Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

Neuroscience

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Summary

Identificazione immunocitochimica dei sottotipi di nervo periferico sensoriale fibra (e l'individuazione di espressione della proteina stessa) sono la chiave per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della sensazione periferici. Qui si descrivono i metodi per la preparazione di campioni di tessuti periferici / viscerale, come la pelle e le ossa degli arti, per immunocolorazione specifica periferica fibre nervose sensoriali.

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Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

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Abstract

Rilevamento e prima trasformazione del fisico, chimico e termico di stimoli sensoriali periferici fibre nervose sensoriali è la chiave per la percezione sensoriale negli animali e nell'uomo. Queste fibre nervose sensoriali periferici esprimere un gran numero di recettori e proteine ​​canale ionico che individuare e avviare specifici stimoli sensoriali. I metodi sono disponibili per caratterizzare le proprietà elettriche delle fibre nervose sensoriali periferici che innervano la pelle, che può anche essere utilizzato per identificare l'espressione funzionale di specifiche proteine ​​canale ionico in queste fibre. Tuttavia, simili metodi elettrofisiologici non sono disponibili (e sono anche difficili da sviluppare) per la rilevazione della espressione funzionale dei recettori e proteine ​​canali ionici in periferici che innervano le fibre nervose sensoriali altri organi viscerali, compresi i tessuti più difficili come le ossa. Inoltre, tali metodi elettrofisiologici non può essere utilizzato per determinare l'espressione di proteine ​​non-eccitabilis nel periferico fibre nervose sensoriali. Pertanto, immunocolorazione di campioni di tessuti periferici / viscerale per fivers nervo sensitivo fornisce il modo migliore per determinare l'espressione di specifiche proteine ​​di interesse in queste fibre nervose. Finora, la maggior parte studi di espressione della proteina nei neuroni sensoriali hanno utilizzato immunostaining procedure nei gangli sensoriali, dove si limita l'informazione per l'espressione di specifiche proteine ​​nel corpo cellulare di tipi specifici o sottoinsiemi di neuroni sensoriali. Qui riportiamo metodi dettagliati / protocolli per la preparazione di campioni di tessuto periferico / viscerale per immunocolorazione delle fibre nervose sensoriali periferici. Noi specificamente metodi dettaglio per la preparazione della pelle o plantare biopsia e ossa (femore) sezioni di topi per immunocolorazione delle fibre nervose sensoriali periferici. Questi metodi non sono solo la chiave per la determinazione qualitativa di espressione della proteina nei neuroni sensoriali periferici, ma anche fornire un metodo quantitativo di analisi perdeterminare i cambiamenti nei livelli di espressione della proteina in tipi specifici o sottoinsiemi di fibre sensoriali, nonché per determinare i cambiamenti morfologici e / o anatomiche del numero e della densità delle fibre sensoriali durante vari stati patologici. Inoltre, questi metodi non si limita alla colorazione di un solo fibre nervose sensoriali, ma può anche essere utilizzato per la colorazione qualsiasi tipo di fibre nervose della pelle, ossa e altri tessuti viscerali.

Protocol

1. Animal perfusione

Tutte le procedure di animali effettuati in questo studio sono approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso della University of Iowa, e seguire le linee guida NIH per l'uso di animali nella ricerca.

