从E13小鼠胶质限制前体的推导

Neuroscience
 

Summary

该协议概述从胎儿的脊髓神经胶质细胞的限制性前体推导,并保持在体外移植或oligodendrocytic谱系研究。

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Phillips, A. W., Falahati, S., DeSilva, R., Shats, I., Marx, J., Arauz, E., Kerr, D. A., Rothstein, J. D., Johnston, M. V., Fatemi, A. Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice. J. Vis. Exp. (64), e3462, doi:10.3791/3462 (2012).

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Abstract

这是一个胶质禁区前体(GRP)从E13小鼠胎儿的脊髓细胞衍生的协议。这些细胞是内的oligodendrocytic的细胞系的早期前兆。最近,这些细胞进行了研究脑白质疾病的恢复治疗的潜在来源。脑室周围白质软化症(PVL)是在童年的非遗传性脑白质疾病的首要原因,影响极早产儿的50%。这些数据表明了发育中的大脑缺血缺氧,氧化应激和兴奋,有选择性地针对新生的白质的提高的敏感性。胶质禁区前体(GRP),少突胶质祖细胞(OPC)和未成熟的少突胶质细胞(preOL)似乎是在PVL的发展的关键球员,并有继续研究的主题。此外,以往的研究已经确定了中枢神经系统组织的一个子集,易感性增加谷氨酸作为一个发展模式,这种易感性。我们的实验室目前正在调查在玻璃钢的发展阶段,在PVL的和使用的细胞少突胶质祖细胞的作用。我们利用这些派生的玻璃纤维细胞中的几个实验范式,以测试他们的反应,选择一致的应力和PVL。玻璃纤维细胞可以操纵OPCs的和preOL将在体外用鼠标PVL的模型和PVL的类似的侮辱,包括缺血缺氧的体外模型移植实验。利用培养的细胞, 在体外研究有实验,有利于对数据的解释之间的变异性将减少。培养的细胞,也允许GRP的人口富集,同时最大限度地减少污染的非玻璃钢型细胞的影响。

Protocol

介绍

在这个协议中,我们展示如何提取,选择和板从E13小鼠胎儿的脊髓神经胶质限制易制毒化学(GRP)的细胞。这些细胞内oligodendrocytic和星形细胞系的早期前兆,并通过他们表达A2B5定义。在玻璃纤维介质与FGF-2的补充,A2B5 +的GRPS将开始表达早期oligodendrocytic宗族标记PDGFαR和NG2 1,2的 。这些胶质细胞的细胞系,通过一系列不同表型的阶段,他们每个人特点是形态的变化,以及表达的特定发展阶段的标志。

作为一个基于细胞的治疗方法,在中枢神经系统白质疾病,包括多发性硬化症,leukodystrophies和脑室周围白质软化症(PVL)3,4,5,6的潜在来源,目前正在研究这些前体细胞6,7,8,9成功的髓鞘。这些胶质前体细胞也被用在其他白质疾病,如脊髓损伤和肌萎缩性侧索硬化症10,11,12,13模型的研究。

我们的实验室已开发的早期产后缺氧缺血小鼠模型,我们正在评估在PVL的,脑瘫14,15,16领导的事业的恢复方法推导出玻璃纤维细胞脊髓的疗效。还有啮齿类动物的脑源性OPC模型已被广泛用于研究脑白质损伤以来GRP细胞有一种倾向,分化成星形细胞通路17。已经进入的OPC型胶质细胞谱系通路,现象​​似乎irreve的rsible。然而,我们感兴趣的是在评估的少突胶质祖细胞,包括GRPS,甚至可能在10.5天所得的非符合资格人士的广泛响应。出于这个原因,我们采取了脊髓,为我们的工作得到玻璃钢模型。

除了 ​​细胞替代使用的GRPS,这些细胞脑白质疾病从野生型和转基因啮齿动物模型的推导允许胶质细胞分化, 在体外设置正常和疾病条件下进一步研究。以前的出版物表明选择性的oligodendrocytic系前体细胞的成熟依赖的谷氨酸,氧化应激,神经发炎18,19牵连的选择因素等各种外部压力的脆弱性的证据。我们的研究都集中在背后的发展,这些白质损伤的细胞和分子机制的了解,评估细胞的敏感性,在胶质细胞谱系谱侮辱以及分析公认的治疗方法。

