
  • Micro Dissecting abgewinkelte Pinzetten für die Verankerung des Damms und fetalen Körpers während der Operation und später das Entfernen des Rückenmarks einmal ausgesetzt.
  • 40 oder 70 Mikrometer Zellsieb zur Entfernung von Zelltrümmern vor dem Beschichten.
  • 0,05% Trypsin vorgewärmt auf 37 ° C
  • 10 mg / ml DNAse 1 (Sigma), als 100x Stocklösung hergestellt (1 g / ml).
  • Bio-Hazard-Tasche für Tierkadaver.
  • 15 und 50 ml Zentrifugenröhrchen für die Verarbeitung extrahiert Rückenmark.

3. Bestimmen Timed Pregnancy

Schwangere Maus Dämme sind entweder aus kommerziellen Quellen angeben Lieferung am embryonalen Tag E12 oder E13 der Entwicklung des Fötus oder der Schwangerschaft im Haus bestimmt bestellt. Kurz gesagt, werden zwei Weibchen zusammen mit einem Männchen in den späten Nachmittag gelegt und über Nacht zusammen. Am nächsten Tag die Weibchen werden auf das Vorhandensein des vaginal entfernt Schleim Plug beobachtet. Der Schleim-Stecker ist nur ein Indiz dafür, dass so Paarung Tiere werden gewogen, anschließend täglich zu Rate der Gewichtszunahme überwachen aufgetreten. Der Tag der Schleim Plug beobachtet wird, wird als embryonaler Tag eins (E1) definiert.

4. Tissue Ableitung

  1. Die Arbeiten im Rahmen einer horizontalen Strömung Haube zu aseptischen Bedingungen aufrecht zu erhalten.
  2. Sprühen Sie die Haube und Arbeitsbereich mit 70% Ethanol.
  3. Autoklav Instrumente oder Spray großzügig mit 70% Ethanol.
  4. Bereiten Sie Instrumente, Medien und Mikroskop zum Einsatz.
  5. Gießen Sie 20 ml kaltem Dissektion Medium in sterile Petri-dish.
  6. Tier betäuben mit Chloralhydrat (500 mg / kg) intraperitoneal (IP) durch Genickbruch oder Enthauptung folgten.
  7. Sprühen Sie den Bauchbereich des Dammes mit 70-90% Ethanol (Desinfektion)
  8. Öffnen Bauch mit großen Scheren und Pinzetten.
    1. In CD1 und C57/BL6 Stämme: In der Regel 8 bis 14 Föten wird in der Gebärmutter sein. Die Zahl der Föten ist Belastung abhängig.
  9. Entpacken Sie die Maus Gebärmutter einschließlich der Welpen und in frischem, kaltem Dissektion Medium in einem sauberen Petrischale, um Blut und Gewebereste von Fötus zu waschen.
  10. Extrahieren Sie jede Fötus aus dem Uterus-Horn und trennen sie von der embryonalen SAC und der Plazenta über die kleine Schere. Übertragen Sie die extrahierten Föten an die frische Dissektion Medium in eine neue Petrischale.
    1. Dissection Medium sollte bei niedriger Temperatur zu senken und metabolische Aktivität zu bewahren Lebensfähigkeit der Zellen abgeleitet sein.
    2. Arbeiten Sie ab jetzt mit zwei Zangen undMikro Sezieren Feder-Schere.
  11. Das Arbeiten unter Dissektionsmikroskop, schneiden Sie die Haut entlang des Rückenmarks mit den Mikro-chirurgische Scheren und schälen Haut zurück, um das Rückenmark freizulegen.
  12. Durchschneiden die mit dem Rückenmark mikrochirurgischen Schere zu C1 und zu Beginn des Schwanzes.
  13. Entfernen Sie das Rückenmark mit stumpfen Pinzette, sicherzustellen, dass alle Knochen und Knorpel entfernt werden und Transfer zum 3 rd Petrischale zu sezieren Medium.
  14. Um übermäßiges Wachstum von meningealen Gewebe in den folgenden Zellkulturen zu verhindern versuchen, so viel von den Hirnhäuten wie möglich aus dem Rückenmark zu entfernen. Aufgrund der im Entstehen begriffenen überstehenden peripheren Nerven ist dies schwieriger als das Entfernen meningealen Gewebe extrahiert aus Großhirn.
  15. Sobald Hirnhäute entfernt worden sind, übertragen Rückenmark bis 20 mm Petrischale
  16. Clean up durch gründliches Besprühen Sie den Bereich mit 70-90% Ethanol.
  17. Die folgenden Schritte für die Dissoziation sollte schnell erfolgen, um zu halteneine hohe Rentabilität der abgeleiteten Gewebe des Rückenmarks.