  1. Il giorno prima di perfusione, preparare 1 L di tampone fosfato (0,2 M PB in bidistillata H 2 O, pH 7,4), e conservare a 4 ° C. Questo verrà utilizzato per i processi di perfusione e post-fissazione.
  2. Il giorno della perfusione, preparare 500 ml di 4,0% paraformaldeide in PB 0,1 M (PFA, pH 7,4) la soluzione fissativa, un volume sufficiente per la perfusione di 2 topi: microonde 200 ml di DDH 2 O in un bicchiere di vetro per 30 sec o fino a quando si avvicina bollente. Aggiungere 20 g di paraformaldeide granulare (PFA) per il bicchiere mescolando costantemente sotto una cappa aspirante. Aggiungere 5 ml di NaOH 5 N goccia a goccia e mescolare fino a quando la soluzione cancella. Quando il PFA è completamente sciolto, raffreddare la soluzione a temperatura ambiente (RT). Slowly aggiungere 250 ml di 0,2 M PB agitando continuamente. Utilizzando sempre più deboli le soluzioni di HCl (6 N a 1 N a 0,1 N), regolare il pH a 7,4. Regolare il volume finale a 500 ml e chill sul ghiaccio. Anche preparare 400 ml di 0,1 M da 0,2 PB magazzino M diluendo 1:1 in DDH 2 O e chill sul ghiaccio.
  3. Anestetizzare il mouse intraperitonial mediante iniezione di una dose eccessiva di anestetico (sodio pentobarbital, 80 mg / kg, somministrato con un ago 27G).
  4. Durante la perfusione, 50 ml di 0.1 M PB (diluire 0,2 M PB magazzino 1:1 con DDH 2 O) e 150 ml di PFA saranno trasmessi in sequenza nella circolazione del mouse. Impostare la pompa peristaltica compilando il tubo con PB e la fissazione di un 23 1 / 2 ago a farfalla G ad una estremità. Immergere l'altra estremità del tubo nel bicchiere contenente 0,1 M PB. Impostare la velocità della pompa peristaltica a 10 ml / min, e la pompa con una quantità sufficiente di soluzione per garantire che non vi siano bolle d'aria nel tubo.
  5. Attendere che l'unonesthetized del mouse non mostra più alcuna attività riflessa, come tep / coda pizzico e riflesso lampeggiare. L'animale giaceva su un lato del vassoio dissezione ventrale dentro una cappa di aspirazione e proteggere le zampe con nastro adesivo. Spruzzare la pelliccia con il 70% di etanolo. Fare un'incisione attraverso la pelle lungo la linea mediana per esporre la cassa toracica e il quartiere più alto della parete addominale. Poi, tagliare attraverso la parete addominale, alla base della gabbia toracica. Dopo aver fatto questa incisione, il diaframma e abbassare fine dello sterno deve essere visibile. Accuratamente tagliato da sinistra a destra attraverso il margine del diaframma, e lungo tutta la lunghezza dello sterno, facendo attenzione a non danneggiare i polmoni. Alcune piccole emorragie dallo sterno in questa fase è normale e non compromettono la perfusione. Una volta che l'incisione che attraversa lo sterno è stata fatta e il taglio diaframma, dovrebbe essere possibile sollevare ogni metà della cassa toracica verso l'alto e verso l'esterno, in modo che il cuore è esposto. Spostare i polmoni, se necessario. Entrambe le metà della gabbia toracica possonosi terrà in questa posizione con l'uso di pinze emostatiche. Inserire l'ago a farfalla (23 1 / 2 G) collegato alla pompa peristaltica 3-4 millimetri nel ventricolo sinistro, parallela all'asse lungo dell'animale. Questa posizione minimizza il rischio di diventare l'ago sloggiato. Fai una piccola incisione nell'atrio destro per permettere la circolazione di ritorno a fluire dal cuore.
  6. Iniziare perfusione con 0,1 M PB a 10 ml / min per almeno 4-5. Se c'è ancora una notevole quantità di sangue proveniente dall'atrio destro a questo punto, continuare fino a quando il flusso è chiara.
  7. Fermare il flusso di PB e accendere l'ingresso sulla pompa peristaltica alla soluzione 4% PFA. Ridurre il flusso di 5 ml / min e riprendere la soluzione di pompaggio PFA per 20-25 min. Come il PFA entra nella circolazione, i muscoli vanno in spasmo e, dopo pochi minuti, l'animale deve essere letteralmente "fissa" in posizione. Questa rigidità può essere testato da spingendo delicatamente contro il hindpaws, facendo attenzione a non spostare l'animale un° rimuovere la cannula. Perfusione buona impedirà l'arto di flessione in risposta. Una volta perfusione con PFA è completa, la cannula e pinze emostatiche può essere scollegato e il cadavere preparato per la dissezione dei tessuti. L'approccio dissezione utilizzato dipende dal tessuto specifico.
  8. Preparare 4% PFA / 5% (v / v) di acido picrico (PA, per la raccolta e post-fissazione di punch plantare solo) con l'aggiunta di una soluzione satura di acido picrico al 4% PFA. L'inclusione di PA migliora in modo significativo rilevabilità dell'antigene in tessuti periferici neuronale 1
  9. Preparare ossea / cartilaginea soluzione decalcificazione del tessuto / crioprotettore - 10% EDTA 0.1 M PB con 0,07% glicerolo e il 15% di saccarosio. EDTA soluzioni basate decalcificazione del tessuto salvaguardando epitopi 2.
  10. Preparare la soluzione crioprotettore - 30% di saccarosio in 0.1 M PB.