物料

所有涉及动物的程序符合PHS政策和约翰霍普金斯大学IACUC。所有程序应在层流罩,以保持无菌条件下进行。常用解剖是在横流罩和垂直流罩在体外工作。所有媒体都用冷在解剖。在我们的研究使用的小鼠的CD-1株野生型和在(C57/BL6)背景的转基因绿色荧光蛋白。通常一个CD-1小鼠大坝产生10 +的胎儿,这是足够的种​​子1-2的T25瓶。通常情况下,两个水坝牺牲汇集成1的T25每大坝瓶镀的时间和胎儿的脊髓。一旦细胞已被他们可扩展,并随后的研究体外特点推导。

1。媒体和烧瓶的准备

  • 玻璃钢股票夹层培养基:DMEM培养基/ F12键1:1(Invitrogen公司)+ B27的(50倍; Invitrogen公司)N2(100倍; Invitrogen公司)的补充和牛血清白蛋白(BSA的0.5%W / V)作为介质。
  • 解离介质:夹层介质相同。
  • 培养基:GRP股票介质+ FGF-2(10-20毫微克/毫升; Invitrogen公司)和肝素(1微克/毫升;西格玛)。
  • PLL /粘连涂层75厘米或25厘米的T75或T25)2瓶(。
  • 组织培养瓶(75厘米2,猎鹰)15-20μg/ml聚-L-赖氨酸(PLL;西格玛)在蒸馏水中H 2 O在37°C孵育1小时,然后吸气,涂上。瓶洗然后涂上15-20微克/毫升层粘连蛋白(Sigma公司)在PBS PBS在37°C,1小时,然后吸气,新鲜的PBS或媒体说,直到细胞准备是镀1X。继涂层,瓶不应该被允许干,但可以在PBS或媒体保持在4°C使用前的短暂。

2。仪器和另一个M动脉插管

  • 培养皿:4个水坝:3 Petri网的解剖菜(75毫米),为20毫米收集收获脊髓的菜。
  • 大剪刀(43毫米操作剪刀,Roboz)和组织钳开放大坝的腹部。
  • 小剪刀,解剖子宫,取出胎儿(15毫米微型解剖剪刀,Roboz)。
  • 微弹簧剪刀解剖(6毫米),解剖胎儿的脊髓。
  • 微解剖直角钳,锚定在手术过程中的大坝和胎儿身体后取出脊髓一旦暴露。
  • 40或70微米电镀前去除细胞碎片,细胞过滤。
  • 0.05%胰蛋白酶预热至37°C。
  • 10 mg / ml的DNA酶1(Sigma公司),作为100X股票准备(1克/毫升)。
  • 生物危害动物尸体袋。
  • 15日和50毫升处理的离心管中提取的脊髓。

3。确定定时箴egnancy

孕鼠水坝下令从E12的胚胎一天或胎儿发育怀孕或内部确定的区块E13指定交付的商业来源。简单地说,两女都放在一起在傍晚的男性一起离开一夜之间。第二天观察女性的阴道位于粘液栓的存在。粘液栓只是一个迹象表明,交配发生,使动物其后体重每天监测的增重率。被定义为胚胎的第一天(E1)的粘液栓观察一天。

4。组织推导

  1. 横流罩下工作,以保持无菌条件下。
  2. 喷用70%乙醇的发动机罩和工作区。
  3. 反应釜工具或喷雾用70%乙醇宽松。
  4. 准备使用的工具,媒体和显微镜。
  5. 20毫升冷夹层培养基倒入无菌的Petri DISH。
  6. 麻醉与水合氯醛腹腔注射(IP)的颈椎脱位或斩首(500毫克/千克)的动物。
  7. 大坝腹部喷洒70-90%的乙醇(消毒)
  8. 打开腹部大剪刀和镊子。
    1. 在CD1和(C57/BL6)菌株:一般8至14胎儿会在子宫内。对胎儿的数量是依赖应变。
  9. 提取包括幼仔和地方在一个干净的培养皿中鲜冷夹层介质洗从胎儿血液和组织碎片小鼠子宫。
  10. 每个胎儿从子宫角的提取和使用小剪刀,他们从胚胎囊和胎盘分离。新鲜夹层介质转移到一个新的培养皿中提取的胎儿。
    1. 夹层介质应该是在低温条件下,降低代谢活动和维护源性细胞的可行性。
    2. 与两钳,从现在开始微解剖弹簧剪刀。
  11. 在解剖显微镜下工作,削减皮肤沿微型手术剪,剥离皮肤暴露脊髓与脊髓。
  12. 关于C1的显微剪刀和尾巴开始在横切的脊髓。
  13. 钝钳取出脊髓,确保所有骨骼和软骨被删除,并转移到第三夹层介质的Petri菜。
  14. 为了防止在随后的细胞培养脑膜组织过度生长,尝试从脊髓脑膜尽可能的。由于新生突出的末梢神经,这是比从大脑中提取的脑膜组织更加困难。
  15. 一旦已被删除脑膜,脊髓转移至20毫米培养皿
  16. 清理彻底喷涂面积70-90%的乙醇。
  17. 分离以下步骤应迅速完成维护一个派生的脊髓组织的高生存能力。