5. Kultur Establishment

  1. Trypsin sollte für mindestens 30 min in einem 37 ° CH 2 O-Bad vorgewärmt werden. Ein geeignetes Aliquot sollte aus dem Bestand entfernt werden, um die Exposition der Lager gegenüber Temperaturschwankungen zu reduzieren.
  2. Übertragen Sie die geernteten Rückenmark zu einem 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 10 ml vorgewärmter Trypsin (0,05%; Qualität Biologicals) und 100 ul DNAse (10 mg / ml) und kurz verreiben.
  3. Inkubieren bei 37 ° CH 2 O-Bad für 10 Minuten.
  4. Verreiben und inkubieren Sie für weitere 10 min.
  5. 5 ml Medium GFK (oben definiert) und Zentrifuge für 5 min bei 1000 RPM.
  6. Absaugen des Überstandes und Pellet erneut mit 10 ml Medium GFK und fügen DNAse-1 (10 mg / ml, Sigma).
  7. Inkubieren bei 37 ° CH 2 O-Bad für 10 Minuten.
  8. Zentrifugieren 5 min bei 1000 RPM und Absaugen des Überstandes.
  9. Pellet mit fresh GFK-Medium dann Filter Trümmer mit einem 40 - 70 um Zellsieb.
  10. Plate auf PLL / Laminin beschichtete 25 cm 2-Kolben (T25) und Inkubation bei 37 ° C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO 2.
  11. 100% ändern Medien auf folgenden Tages.
  12. An dieser Stelle haben GRPs befestigt und begann sich Prozesse.

6. Immunopanning die GFK Bevölkerung

  1. Platte Rückenmark in PLL / Laminin beschichtete Kolben, bis Kolben ist 85-90% konfluent oder etwa eine Woche.
  2. Ernten Sie die Zellen durch Abschaben Kolben mit einem Gummi-oder Polizist mit 0,05% Trypsin, gründlich, aber sanft verreiben, bei 1000 rpm für 5 min und gründlich Pellet mit 3 ml Medium GFK zentrifugieren.
  3. Übertragen Sie jeweils 1 ml bis 3 T25-Flaschen oder 3 ml bis 1 T75-Flasche hinzu entsprechende Volumen des Mediums vollständig zu bedecken Zellen und ermöglichen Flaschen auf 80-90% Konfluenz erreichen.
  4. Ändern Medien jeden zweiten Tag, früher, wenn Medium erschöpft schnell.
  5. Coat Bakteriologische PeTri Gerichte (75 mm) über Nacht bei 4 ° C mit einem Anti-Maus-IgM-Antikörper (Southern Biotech), 10 pg / ml in PBS.
  6. Absaugen des überschüssigen Puffer und waschen Sie die Petrischalen 3x mit PBS.
  7. In A2B5-Antikörper (Millipore) bei einer Konzentration von 5 mg / ml in PBS und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur (RT) verdünnt.
  8. Waschen Sie Platten erneut 3x mit PBS fügen Sie dann 8 ml GFK Medium zu verhindern Austrocknen der Platte.
  9. Übertragen Sie 5 ml Medium aus GFK Petrischalen und Ernte GFK-Zellen durch Abschaben Kolben mit einem Gummi-Polizist, um alle Zellen zu lösen
  10. Man reibt Zellsuspension kurz zu brechen Klumpen und übertragen 5ml Zellsuspension zu den A2B5 beschichteten bakteriologischen Petrischalen.
  11. Inkubieren 1 Stunde bei Raumtemperatur ohne Schütteln.
  12. Nach 1 Stunde absaugen Medien und Wäsche Platte 8x mit PBS.
  13. Vorsichtig kratzen Zellen mit einem Gummiwischer in 2 ml GFK Medien dann auf PLL / Laminin beschichteten Platten oder Kolben übertragen mit entsprechenden Volumen von GFK-Medium.

