تحضير الأنسجة وImmunostaining من الألياف العصبية الحسية ماوس التعصيب الجلد والعظام الاطراف

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

تحديد Immunocytochemical الطرفية من الألياف العصبية الحسية فرعية (والكشف عن بروتين تعبير فيها) هي المفتاح لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء الإحساس الطرفية. نحن هنا تصف طرق تحضير عينات الأنسجة المحيطية / الحشوية ، مثل العظام والجلد أطرافهم ، لimmunostaining محددة من الألياف العصبية الطرفية الحسية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

كشف والتجهيز الأولي للالفيزيائية والكيميائية وتنمية مداركه الحسية الحرارية بواسطة الألياف العصبية الحسية المحيطية هو مفتاح الإدراك الحسي في الحيوانات والبشر. هذه الألياف العصبية الطرفية الحسية أعرب عدد كبير من المستقبلات والبروتينات التي كشف القناة الايونية والشروع في تنمية مداركه الحسية محددة. الأساليب المتاحة لتوصيف الخصائص الكهربائية للألياف العصبية الحسية المحيطية التعصيب الجلد ، والتي يمكن أيضا أن تستخدم لتحديد التعبير الوظيفي للبروتينات محددة القناة الايونية في هذه الألياف. ومع ذلك ، أساليب مماثلة الكهربية ليست متاحة (وهنا أيضا من الصعب تطوير) للكشف عن التعبير الفنية من المستقبلات والبروتينات القناة الايونية في الألياف العصبية الطرفية الحسية التعصيب الأجهزة الحشوية الأخرى ، بما في ذلك الأنسجة الأكثر تحديا مثل العظام. وعلاوة على ذلك ، لا يمكن أن تكون هذه الطرق الكهربية المستخدمة في تحديد التعبير عن بروتين غير منفعلق في الألياف العصبية الطرفية الحسية. لذلك ، immunostaining عينات الأنسجة المحيطية / المتأصل للfivers العصب الحسي يوفر أفضل طريقة ممكنة لتحديد التعبير عن بروتينات معينة من الاهتمام في هذه الألياف العصبية. حتى الآن ، وقد استخدمت معظم الدراسات التعبير البروتين في الخلايا العصبية الحسية immunostaining الإجراءات في العقد الحسية ، حيث يقتصر المعلومات إلى التعبير عن بروتينات معينة في خلايا الجسم من أنواع معينة أو مجموعات فرعية من الخلايا العصبية الحسية. نحن هنا تقرير مفصل أساليب / بروتوكولات لإعداد عينات الأنسجة المحيطية / المتأصل للimmunostaining من الألياف العصبية الطرفية الحسية. نحن الطرق بالتفصيل على وجه التحديد لإعداد الجلد أو أخمصي لكمة خزعة والعظام (عظم الفخذ) مقاطع من الفئران لimmunostaining الطرفية من الألياف العصبية الحسية. هذه الأساليب ليست المفتاح الوحيد لتحديد نوعية التعبير البروتين في الخلايا العصبية الحسية المحيطية ، ولكن أيضا توفير طريقة المقايسة الكمية للتحديد التغيرات في مستويات بروتين تعبير في أنواع معينة أو مجموعات فرعية من الألياف الحسية ، وكذلك لتحديد التغيرات المورفولوجية و / أو التشريحية في عدد وكثافة الألياف الحسية أثناء حالات مرضية مختلفة. كذلك ، لا تقتصر هذه الأساليب لتلطيخ من الألياف العصبية الحسية فقط ، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لتلطيخ أي نوع من أنواع الألياف العصبية في الجلد والعظام والأنسجة الحشوية.

Protocol

1. الحيوان الإرواء

تمت الموافقة على تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان اللجنة استخدم من جامعة أيوا ، واتبع الإرشادات المعاهد الوطنية للصحة لاستخدام الحيوانات في البحوث.