2. La dissezione dei tessuti / rimozione, Post-fissazione e sezionamento

  1. Plantare Punch
    Posizionare il perfused lato animale ventrale verso il basso su un tappeto di taglio o su un'altra superficie robusta. Tenendo la superficie plantare del piede-up, premere con decisione con la biopsia strumento (3 mm di diametro; Harris micro-punch, Ted Pella Inc.) al centro del piede. Accendere lo strumento di biopsia avanti e indietro di 180 gradi per confermare lo strumento di biopsia ha tagliato attraverso l'interezza della zampa posteriore. Rimuovere delicatamente lo strumento di biopsia dal piede ed espellere il tessuto in provetta sterile 2 ml con tappo, contenente 1 ml di soluzione al 4% PFA / 5% PA.
  2. Arto Bone (es. femore)
    Effettuare una incisione laterale lungo la parte posteriore dell'animale, a livello del bacino, proseguendo verso il basso lungo entrambi gli arti posteriori. Tagliare a bacino e dei muscoli circostanti per separare il femore dal bacino pur lasciando la testa prossimale del femore intatto. Tagliare a tibia / perone a lasciare la testa distale intatta, la rimozione del muscolo che circonda / periostio dall'albero ossa. Posizionare il femore in una provetta da 2 ml contenente 1 ml del 4% PFA /5% di PA soluzione.
  3. Post-fissare i campioni di tessuto nel 4% PFA / Soluzione al 5% PA, con miscelazione delicata su un bilanciere per 16-18 ore a 4 ° C
  4. Decalcificare il tessuto come segue: Per plantare pugno (per decalcificare le ossa piccole del piede) posizionare il pugno tessuto in un tubo sterile 2 ml con tappo, contenente 1,5 ml di soluzione al 10% EDTA 0.1 M PB con 0,07% glicerolo e 15 % di saccarosio. Posizionare il tubo su una sedia a dondolo con miscelazione mite per 16-18 ore a 4 ° C. Per le ossa degli arti posto il tessuto in un tubo sterile 2 ml con tappo, contenente 1,5 ml di soluzione al 10% EDTA 0.1 M PB con 0,07% glicerolo e il 15% di saccarosio. Posizionare il tubo su una sedia a dondolo con miscelazione mite per 6-7 giorni a 4 ° C. La soluzione di decalcificazione deve essere cambiato ogni 24 ore e il tessuto monitorati per la perdita di rigidità con un paio di pinze.
  5. Trasferire il tessuto in un tubo sterile 2 ml con tappo con 1,5 ml di soluzione crioprotettore (30% di saccarosio di 0,1 M PB), e posizionare il tubo su una sedia a dondolo with miscelazione mite per 16-18 ore a 4 ° C.
  6. Preparare il tessuto per sezionamento: luogo un volume letto di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto (Sakura Finetek USA Inc.) su un blocco di tessuto criostato di montaggio e permette di congelare nella camera criostato (tipicamente mantenuta a -20 ° C). Un aerosol criogenico (Cito-congelamento, Controllo Co. USA) può essere spruzzata sulla ottobre per accelerare il processo di congelamento. Luogo campione di tessuto su questo letto di ottobre e coprire con un ulteriore strato sottile di ottobre Gentilmente a spruzzo questo ottobre con aerosol criogenico fino a quando non si è indurita e il tessuto all'interno ha congelato. Campione posto sulla testa di taglio nella camera di criostato e consentire il blocco campione di tessuto per equilibrare la temperatura di taglio - almeno 1 ora. Cercando di sezione quando il composto embedding è ancora risultati troppo freddo nelle sezioni fragili e danni ai tessuti.
  7. Una volta che il tessuto ha raggiunto la temperatura ottimale di taglio, iniziare a tagliare il campione e di generare 40 sezioni micron.
  8. Per pugno plantare raccogliere il criosezioni in piastre 12-tessuto e cultura contenente 0,1 M PB con 10 mM di sodio azide. Assicurarsi che le sezioni rimangono immersi in questa soluzione a 4 ° C. Le sezioni possono essere memorizzati in questo modo per un massimo di 4-6 mesi per scopi immunocolorazione. In alternativa, libera fluttuazione sezioni possono essere conservati a tempo indeterminato in soluzione crioprotettore a -20 ° C (500 ml 0,1 M PBS, pH 7,2, 30 g di saccarosio, 10 g PVP40, 300 ml di glicole etilenico). Regolare il volume finale di 1L con acqua distillata) 3. Per raccogliere le ossa degli arti criosezioni direttamente sulla gelatina preverniciato diapositive (o Superfrost Diapositive plus, Fisher Scientific) e lasciare asciugare per 1 ora, prima di riporre a -20 ° C. Sezioni di osso su vetrini conservati in questo modo può essere utilizzato per scopi immunocolorazione entro 2-3 mesi.