    7. Einfrieren und Lagern von abgeleiteten Zellen

    1. Die Zellen werden aus einer 85-90% konfluent T25 oder T75-Kolben mit 2 ml 0,05% Trypsin geerntet.
    2. Trypsin wird verdünnt und mit 8 ml GFK Lager Medium inaktiviert und zentrifugiert bei 1000 UpM für 5 min.
    3. Pellets aus T25-Flaschen werden in 1 ml GFK Einfriermedium, (GFK Lager-Medium mit 10% (v / v) DMSO und gegebenenfalls, 20% FBS), resuspendiert. Die größeren Pellets aus T75-Flaschen werden verdünnt zweifach.
    4. Zellsuspensionen von 1,5 - 3 × 10 10,11,12,13 Zellen werden Kryoröhrchen (Nalgene) überführt und über Nacht in einem kryogenen Behälter (Nalgene), das Isopropanol bei -80 ° C bis langsam einfrieren über Nacht gelagert.
    5. Nach über Nacht Einfrieren Zellen werden zu Tiefkühlboxen übertragen und dort gespeichert 6 Monate bis 1 Jahr bei -80 ° C oder längerfristig in N (l). Aufgetauten Zellen sind typischerweise 60-80% lebensfähig ist weitgehend abhängig von der Qualität des PLL / Laminin beschichtet.
    6. 8. Repräsentative Ergebnisse

      CO 2 ist nicht für die Betäubung des Tieres wegen der möglichen nachgelagerten Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Föten und letztlich der abgeleiteten Zellen verwendet. Darüber hinaus wird es sehr schwierig sein, völlig entfernen Sie die Meningen aus dem Rückenmark bei der Ableitung Prozedur aber die Kombination von GfK mittel-und Immunopanning wird diese schnell wachsende Zellen zu eliminieren. In ähnlicher Weise wird die gesamte Wirbelsäule trotz einer größeren Konzentration des ventralen GFK Bevölkerung aufgrund seiner Ursprung in der ventralen Rückenmark und Migration dorsal 20 geerntet. Aber das GFK-Medium wählt für die GFK-Phänotyp und dass die Bevölkerung wird durch A2B5 Immunopanning maximiert. Nach dem Ausplattieren Rückenmarkgewebes, werden die in vitro-Kulturen für zwei Kanäle oder über eine Woche inkubiert. Nach 2 Tagen in Kultur, kann Zellen unterschiedlicher Morphologien in den Gewebekulturflaschen Angabe der Heteroatome beachtenHomogenität der Bevölkerung, sondern der GFK Medium wählt für die GFK-Phänotyp. Diese Zellen sind eine Kombination von A2B5 + GFK, E-NCAM + neuronalen eingeschränkten Vorstufen (NRP) und Nestin +, A2B5-Neuroepithelzellen und möglicherweise Fibronectin + meningealen Zellen. Darüber hinaus reiferen Phänotypen vorliegen können auszudrücken Marker einschließlich Doublecortin und Tuj1 für die neuronale Linie, GFAP für Astrozyten und PDGFaR und GalC für Oligo-Linie Um eine hoch angereicherte GFK Bevölkerung aus dem Ausgangsmaterial heterogener Pool (Abbildung 1A) zu maximieren, können Zellen sein Doppel-immunopanned zu wählen und die Beseitigung der E-NCAM +-Zellen durch Selektion auf dem A2B5 gefolgt + GFK Bevölkerung einmal Zelldichte zu etwa 85-90% Konfluenz in T75-Flaschen erhöht hat. Diese GFK Zellen ihre Fähigkeit, Astrozyten werden, obwohl er in einem Medium, das für die Oligodendrozyten Phänotyp selektiert so dass nachfolgende A2B5 Immunopanning kann notwendig sein, eine hoch angereichertes GFK Bevölkerung zu erhalten. Immunopanning GenerVerbündeter Ausbeuten von bis zu 95% A2B5 +-Zellen, jedoch für eine noch größere Ausbeute A2B5 konjugierten magnetische Kügelchen (Miltenyi Biotec GmbH) verwendet werden, um eine Ausbeute von bis zu 97% bereitzustellen. Wachsamkeit bei der Wartung GRP Kulturen wie zum Beispiel regelmäßige Medien-Änderungen werden minimiert die Verbreitung von nicht-GFK Zelltypen. Selbst in Abwesenheit von BMP-4 Astrozyten noch gefunden und erschöpft Medien Insbesondere scheint Differenzierung zu Astrozyten Phänotyp zu induzieren. Obwohl die B27 Ergänzung enthält Triiodthyronin Hormon (T3), gab es keine beobachteten Tendenz, in Oligodendrozyten im GFK Bevölkerung zu unterscheiden, nur dann, wenn höhere Konzentrationen von T3 zu dem Medium zugegeben dieses Phänomen auftritt. Jedoch kann ein T3 freien B27 Ergänzung substituiert, wenn es ein Problem für Kontamination durch reife Oligodendrozyten (1B) werden. Diese GFK-Zellen können leicht durch ihre Morphologie der kleinen Soma mit 2 oder 3 kurze Prozesse, sondern auf dem Bildschirm für andere Zelltypen, die vorhanden sein können, im identifiziert werdenmunocytochemistry kann zu dem zuvor benannten gemeinsamen Entwicklungs-und Zelltyp-spezifische Marker durchgeführt werden. Es wird üblicherweise eine kleine Population von persistenten A2B5-Zellen, die neuro-(NEP) und in der Lage zu entweder GFK oder NRP sind. Glücklicherweise sind die Zellen länger in der GFK-Medium, desto wahrscheinlicher, dass Medium wird für die GFK-Phänotyp wählen gepflegt.

      Abbildung 1.

      Abbildung 1. A) Plated Rückenmark Zellen der heterogenen Morphologie sind nach 2 Tagen in Kultur beobachtet. B) Immunopanning eine hoch angereicherte GFK Bevölkerung maximiert vom Ausgangspunkt heterogenen Pool.

Discussion

Disclosures

Diese Studie wurde vom National Institute of Health [NICHD P30HD024061 (AWP), NINDS K08NS063956 (AF), und R01NS028208 (MVJ)] und der Kinderneurologie Foundation finanziert. Der Inhalt dieses Berichts sind allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Institute of Health, DHHS. Die Autoren haben keine Interessenkonflikte relevant zu dieser Studie.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Devin Gary für seine Einsicht und Feedback danken für die Verwendung von GFK-Zellen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/ F12 1:1 Invitrogen 11320033
B27 Invitrogen 17504044
N2 Invitrogen 17502048
rH-FGF-basic Invitrogen PHG0026
Trypsin (0.05%) EDTA Quality Biological, Inc. 118-087-721
POLY-L-LYSINE HBr Sigma-Aldrich P1274-25MG
Laminin Sigma-Aldrich L2020-1MG
Dnase 1 Sigma-Aldrich DN25

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