  1. قبل يوم التروية ، وإعداد 1 لتر من الفوسفات عازلة (0.2 م PB المقطر في مضاعفة O 2 H ، ودرجة الحموضة 7.4) ، وتخزينها في 4 درجة مئوية. وسوف تستخدم هذه العمليات لنضح وتثبيت آخر.
  2. في يوم التروية ، وإعداد 500 مل من 4.0 ٪ في بارافورمالدهيد PB 0.1M (منهاج العمل ، ودرجة الحموضة 7.4) حل تثبيتي ، وهو حجم كاف لنضح من 2 الفئران : الميكروويف 200 مل من DDH 2 O في كوب زجاجي لمدة 30 ثانية أو حتى يقترب الغليان. إضافة 20 غراما من بارافورمالدهيد الحبيبية (منهاج العمل) إلى الدورق مع التحريك المستمر تحت غطاء الدخان. إضافة 5 مل من هيدروكسيد الصوديوم N 5 الانقطاع عن الحكمة ويحرك حتى الحل من تلقاء نفسه. عندما يذوب تماما PFA بارد والحل لدرجة حرارة الغرفة (RT). سلوفاكياإضافة wly PB 250 مل من 0.2 M مع التحريك باستمرار. أضعف تدريجيا باستخدام حلول حمض الهيدروكلوريك (6 إلى 1 N N إلى 0.1 N) ، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4. ضبط الحجم النهائي إلى 500 مل والبرد على الجليد. أيضا بإعداد 400 مل من PB M 0،1 0،2 M من المخزون عن طريق تمييع 01:01 في DDH 2 O والبرد على الجليد.
  3. تخدير الماوس عن طريق الحقن intraperitonial من جرعة زائدة من مخدر (الصوديوم بنتوباربيتال ، 80 ملغ / كلغ ، وتدار بواسطة إبرة 27G).
  4. خلال التروية ، سيتم تمرير 50 مل من PB M 0.1 (0.2 م PB تمييع المخزون 01:01 مع DDH 2 O) و 150 مل من PFA بالتسلسل إلى الدورة الدموية الماوس. اقامة مضخة تمعجية عن طريق ملء الأنبوب مع PB وتحديد فراشة G 23 02/01 إبرة في نهاية واحدة. تزج الطرف الآخر من الأنبوب في دورق يحتوي على 0.1 م PB. ضبط سرعة مضخة تمعجية الى 10 مل / دقيقة ، ومضخة من خلال كمية كافية من الحل لضمان عدم وجود فقاعات الهواء في الأنبوب.
  5. انتظر حتى المؤشر Aالفأر لم يعد يظهر nesthetized أي نشاط المنعكس ، مثل إصبع / ذيل قرصة وميض منعكس. وضع الحيوان على الجانب تشريح علبة بطني حتى داخل غطاء الدخان وتأمين الكفوف مع الشريط. رش الفراء مع الايثانول 70 ٪. إجراء شق خلال الجلد على طول خط الوسط لفضح القفص الصدري والربع العلوي من جدار البطن. ثم ، وقطع من خلال جدار البطن عند قاعدة القفص الصدري. بعد إجراء هذا الشق ، وينبغي أن الحجاب