3. Immunocolorazione delle sezioni di tessuto per le fibre nervose sensoriali

3.1. Plantare pugnosezioni - colorazione sezione galleggiante

  1. Utilizzando una lama di rasoio, taglio 6-7 mm dalla fine di una punta da 1 ml micropipetta. Pre-condizione l'interno della punta di aspirazione 1% di siero fetale bovino (FBS) in 0,1 M PB diverse volte (questo impedisce di attaccare le sezioni di tessuto alle pareti della punta). Trasferimento sezioni pugno plantare ad essere macchiato ad un 24-pozzetti di coltura tissutale. Normalmente 8-10 sezioni devono essere colorati per pozzetto di assicurare numerosi ed eccellenti sezioni sono generati per immunocolorazione.
  2. Lavare le sezioni pugno plantare con 500 microlitri di 0.1 M PB per pozzetto per 5 minuti mescolando con un vigoroso rocker a temperatura ambiente. Ripeti 2 volte.
  3. Gettare la soluzione di lavaggio e incubare le sezioni pugno plantari nel bloccare soluzione, costituita da siero di capra 10% e il 0,3% Triton X-100 in 0.1 M PB (500 ml di soluzione bloccante in ogni pozzetto), con la miscelazione delicata su un bilanciere per 1 h a 4 ° C.
  4. Scartare la soluzione di saturazione e incubare le sezioni di tessuto nella scuola primaria Antibody / anticorpi diluiti in 250 ul di soluzione bloccante per 18-24 h con miscelazione delicata su una sedia a dondolo a 4 ° C. Sulla base delle esigenze sperimentali sperimentatore, immunomarcatura singolo (con un anticorpo primario contro una specifica proteina marker o fibra nervosa), o immunomarcatura doppie (con due anticorpi primari contro due proteine ​​marker o fibre nervose) possono essere eseguite nella stessa sezione. Durante l'esecuzione immunomarcatura doppio, è importante verificare che i due anticorpi primari utilizzati sono allevati nella specie ospiti diversi (per esempio quella sollevata nel topo e uno cresciuto a coniglio), o, in alternativa, purificata anticorpi monoclonali di diverse immunoglobuline G (IgG) isotipi (ad esempio uno IgG1 e uno IgG2a) possono essere utilizzati. Si consiglia di sigillare la piastra con Parafilm per incubazioni durante la notte per evitare l'eccessiva evaporazione. Al fine di macchiare le fibre periferiche dei nervi sensoriali, diversi anticorpi specifici possono essere utilizzati. Anticorpi contro la proteina neurofilamenti 200 (NF200, Sigma) etichetta LARge-fibre di diametro, mentre la calcitonina peptide correlato al gene (CGRP, Sigma) potenziale etichetta e transient receptor peptidergici vanilloide 1 (TRPV1, Neuromics), fibre periferiche di piccolo diametro sensoriale. Tutte le fibre nervose periferiche possono essere colorati con anticorpi contro β3-tubulina. In pelle, collagene IV (Abcam) è usato per delineare la membrana basale che separa l'epidermide dal derma. Come regola generale, gli anticorpi devono essere 5-10 volte più concentrato di quello per la coltura test immunofluorescenza a base di cellule, di solito ad una concentrazione di lavoro di 5-10 mg / ml.
  5. Lavare le sezioni di tessuto con 500 ml di soluzione bloccante (con Triton X-100) in ogni pozzetto per 5 minuti mescolando con un vigoroso rocker a temperatura ambiente. Ripeti 3 volte di più.
  6. Gettare la soluzione di lavaggio e di sezioni di tessuto incubare in appositi anticorpi secondari fluoroforo-coniugato (normalmente diluita 1:1000 nel bloccare soluzione, 500 microlitri) con miscelazione delicata su una sedia a dondolo a 4 ° C. La piastra di must essere avvolti in carta stagnola per evitare photobleaching di fluorofori.
  7. Lavare le sezioni di tessuto con 500 ml di soluzione bloccante in ogni pozzetto per 10 minuti mescolando con un vigoroso rocker a temperatura ambiente. Lavare quindi con 500 microlitri di 0.1 M PB con energica agitazione per 10 min a RT. Infine, lavare con 500 ml di 0,05 M PB con energica agitazione per 10 min a RT.
  8. Usando una micropipetta 1 ml con una FBS trattati punta (taglio 6-7 mm dalla fine), aspirare le sezioni dalla piastra di coltura tissutale e trasferimento su SuperFrost Più vetrini da microscopio. Disporre le sezioni e assorbono tampone in eccesso lavare con un pennello sottile. Evitare l'esposizione prolungata alla luce. Incubare i vetrini a RT, al fine di consentire sezioni asciugare sezioni su vetrino (min 5-30).
  9. Applicare alcune gocce di mezzo di montaggio (ProLongGold, Vectashield o simili), lentamente posto un coprioggetto di vetro su sezioni. Lasciare le diapositive di sedersi al buio per 5 minuti, e poi sigillare i bordi coprioggetto con smalto trasparentelucidare. Lasciare essiccazione per 15-20 minuti. Le slide possono essere visualizzate o conservati a -20 ° C per diversi anni senza una significativa perdita di fluorescenza.