5。文化建设

  1. 胰蛋白酶应该被预温在37°CH 2浴至少30分钟。应去掉一个适当的等分,从股票,股票的风险,以减少温度波动。
  2. 收获的脊髓转移50 mL离心管中10毫升预热的胰蛋白酶(0.05%;质量生物)和100μLDNA酶(10毫克/毫升),并简要地磨碎。
  3. 在37℃孵育的CH 2浴10分钟的O型。
  4. 磨碎和孵化另一个10分钟。
  5. 加入5毫升玻璃钢中型(定义见上文)和1000 RPM离心5分钟。
  6. 10毫升的玻璃钢中型吸上清,重悬沉淀,并加入DNA酶-1(10毫克/毫升;西格玛)。
  7. 在37℃孵育的CH 2浴10分钟的O型。
  8. 在1000 rpm离心5分钟,吸出上清液。
  9. 重悬浮颗粒与频率SH玻璃纤维介质过滤器碎片40 - 70微米的细胞过滤。
  10. 钢板上涂25厘米2瓶(T25),并于37°C,湿度95%和5%CO 2的PLL /粘连。
  11. 100%的媒体在翌日更改。
  12. 在这一点上,GRPS连接,并开始扩大进程。

6。 Immunopanning的玻璃钢人口

  1. PLL /粘连,直至烧瓶瓶涂层板脊髓组织是85-90%汇合或一个星期左右。
  2. 收获细胞刮瓶用橡皮警察或0.05%胰蛋白酶,彻底磨碎,但轻轻地,在1000转速为5分钟,彻底重悬沉淀3毫升玻璃钢中型离心。
  3. 每次1毫升转移的T25 3瓶或3毫升到1的T75烧瓶,加入适当体积中等,完全覆盖细胞,使烧瓶达到80-90%汇合。
  4. 改变媒体的每一天,迟早如果介质消耗很快。
  5. 大衣细菌PE三菜(75毫米),4℃过夜,抗小鼠IgM抗体(南方生物技术),10微克/毫升的PBS。
  6. 吸干多余的缓冲区,并用3倍的PBS的培养皿。
  7. 添加浓度为5微克/毫升稀释在PBS孵育1小时在室温(RT)A2B5抗体(Millipore公司)。
  8. 再次用PBS 3倍的盘子洗净,然后加入8毫升玻璃纤维介质,以防止干燥板。
  9. 转让5毫升玻璃钢中型刮瓶用橡皮警察分离所有细胞从培养皿和收获的GRP细胞
  10. 磨碎细胞悬液简要分手团块和转移5毫升细胞悬液涂的A2B5细菌培养皿。
  11. 1小时在室温下孵育无晃动。
  12. 1小时后抽吸媒体和洗涤板用PBS 8X。
  13. 橡胶警察在2毫升玻璃钢媒体轻轻刮去的细胞,然后转移到适当的音量与玻璃钢中型PLL /粘连涂层板或瓶。

    7。源性干细胞的冷冻和储存

    1. 从85-90%汇合的T25或T75瓶2毫升0.05%胰蛋白酶细胞收获。
    2. 胰蛋白酶稀释和灭活与8毫升GRP股票介质和离心5分钟在1000转。
    3. 的T25瓶的颗粒悬浮于1毫升玻璃钢冷冻介质(玻璃钢股票的1​​0%(V / V)的DMSO和选择性,20%胎牛血清培养基补充)。较大颗粒的T75瓶稀释2倍。
    4. 1.5 - 3×10 10,11,12,13细胞的细胞悬液转移到低温瓶(NALGENE),并储存在低温容器异丙醇-80°C至慢慢冻结隔夜(NALGENE)过夜。
    5. 继隔夜冷冻细胞被转移到冷冻箱,6个月至1年,并保存在-80°C或较长期的N(L)。解冻的细胞通常是可行的60-80%的PLL /粘连涂层的质量在很大程度上取决于。
    6. 8。代表结果

      CO 2用于麻醉的动物,因为可能对下游影响胎儿和最终源性细胞的可行性。此外,这将是非常困难的推导过程中,从脊髓脑膜完全消除,但玻璃钢介质和immunopanning的的结合,将消除这些快速生长的细胞。同样,尽管整个脊髓收获更大的GRP人口,由于其起源于脊髓腹侧和迁移背侧20腹侧浓度。然而,玻璃钢中型选择玻璃钢型,人口由A2B5 immunopanning最大化。电镀脊髓组织后, 在体外培养,培养两个段落或一个星期左右。经过2天的文化,不同形态的细胞,可以观察到,在组织培养瓶,表明异质geneity的人口,但玻璃钢中型玻璃钢型选择。这些细胞是一种组合A2B5 +玻璃钢,电子NCAM的神经禁区前体(NRP)和nestin +,A2B5,神经上皮细胞,并可能纤维连接蛋白+脑膜细胞。此外,更加成熟的表型可能是目前表达的标记,包括Doublecortin的神经谱系Tuj1,星形胶质细胞GFAP和PDGFaR和GALC寡血统,为了最大限度地从开始的异构池( 图1A)高度的玻璃纤维丰富的人口,细胞双immunopanned的选择和淘汰的E-NCAM的细胞选择为A2B5 +玻璃钢的人口,一旦细胞密度已增至约85-90%汇合的T75瓶。这些玻璃纤维细胞保持他们的能力,尽管在少突胶质细胞的表型选择的媒介,因此后续A2B5 immunopanning可能有必要保持高度丰富的玻璃钢人口成为星形胶质细胞。 immunopanning产生盟友收益率高达95%A2B5 +细胞,但更大的产量,A2B5共轭磁珠(美天旎生物技术公司)可以用来提供高达97%的产量。在常规介质的变化,如维修玻璃钢文化的警惕,将最大限度地减少非玻璃纤维细胞类型的细胞增殖。即使在没有BMP-4星形胶质细胞可能仍然被发现和贫化媒体似乎特别星形细胞表型诱导分化。虽然B27的补充包含三脱碘激素(T3),有没有观察到的趋势分化成少突胶质细胞在GRP人口,只有当更高水平的T3添加到中期,这一现象发生。然而,在T3免费B27的补充,可以取代的,如果有一个成熟的少突胶质细胞( 图1B)污染的关注。这些玻璃纤维细胞可以很容易地确定其形态与2个或3个短流程的小SOMA但屏幕上的其它类型的细胞可能存在的,IM可以munocytochemistry以前命名的共同发展和细胞类型的特定标志。通常会是一个小A2B5-细胞,神经上皮(NEP)的,能够成为玻璃钢或重建方案的持久性人口。幸运的是,维持较长的细胞在GRP中就越有可能,将选择的GRP型中等。

      图1。

      图1)异构形态镀脊髓细胞的观察后,2天中文化。 二)Immunopanning最大限度地从开始的异构池高度的玻璃纤维丰富的人口。

Discussion

Disclosures

这项研究是由美国国立卫生研究所[NICHD的P30HD024061(AWP的),NINDS的K08NS063956(AF)和R01NS028208(MVJ)]和儿童神经基金会。本报告的内容纯属作者的责任,并不代表官方意见的国家卫生研究院,DHHS。作者有没有本研究相关的利益冲突。

Acknowledgments

我们要感谢他的洞察力和反馈,在使用玻璃纤维细胞德文 - 加利博士。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/ F12 1:1 Invitrogen 11320033
B27 Invitrogen 17504044
N2 Invitrogen 17502048
rH-FGF-basic Invitrogen PHG0026
Trypsin (0.05%) EDTA Quality Biological, Inc. 118-087-721
POLY-L-LYSINE HBr Sigma-Aldrich P1274-25MG
Laminin Sigma-Aldrich L2020-1MG
Dnase 1 Sigma-Aldrich DN25

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