الحاجز وانخفاض نهاية القص تكون مرئية. قطع بعناية من اليسار إلى اليمين من خلال هامش الحجاب الحاجز ، وعلى طول الكامل للقص ، مع الحرص على عدم تلف الرئتين. بعض النزيف طفيفة من القص في هذه المرحلة أمر طبيعي وانها لن تتنازل التروية. مرة واحدة أحرز شق على طول القص وقطع الحجاب الحاجز ، وينبغي أن يكون من الممكن رفع كل شوط من القفص الصدري ، وصعودا إلى الخارج ، مثل التي يتعرض لها القلب. التحرك جانبا الرئتين إذا لزم الأمر. يمكن كل شطر من القفص الصدريالتي ستعقد في هذا الموقف مع استخدام المشابك مرقئ. إدراج إبرة فراشة (23 1 / 2 G) التي تعلق على مضخة تمعجية 3-4 ملم في البطين الأيسر ، في موازاة محور طويل من الحيوان. هذا الموضع يقلل من خطر الإبرة تصبح فكها. إجراء شق صغير في الأذين الأيمن للسماح بعودة الدورة الدموية إلى تدفق خارج من القلب.
  6. يبدأ نضح مع PB 0.1 M في 10 مل / دقيقة لدقيقة 4-5. إذا كان لا يزال هناك كمية كبيرة من الدم المنبثقة من الأذين الأيمن عند هذه النقطة ، تستمر حتى تدفق واضح.
  7. وقف تدفق PB والتبديل المدخل على مضخة تمعجية في حل PFA 4 ٪. خفض معدل التدفق الى 5 مل / دقيقة ، واستئناف ضخ PFA حل ل20-25 دقيقة. كما PFA يدخل الدورة الدموية للعضلات كان متشنجا ، وبعد بضع دقائق ، يجب أن يكون الحيوان حرفيا "ثابت" في الموقف. ويمكن اختبار صلابة هذا عن طريق دفع بلطف ضد hindpaws ، مع الحرص على عدم نقل الحيوانالثانية طرد قنية. ونضح جيدة منع أطرافهم من الثناء ردا على ذلك. مرة واحدة مع نضح PFA اكتمال ، يمكن قطع قنية والمشابك مرقئ والجثث التي أعدت للتشريح الأنسجة. نهج يعتمد على استخدام تشريح الأنسجة محددة.
  8. إعداد 4 ٪ PFA / 5 ٪ (V / V) البكريك حمض (السلطة الفلسطينية ؛ لجمع وتثبيت آخر ، من لكمة الأخمصية فقط) عن طريق إضافة محلول مشبع حمض البكريك PFA إلى 4 ٪. إدراج السلطة الفلسطينية تحسن كبير في الكشف عن مستضد في الأنسجة العصبية المحيطية 1
  9. إعداد العظام / الغضروف حل الأنسجة مزيل للكلس / cryoprotectant -- EDTA 10 ٪ في PB 0.1 M مع الجلسرين بنسبة 0.07 ٪ والسكروز 15 ٪. EDTA الحلول المستندة يزيل الكلس مع المحافظة على النسيج الحواتم 2.
  10. إعداد الحل cryoprotectant -- 30 ٪ سكروز في PB M 0.1.