3.2. Sezioni delle ossa degli arti - on-scivolo colorazione

  1. Lasciare le diapositive per tornare alla RT di stoccaggio da -20 ° C. Utilizzando una penna barriera idrofoba (Super Pen Liquid Pap blocco, Ted Pella Inc.) circoscrivere la regione sulla diapositiva che contiene le sezioni osso da colorare con uno strato abbondante di soluzione. Lasciare asciugare per 10-15 min.
  2. Lavare le sezioni osso con 250 microlitri di 0.1 M PB per vetrino per 5 minuti e ripetere per 2 volte di più.
  3. Gettare la soluzione di lavaggio e incubare le sezioni osso nel bloccare soluzione, costituita da siero di capra 10% e il 0,3% Triton X-100 in 0.1 M PB (250 ml di soluzione di bloccaggio per vetrino) per 1 ora a 4 ° C.
  4. Scartare la soluzione di saturazione e incubare le sezioni osso anticorpo primario (o combinazione di anticorpi primari, nel caso in cuidi immunomarcatura doppio come detto in 3.1.4) diluita in 250 ul di soluzione bloccante per 18-24 ore a 4 ° C. E 'molto importante notare che le diapositive devono essere collocati in una camera umidificata con un coperchio sigillato, in modo da evitare l'essiccazione della soluzione dell'anticorpo primario. Al fine di macchiare le fibre nervose sensoriali periferici, le suddette serie di anticorpi (vedi paragrafo 3.1.4) può essere utilizzato con simili concentrazioni di lavoro.
  5. Lavare le sezioni di tessuto con 250 ml di soluzione bloccante (con Triton X-100) per vetrino per 15 minuti a temperatura ambiente e ripetere per 3 volte di più.
  6. Gettare la soluzione di lavaggio e incubare sezioni osso in appositi anticorpi secondari fluoroforo-coniugato (normalmente diluita 1:1000 in soluzione bloccante, 250 microlitri) a 4 ° C. La camera di colorazione deve essere avvolti in carta stagnola per evitare photobleaching di fluorofori. Per comodità, si consiglia di utilizzare di colore scuro camere di colorazione (Slide es. casella di incubazione vassoio /, RPI Corp.).
  7. Wcenere le sezioni osso con 250 ml di soluzione di bloccaggio per vetrino per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare quindi con 500 microlitri di 0.1 M PB per 15 minuti a temperatura ambiente. Infine, lavare con 500 ml di 0,05 M PB per 15 minuti a temperatura ambiente. Immergere brevemente in DDH 2 O per risciacquare diapositive e incubare a temperatura ambiente in modo da consentire le sezioni osso per aria secca (min 5-30). Evitare l'esposizione prolungata alla luce.
  8. Applicare alcune gocce di mezzo di montaggio (ProLongGold o simili) e lentamente mettere un coprioggetto di vetro su sezioni. Lasciate le diapositive stare al buio per 5 minuti, e poi sigillare i bordi coprioggetto con smalto trasparente. Lasciare asciugare per 15-20 minuti. Le diapositive possono essere conservati a -20 ° C per diversi anni senza perdita di fluorescenza.

4. Rappresentante Risultati

4.1. Plantare pugno sezioni

Plantare sezioni di tessuto pugno possono essere visualizzate sotto microscopio a epifluorescenza o al microscopio confocale con 10X, 40X o obiettivo 63x.

Figura 1
Figura 1. Visualizzare l'annuncio di colorazione con anticorpi del collagene IV (verde) in membrane basali, alla giunzione epidermico-cutanea e nelle cartilagini e muscoli. Numerose fibre CGRP-(AB, rosso) e NF200-positivi (CD, rosso) sono distribuiti in tutto la pelle del mouse nella regione plantare (frecce). β3-tubulina è un pan-neuronale marcatore (E, rosso), mentre la colorazione TRPV1 (F; rosso) è limitato essenzialmente al piccolo diametro delle fibre che sono anche CGRP-positivi (verde, punte di freccia). A e C sono immagini a epifluorescenza scattate con un obiettivo 10X (scala bar -500 micron), B, D, E e F sono composti confocale immagine generata da un 11-Z-stack prese a incrementi di 2 micron sotto un obiettivo 60X (scala bar - 50 micron).

4.2. Ossa degli arti sezioni

Arto sezioni di tessuto osseo può anche essere visualizzati sotto microscopio a epifluorescenza, o sotto una microscop confocalee con 10X, 40X o obiettivo 63x.

Figura 2
. La figura 2 mostra immunocolorazione con anti-CGRP (AB, rosso, frecce), anti-NF200 (CD, rosso, frecce), anti-β3-tubulina (E; rosso) e anti-TRPV1 (F; rosso) co-macchiato con anticorpi anti-CGRP (verde, frecce). Queste immagini mostrano i sottotipi di fibre nervose sensoriali distribuiti in tutta la matrice ossea nella regione della testa del femore spugnoso mouse. A e C sono immagini a epifluorescenza scattate con un obiettivo 10X (scala bar -500 micron), B, D, E e F sono composti confocale immagine generata da un 11-Z-stack prese a incrementi di 2 micron sotto un obiettivo 60X (scala bar - 50 micron).

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Discussion

Qui abbiamo dettagliato i metodi per la preparazione della cute del topo e sezioni di tessuto osseo per immunocolorazione e il rilevamento di periferiche fibre nervose sensoriali. Le sezioni prodotte da plantare biopsie contengono sia la pelle glabra e peloso, che significa che il protocollo può essere utilizzato su qualsiasi tipo di pelle. Queste tecniche possono anche essere impiegati per macchiare altri tipi di cellule in questi tessuti (es. leucociti, endoteli vascolari, muscolari lisce tra gli altri). Questi metodi offrono un ottimo compromesso tra ottimale conservazione ultrastrutturali (che si ottiene fissazione glutaraldeide, ma spesso si traduce in distruzione di epitopi e diminuisce la qualità colorazione immunoistochimica) e rilevabilità immunocitochimica, se le procedure sono seguite passo per passo in modo rigoroso.

Rilevamento delle fibre nervose sensoriali in questi tessuti possono aiutare nella comprensione della regolazione della crescita dei neuriti periferiche e germinazione 4, uns così come i cambiamenti anatomici nel periferico afferenze sensoriali in diverse condizioni patologiche. Inoltre, i cambiamenti nell'espressione dei neurotrasmettitori, recettori, canali ionici o altri marcatori fenotipici in normali condizioni di sviluppo o patologiche possono essere studiati 3,5-10. Insieme con appropriati test elettrofisiologici, biochimici e comportamentali, tali cambiamenti nei modelli di neurone sensoriale periferica colorazione può essere utilizzato per verificare ipotesi relative a diversi stati 6,9 dolore, l'infiammazione 11 e neuropatie 5,12. In conclusione, queste tecniche forniscono una preziosa fonte di dati in vivo, che completa e rafforza altre anatomiche, dati strutturali e funzionali acquisiti attraverso approcci aggiuntivi, approfondire la nostra comprensione del regolamento e l'acquisizione di plasticità in periferia fibre nervose sensoriali nella salute e nella malattia.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Ringraziamo il Dott. M. Yuriy Usachev per il suo aiuto nella standardizzazione iniziale di microscopia confocale / immagini di mouse plantare immunocolorazione biopsia, e il dottor Donna L. Hammond per il suo continuo aiuto e critica costruttiva in questo lavoro. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni da parte del NINDS / NIH (NS069898), e uno Sviluppo Idea Award Concessione da parte del Dipartimento di Ricerca della Difesa Prostate Cancer Program (DoD-PCRP-101096) per Data Protection Manager

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella, Inc. 15094
Perfusion pump Material VWR international 23609-170
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material Research Products International Corp. 248270 (tray) 248270-A (lid)
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella, Inc. 11859
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930

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References

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