2. تشريح الأنسجة / الإزالة ، إلى تثبيت وSectioning

  1. أخمصي لكمة
    ضع perfuSED الجانب الحيواني أسفل بطني على حصيرة أو قطع السطح قوي أخرى. عقد أخمص القدم إلى أعلى السطح ، اضغط لأسفل بشدة مع أداة لكمة خزعة (3 مم ؛ هاريس الجزئي لكمة ، وتيد بيلا شركة) في منتصف القدم. بدوره أداة خزعة ذهابا وإيابا من خلال 180 درجة لتأكيد أداة خزعة خفضت من خلال مجمل من مخلب الخلفيتين. إزالة بلطف أداة خزعة من القدم وإخراج الأنسجة العقيمة في أنبوب 2 مل مع غطاء ، تحتوي على 1 مل من 4 ٪ حل السلطة الفلسطينية PFA / 5 ٪.
  2. عظام الأطراف (مثل عظم الفخذ)
    جعل شق الوحشي على طول الجزء الخلفي من الحيوان على مستوى الحوض ، والاستمرار على طول أطرافه الخلفية على حد سواء. قطع في الحوض والعضلات المحيطة بها للفصل بين عظم الفخذ من الحوض مع ترك الرأس القريبة من عظم الفخذ سليمة. قطع في الساق / الشظية لمغادرة رئيس القاصي سليمة ، وإزالة العضلات المحيطة / سمحاق رمح من العظام. مكان عظم الفخذ في أنبوب يحتوي على 2 مل 1 مل من 4 ٪ PFA /5 ٪ للسلطة الفلسطينية حل.
  3. بعد إصلاح عينات الأنسجة في 4 ٪ PFA / 5 ٪ حل السلطة الفلسطينية ، مع مزج لطيف على الكرسي الهزاز ل16-18 ساعة عند 4 درجات مئوية
  4. يزيل الكلس النسيج على النحو التالي : للحصول على مكان الأخمصية (ليزيل الكلس في العظام الصغيرة في القدم) لكمة لكمة النسيج في أنبوب معقم 2 مل مع كأب ، وتحتوي على 1.5 مل من محلول EDTA 10 ٪ في PB 0.1 M مع الجلسرين بنسبة 0.07 ٪ و 15 ٪ السكروز. وضع أنبوب على الاختلاط مع مغني الروك خفيفة ل16-18 ساعة عند 4 درجات مئوية. مكان للحصول على عظام أطرافهم النسيج في أنبوب معقم 2 مل مع كأب ، وتحتوي على 1.5 مل من محلول EDTA 10 ٪ في PB 0.1 M مع الجلسرين بنسبة 0.07 ٪ و 15 ٪ سكروز. وضع أنبوب على الاختلاط مع مغني الروك خفيفة ل6-7 أيام في 4 درجات مئوية. ينبغي تغيير كل حل زوال الكلس 24 ساعة والأنسجة مراقبتها لفقدان صلابة مع زوج من الملقط.
  5. نقل الأنسجة في أنبوب معقم 2 مل مع غطاء مع 1.5 مل من محلول cryoprotectant (30 ٪ سكروز في PB M 0.1) ، ووضع أنبوب على الروك ثإيث خلط خفيف ل16-18 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  6. تحضير الأنسجة لsectioning : وضع سرير من حجم خفض درجة الحرارة المثلى (أكتوبر) مجمع (ساكورا Finetek الولايات المتحدة الأمريكية شركة) على ناظم البرد كتلة النسيج تصاعد والسماح لتجميد ناظم البرد في الغرفة (عادة في الحفاظ على -20 درجة مئوية). ويمكن أيضا الهباء المبردة (خلوي للتجمد ، ومراقبة شركة الولايات المتحدة الأمريكية) أن يرش على أكتوبر لتسريع عملية التجميد. عينة الأنسجة مكان على هذا السرير من أكتوبر ، وتغطي طبقة من رقيقة مع إضافية من أكتوبر هذا الرذاذ برفق أكتوبر مع الهباء المبردة حتى أنها تصلب الأنسجة داخل والمجمدة و. عينة مكان على رأس القطاعات في الغرفة ناظم البرد والسماح للكتلة عينة الأنسجة لكي تتوازن لخفض درجة الحرارة -- على الأقل 1 ساعة. القسم عندما تحاول مجمع تضمين النتائج لا تزال باردة جدا في الفرعين هشة وتلف الأنسجة.
  7. مرة واحدة في الأنسجة وصلت درجة الحرارة المثلى القطع ، تبدأ خفض العينة وتوليد 40 ميكرومتر المقاطع.
  8. لكمة أخمصي جمع cryosections في 12 - جيدا لوحات زراعة الأنسجة التي تحتوي على 0.1 م PB مع 10 ملي أزيد الصوديوم. تأكد من أن تبقى مغمورة المقاطع في هذا الحل في 4 درجة مئوية. ويمكن تخزين المقاطع في هذه الطريقة لمدة تصل إلى 4-6 أشهر لأغراض immunostaining. بدلا من ذلك ، يمكن تخزين المقاطع التعويم الحر لأجل غير مسمى في حل cryoprotectant في -20 درجة مئوية (500 مل 0.1 M برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.2 ، 30 ز سكروز ، و 10 ز PVP40 ، جلايكول الإثيلين 300 مل). ضبط الحجم النهائي ل1L مع الماء المقطر) 3. للحصول على عظام أطرافهم جمع cryosections مباشرة على الشرائح المغلفة مسبقا الجيلاتين (أو Superfrost بالإضافة إلى الشرائح العلمية وفيشر) والسماح ليجف في الهواء لمدة 1 ساعة ، قبل تخزينها في -20 درجة مئوية. ويمكن استخدام أجزاء العظام على الشرائح المخزنة في هذا الطريق لأغراض immunostaining في غضون 2-3 أشهر.

3. Immunostaining من الأنسجة لأقسام الألياف العصبية الحسية

3.1. أخمصي لكمةالأقسام -- القسم العائمة تلطيخ

  1. باستخدام شفرة حلاقة ، وقطع 6-7 ملم من نهاية تلميح micropipette 1 مل. الشرط المسبق داخل غيض من قبل الشفط 1 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) في 0.1 مرات PB M عدة (وهذا يمنع التصاق المقاطع الأنسجة على الجدران من غيض). نقل المقاطع لكمة لتكون ملطخة أخمصي لوحة نسيج الثقافة 24 أيضا. وينبغي عادة 8-10 ملطخة المقاطع لكل بئر لضمان إنشاء عدة أقسام ذات جودة عالية في immunostaining.
  2. يغسل المقاطع كمة الأخمصي مع 500 ميكرولتر من 0.1 في PB M جيدا لمدة 5 دقائق مع الخلط قوية على الروك في RT. 2 كرر أكثر من مرة.
  3. تجاهل حل الغسيل واحتضان المقاطع كمة الأخمصي في عرقلة الحل ، ويتألف من مصل الماعز 10 ٪ و 0.3 ٪ تريتون X - 100 في 0.1 م PB (500 ميكرولتر من عرقلة الحل لكل بئر) ، وخلط لطيف على الكرسي الهزاز : 1 ح في 4 درجات مئوية.
  4. تجاهل حل الحجب واحتضان المقاطع الأنسجة في antibo الابتدائيدى / الأضداد في محلول مخفف 250 ميكروليتر حظر ل 18-24 ساعة مع مزج لطيف على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية. ويمكن على أساس الاحتياجات المحقق تجريبية ، immunolabeling واحد (واحد ضد الضد الأولية بروتين معين أو الألياف العصبية علامة) ، أو immunolabeling مزدوجة (مع اثنين من الأجسام المضادة الأولية ضد اثنين من البروتينات أو علامات الألياف العصبية) سيتم تنفيذه على نفس القسم. أثناء أداء immunolabeling مزدوجة من المهم التحقق من أن يتم رفع الأضداد الأساسيان المستخدمة في الأنواع المضيفة مختلفة (واحدة مثلا أثيرت في الماوس واحد التي أثيرت في الأرنب) ، أو بدلا من ذلك ، منقى من الاجسام المضادة المناعية isotypes مختلفة (مفتش) G (على سبيل المثال ويمكن استخدام واحد IgG1 IgG2a واحد). فإنه من المستحسن أن ختم لوحة مع Parafilm لحضانات ليلا لتجنب التبخر المفرط. من أجل صمة الطرفية الألياف العصبية الحسية ، ويمكن استخدام الأجسام المضادة المحددة عدة. أجسام مضادة ضد بروتين neurofilament 200 (NF200 ؛ سيجما) تسمية لارGE - قطرها الألياف ، في حين كالسيتونين الببتيد الجينات ذات الصلة (CGRP ؛ سيغما) ، ومستقبلات محتملة عابرة ببتيدي المفعول تسمية vanilloid 1 (TRPV1 ، Neuromics) ، صغيرة قطرها الألياف الحسية الطرفية. ويمكن أيضا جميع الألياف العصبية الطرفية تكون ملطخة أجسام مضادة ضد تويولين - β3. في الجلد ، وتستخدم الكولاجين الرابع (Abcam) لتحديد الغشاء القاعدي الذي يفصل البشرة عن الأدمة. كقاعدة عامة ، والأجسام المضادة تحتاج إلى 5-10 مرات أكثر تركيزا من أجل الخلية المقايسات مقرها مثقف المناعي ، وعادة عند تركيز العمل من 5-10 ميكروغرام / مل.
  5. غسل أقسام الأنسجة مع 500 ميكروليتر من محلول حظر (مع 100 - X تريتون) لكل بئر لمدة 5 دقائق مع الخلط قوية على الروك في RT. كرر 3 مرات أكثر.
  6. تجاهل حل الغسيل والمقاطع احتضان الأنسجة في أجسام fluorophore ، مترافق المناسبة الثانوية (مخفف عادة 1:1000 في عرقلة الحل ، 500 ميكرولتر) مع مزج لطيف على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية. لوحة المصحفر أن تكون ملفوفة في رقائق الألومنيوم لتجنب photobleaching من fluorophores.
  7. غسل أقسام الأنسجة مع 500 ميكرولتر من حل لكل بئر حظر لمدة 10 دقيقة مع خلط قوية على الروك في RT. ثم تغسل مع 500 ميكرولتر من PB 0.1 M مع خلط نشطة لمدة 10 دقيقة في RT. أخيرا ، يغسل مع 500 ميكرولتر من PB 0.05 م مع خلط نشطة لمدة 10 دقيقة في RT.
  8. باستخدام micropipette 1 مل مع تلميح FBS المعالجة (قطع 6-7 ملم من نهاية) ، نضح المقاطع من نسيج لوحة والثقافة ، ونقل على SuperFrost بالإضافة إلى شرائح المجهر. ترتيب المقاطع واستيعاب الفائض عازلة غسل الفرشاة مع الغرامة. تجنب التعرض المطول للضوء. احتضان الشرائح في RT ، من أجل السماح ليجف المقاطع المقاطع في الشريحة (50-30 دقيقة).
  9. عدة قطرات من تصاعد المتوسطة (ProLongGold ، Vectashield أو ما شابه) ، ومكان ببطء ساترة الزجاج على الأبواب. السماح للشرائح على الجلوس في الظلام لمدة 5 دقائق ، ثم ختم حواف الأظافر الشفاف مع ساترةالبولندية. سماح للهواء لتجفيف 15-20 دقيقة. يمكن أن تكون الآن تصور الشرائح أو تخزينها في -20 درجة مئوية لعدة سنوات دون أي خسائر كبيرة في مضان.

3.2. أقسام العظام أطرافهم -- على الشريحة تلطيخ

  1. تسمح الشرائح للعودة الى RT من تخزين -20 درجة مئوية. باستخدام قلم حاجز مسعور (سوبر القلم السائل عنق الرحم الحظر ، تيد بيلا شركة) تطويق المنطقة على الشريحة التي تحتوي على أقسام العظام لتكون ملطخة طبقة سخية من الحل. تسمح للهواء الجاف لمدة 10-15 دقيقة.
  2. غسل أقسام العظام مع 250 ميكرولتر من PB M 0.1 في الشريحة لمدة 5 دقائق وتكرر لمدة 2 مرات أكثر.
  3. تجاهل حل الغسيل واحتضان المقاطع العظام في عرقلة الحل ، ويتألف من مصل الماعز 10 ٪ و 0.3 ٪ تريتون X - 100 في 0.1 م PB (250 ميكرولتر من عرقلة الحل لكل شريحة) لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  4. تجاهل حل الحجب واحتضان المقاطع العظام في جسم الأساسية (أو مزيج من الأجسام المضادة الأولية ، في حالةمن immunolabeling المزدوج على النحو المذكور تحت 3.1.4) في محلول مخفف 250 ميكروليتر حظر ل 18-24 ساعة عند 4 درجات مئوية. من المهم جدا أن نلاحظ أنه يجب أن توضع الشرائح في غرفة ترطيب بغطاء مختومة ، وذلك لتجنب جفاف الجسم المضاد الحل الأساسي. يمكن أن تستخدم من أجل صمة الطرفية الألياف العصبية الحسية ، والمذكورة أعلاه ، مجموعة من الأضداد (انظر القسم 3.1.4) مع تركيز مماثل العمل.
  5. غسل أقسام الأنسجة مع 250 ميكروليتر من محلول حظر (مع 100 - X تريتون) لكل شريحة لمدة 15 دقيقة على RT وكرر لمدة 3 مرات أكثر.
  6. تجاهل حل الغسيل واحتضان أقسام العظام في الأضداد ، مترافق fluorophore المناسبة الثانوية (مخفف عادة 1:1000 في عرقلة الحل ، 250 ميكرولتر) في 4 درجات مئوية. يجب أن تكون ملفوفة في غرفة تلطيخ رقائق الألومنيوم لتجنب photobleaching من fluorophores. تسهيلا للعمل ، فإنه من المستحسن استخدام غرف تلطيخ داكنة اللون (مثل الشرائح مربع حضانة صينية / ، RPI كورب).
  7. Wالرماد المقاطع العظام مع 250 ميكرولتر من عرقلة الحل لكل شريحة لمدة 15 دقيقة في RT. ثم تغسل مع 500 ميكرولتر من PB 0.1 M لمدة 15 دقيقة في RT. أخيرا ، يغسل مع 500 ميكرولتر من PB 0.05 م لمدة 15 دقيقة في RT. تراجع لفترة وجيزة في DDH 2 O لشطف الشرائح وبعد ذلك في احتضان RT من أجل السماح للأقسام العظام (50-30 دقيقة) الهواء الجاف. تجنب التعرض المطول للضوء.
  8. عدة قطرات من تصاعد المتوسطة (ProLongGold أو ما شابه) ومكان ببطء ساترة الزجاج على الأبواب. اسمحوا الشرائح الوقوف في الظلام لمدة 5 دقائق ، ثم ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر الشفاف. السماح لتجفيف 15-20 دقيقة. ويمكن تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية لعدة سنوات دون فقدان مضان.

4. ممثل النتائج

4.1. أخمصي المقاطع لكمة

يمكن أخمصي أقسام الأنسجة تحت المجهر لكمة تصور epifluorescence ، أو تحت المجهر مبائر مع الهدف ، 10X 40X 63X أو.

الشكل 1
الشكل 1. تظهر ميلادي تلطيخ مع الكولاجين الرابع الأضداد (الأخضر) في الأغشية الطابق السفلي ، وعلى مفترق الطرق ، الجلد والبشرة في الغضروف والعضلات. ويتم توزيع العديد من CGRP - (AB ، الحمراء) ، وNF200 إيجابية الألياف (CD ، الحمراء) في جميع أنحاء الجلد الماوس في المنطقة الأخمصية (الأسهم). β3 - تويولين هو علامة عموم العصبية (E ، الحمراء) ، في حين TRPV1 تلطيخ ؛ يقتصر أساسا (F الحمراء) للمشاريع الصغيرة وقطره الألياف التي هي أيضا CGRP إيجابية (أخضر ؛ النصال). A و C هي الصور التي اتخذت مع epifluorescence هدفا 10X (شريط مقياس -500 ميكرون) ، B ، D ، E و F هي الصورة المركبة مبائر المتولدة من المكدس - Z - 11 التي اتخذت في صورة زيادات 2 ميكرومتر تحت الهدف 60X (مقياس بار -- 50 ميكرون).

4.2. المقاطع أطرافهم العظام

يمكن أقسام أطرافهم النسيج العظمي يكون أيضا تصور epifluorescence تحت المجهر ، أو تحت microscop مبائره مع الهدف ، 10X 40X 63X أو.

الشكل 2
. الشكل 2 يوضح immunostaining مع CGRP المضادة (AB ، الحمراء ؛ السهام) ، ومكافحة NF200 (CD ، الحمراء ؛ السهام) ، ومكافحة β3 تويولين - (E ؛ الحمراء) ومعادية للTRPV1 - (F ؛ الحمراء) المشارك الملون المضادة للCGRP الضد (أخضر ؛ السهام). هذه الصور تظهر أنواع فرعية من الألياف العصبية الحسية وزعت في جميع أنحاء مصفوفة العظام في منطقة الرأس الاسفنجية للفخذ الماوس. A و C هي الصور التي اتخذت مع epifluorescence هدفا 10X (شريط مقياس -500 ميكرون) ، B ، D ، E و F هي الصورة المركبة مبائر المتولدة من المكدس - Z - 11 التي اتخذت في صورة زيادات 2 ميكرومتر تحت الهدف 60X (مقياس بار -- 50 ميكرون).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا وقد فصلنا في طرق تحضير الجلد الماوس والمقاطع النسيج العظمي لimmunostaining واكتشاف الألياف العصبية الطرفية الحسية. المقاطع التي تنتج من الخزعات كمة أخمصي تحتوي على كل من الجلد غير المشعر وشعر ، والذي يعني أنه يمكن استخدام البروتوكول على أي نوع الجلد. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنيات إلى وصمة عار أنواع الخلايا الأخرى في هذه الأنسجة (الكريات البيض على سبيل المثال ، بطائن الأوعية الدموية ، العضلات الملساء من بين أمور أخرى). هذه الطرق توفر حلا وسطا بين الحفاظ على ممتازة التركيبية الأمثل (والذي يتحقق من خلال تثبيت غلوتارالدهيد ، ولكن كثيرا ما ينتج من اختلال الحواتم وتتضاءل جودة تلطيخ immunostaining) والكشف immunocytochemical ، إذا ما اتبعت الإجراءات خطوة بخطوة بطريقة صارمة.

ويمكن الكشف عن الألياف العصبية الحسية في هذه الأنسجة المعونة في فهمنا للتنظيم ثمرة neurite الطرفية وتنتشر 4 ،ق كذلك التغيرات التشريحية في afferents الحسية الطرفية في ظل ظروف مرضية مختلفة. وعلاوة على ذلك ، يمكن أيضا تغييرات في التعبير عن العصبية ، والمستقبلات ، وقنوات ايون المظهري أو علامات أخرى في ظروف طبيعية أو مرضية التنموية دراستها 3،5-10. جنبا إلى جنب مع التجارب الكهربية المناسبة ، والكيمياء الحيوية والسلوكية ، ويمكن استخدام مثل هذه التغييرات في الأنماط الحسية الطرفية تلطيخ الخلايا العصبية لاختبار الفرضيات المتعلقة الألم مختلف دول 6،9 ، والتهاب الأعصاب 11 و 5،12. في الختام ، هذه التقنيات توفر مصدرا قيما للبيانات في الجسم الحي الذي يكمل ويعزز التشريحية الأخرى ، والبيانات الهيكلية والوظيفية المكتسبة من خلال نهوج إضافية ، وتعزيز فهمنا للتنظيم واكتساب مرونة في الألياف العصبية الطرفية الحسية في الصحة والمرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر الدكتور يوري M. Usachev لمساعدته في توحيد الأولي المجهري مبائر / التصوير من أخمصي الماوس immunostaining خزعة لكمة ، والدكتور هاموند دونا لام لمساعدتها المستمرة والانتقادات البناءة في هذا العمل. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من NINDS / المعاهد الوطنية للصحة (NS069898) ، ومنح جائزة تنمية فكرة من وزارة الدفاع البروستاتا برنامج أبحاث السرطان (وزارة الدفاع - 101096 - PCRP) لDPM

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella, Inc. 15094
Perfusion pump Material VWR international 23609-170
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material Research Products International Corp. 248270 (tray) 248270-A (lid)
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella, Inc. 11859
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
  2. Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
  3. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
  4. Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
  5. Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
  6. Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
  7. Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
  8. Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
  9. Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
  10. Persson, A. -K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
  11. Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
  12. Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics