Préparation des tissus et des fibres Immunocoloration souris nerveuses sensitives innervant la peau et les os du membre

Neuroscience

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Summary

L'identification immunocytochimique de sensitive périphérique sous-types de fibres nerveuses (et de détection de l'expression des protéines qui y sont) sont essentiels à la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents sensations périphériques. Nous décrivons ici les méthodes de préparation d'échantillons de tissus périphériques / viscérale, tels que les os de la peau et des membres, par immunomarquage spécifique des fibres nerveuses périphériques sensorielles.

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Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

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Abstract

Détection et traitement primaire des propriétés physiques, chimiques et thermiques par des stimuli sensoriels périphériques fibres nerveuses sensorielles est la clé de la perception sensorielle chez les animaux et les humains. Ces fibres nerveuses sensitives périphériques expriment une multitude de récepteurs et de protéines des canaux ioniques qui détectent et initier des stimuli sensoriels spécifiques. Les méthodes sont disponibles pour caractériser les propriétés électriques des fibres nerveuses sensorielles périphériques innervant la peau, qui peut également être utilisé pour identifier l'expression fonctionnelle des protéines des canaux ioniques spécifiques dans ces fibres. Toutefois, les méthodes électrophysiologiques similaires ne sont pas disponibles (et sont également difficiles à développer) pour la détection de l'expression fonctionnelle des récepteurs et des protéines des canaux ioniques dans les fibres nerveuses sensorielles périphériques innervant les autres viscères, y compris les tissus les plus difficiles tels que les os. Par ailleurs, ces méthodes électrophysiologiques ne peut pas être utilisé pour déterminer l'expression de la protéine non excitabless dans les zones périphériques des fibres nerveuses sensitives. Par conséquent, immunomarquage d'échantillons de tissus périphériques / viscérale pour fivers nerveuses sensorielles fournit la meilleure façon possible afin de déterminer l'expression de protéines spécifiques de l'intérêt pour ces fibres nerveuses. Jusqu'ici, la plupart des études d'expression de protéines dans les neurones sensoriels ont utilisé immunomarquage procédures dans les ganglions sensitifs, où l'information est limitée à l'expression de protéines spécifiques dans le corps cellulaire de certains types ou sous-ensembles de neurones sensoriels. Nous rapportons ici les méthodes détaillées / protocoles pour la préparation d'échantillons de tissus périphériques / viscérale pour l'immunocoloration des périphériques fibres nerveuses sensitives. Nous détail les méthodes spécifiquement pour la préparation de la peau ou plantaire biopsie et d'os (fémur) les articles de la souris pour l'immunocoloration des périphériques fibres nerveuses sensitives. Ces méthodes ne sont pas seulement essentiels pour la détermination qualitative de l'expression des protéines dans les neurones sensoriels périphériques, mais aussi fournir une méthode de dosage quantitatif pourdéterminer les changements dans les niveaux d'expression de protéines dans des types spécifiques ou des sous-ensembles de fibres sensorielles, ainsi que pour déterminer les modifications morphologiques et / ou anatomiques dans le nombre et la densité des fibres sensorielles au cours de divers états pathologiques. De plus, ces méthodes ne sont pas confinés à la coloration des fibres nerveuses sensorielles que, mais peut aussi être utilisé pour la coloration des types de fibres nerveuses dans la peau, les os et autres tissus viscéraux.

Protocol

1. Perfusion des animaux

Toutes les procédures réalisées sur l'animal dans cette étude sont approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel Utilisation de l'Université de l'Iowa, et suivre les directives du NIH pour l'utilisation d'animaux dans la recherche.

  1. Le jour avant la perfusion, préparer 1 L de tampon phosphate (0,2 M PB en double H 2 O distillée, pH 7,4), et conserver à 4 ° C. Il sera utilisé pour les processus de perfusion et de post-fixation.
  2. Le jour de la perfusion, préparer 500 ml de paraformaldéhyde 4,0% dans 0,1 M PB (PFA, pH 7,4) la solution de fixation, d'un volume suffisant pour la perfusion de 2 souris: micro-ondes de 200 ml de ddH 2 O dans un bécher de verre de 30 sec ou jusqu'à ce qu'il approche d'ébullition. Ajouter 20 g de paraformaldéhyde granulaire (PFA) dans le bécher sous agitation constante sous une hotte. Ajouter 5 ml de NaOH 5N goutte à goutte et remuer jusqu'à ce que la solution se dégage. Lorsque la PFA est complètement dissous, refroidir la solution à température ambiante (TA). Slowly ajouter 250 ml de 0,2 M PB en remuant sans cesse. En utilisant progressivement plus faible des solutions de HCl (6 N à 1 N à 0,1 N), ajuster le pH à 7,4. Ajuster le volume final à 500 ml et laisser refroidir sur glace. Également préparer 400 ml de 0,1 M PB de 0,2 M d'actions en diluant 01h01 dans le trou DDH 2 O et le froid sur la glace.
  3. Anesthésier la souris par injection intraperitonial d'une surdose d'anesthésique (pentobarbital sodique, 80 mg / kg, administré avec une aiguille 27G).
  4. Pendant la perfusion, 50 ml de 0,1 M PB (diluer 0,2 M PB stock de 1:1 avec ddH 2 O) et 150 ml de PFA seront transmis de manière séquentielle dans la circulation de la souris. Mettre en place la pompe péristaltique en remplissant le tube avec PB et la fixation d'une aiguille 23 1 / 2 G papillon à un bout. Plongez l'autre extrémité du tube dans le bécher contenant 0,1 M PB. Réglez la vitesse de la pompe péristaltique à 10 ml / min, et la pompe à travers une quantité suffisante de la solution pour garantir qu'il n'ya pas de bulles d'air dans le tube.
  5. Attendez que l'unela souris nesthetized ne montre plus aucune activité réflexe, comme tep / queue de pincement et réflexe de clignement. Poser les animaux sur un plateau de dissection latérale ventrale jusqu'à l'intérieur d'une hotte et sécuriser les pattes avec du ruban adhésif. Vaporiser la fourrure avec de l'éthanol à 70%. Faire une incision dans la peau le long de la ligne médiane pour exposer la cage thoracique et le quart le plus élevé de la paroi abdominale. Ensuite, couper à travers la paroi abdominale à la base de la cage thoracique. Après avoir fait cette incision, le diaphragme et les bas du sternum doit être visible. Découpez soigneusement de gauche à droite grâce à la marge du diaphragme, et sur toute la longueur du sternum, en prenant soin de ne pas endommager les poumons. Certains saignements mineurs à partir du sternum à ce stade est normal et ne pas compromettre la perfusion. Une fois l'incision le long du sternum a été faite et la coupe du diaphragme, il devrait être possible de soulever chaque moitié de la cage thoracique et le haut vers l'extérieur, tels que le cœur est exposé. Écarter les poumons si nécessaire. Les deux moitiés de la cage thoracique peutêtre maintenu dans cette position avec l'utilisation de pinces hémostatiques. Insérez l'aiguille papillon (23 1 / 2 G) attaché à la pompe péristaltique 3-4 mm dans le ventricule gauche, parallèle à l'axe longitudinal de l'animal. Ce placement minimise le risque de l'aiguille se sont détachées. Faire une petite incision dans l'oreillette droite afin de permettre la circulation de retour de circuler hors du coeur.
  6. Commencez la perfusion avec 0,1 M PB à 10 ml / min pour les 4-5 min. S'il ya encore une quantité importante de sang provenant de l'oreillette droite à ce point, continuer jusqu'à l'écoulement est clair.
  7. Arrêter l'écoulement du PB et de passer l'entrée de la pompe péristaltique de la solution à 4% en PFA. Réduire le débit à 5 ml / min et reprend le pompage solution de PFA pour 20-25 min. Comme la PFA pénètre dans la circulation, les muscles se contracter, et, après quelques minutes, l'animal devrait être littéralement "fixe" en position. Cette rigidité peut être testé en poussant doucement contre les pattes arrières, en prenant soin de ne pas déplacer l'animal uneND déloger la canule. Bonne perfusion permettra d'éviter le membre de fléchir en réponse. Une fois la perfusion avec l'IFP est terminée, la canule et pinces hémostatiques peut être déconnecté et le cadavre préparé pour la dissection des tissus. L'approche de dissection utilisé dépend du tissu spécifique.
  8. Préparer 4% PFA / 5% (v / v) d'acide picrique (PA; de collecte et de post-fixation de punch plantaires seulement) par l'ajout d'une solution saturée d'acide picrique à 4% en PFA. Inclusion de PA améliore considérablement la détectabilité d'antigène dans les zones périphériques des tissus neuronaux 1
  9. Préparer os / cartilages solution de tissus détartrage / cryoprotecteur - 10% d'EDTA 0,1 M dans le PB avec le glycérol 0,07% et 15% de saccharose. EDTA solutions basées détartrer les tissus tout en préservant épitopes 2.
  10. Préparer la solution cryoprotectrice - 30% de saccharose dans 0,1 M PB.

2. Dissection des tissus / Suppression, post-fixation et de sectionnement

  1. Plantaire punch
    Placez la perfucôté animal sed ventrale vers le bas sur un tapis de coupe ou toute autre surface solide. Tenir le pied surface plantaire, appuyez fermement vers le bas avec l'outil biopsie (3 mm de diamètre; Harris micro-perforation, Ted Pella Inc) dans le milieu du pied. Tourner l'outil de biopsie avant et en arrière de 180 degrés afin de confirmer l'outil de biopsie a coupé à travers la totalité de la patte arrière. Retirez doucement l'outil de biopsie du pied et éjecter le tissu dans le tube stérile 2 ml avec bouchon, contenant 1 ml de solution de PFA 4% / 5% PA.
  2. Os des membres (ex.: Fémur)
    Faire une incision latérale le long du dos de l'animal au niveau du bassin, en continuant vers le bas le long des deux membres postérieurs. Couper dans le bassin et les muscles environnants pour séparer le fémur au bassin tout en laissant la tête proximale du fémur intact. Couper dans le tibia / péroné de quitter la tête distale intacte, en supprimant les muscles entourant / périoste de l'os de l'arbre. Placez le fémur dans un tube de 2 ml contenant 1 ml de 4% PFA /5% de solution de sonorisation.
  3. Post-fixer les échantillons de tissus dans 4% PFA / solution à 5% PA, en mélangeant doucement sur une bascule pour les 16-18 h à 4 ° C
  4. Détartrer le tissu comme suit: Pour plantaires poinçon (à détartrer les petits os du pied) placer le poinçon de tissu dans un tube de 2 ml stérile avec capuchon, contenant 1,5 ml de solution d'EDTA à 10% dans 0,1 M PB avec le glycérol 0,07% et de 15 % de saccharose. Placer le tube sur une bascule avec un mélange doux pendant 16-18 h à 4 ° C. Pour les os des membres placer le tissu dans un tube de 2 ml stérile avec capuchon, contenant 1,5 ml de solution d'EDTA à 10% dans 0,1 M PB avec le glycérol 0,07% et 15% de saccharose. Placer le tube sur une bascule avec un mélange doux pendant 6-7 jours à 4 ° C. La solution la décalcification doit être changé toutes les 24 heures et le tissu contrôlé pour la perte de rigidité avec une paire de pinces.
  5. Transfert le tissu dans un tube de 2 ml stérile avec capuchon avec 1,5 ml de solution de cryoprotecteur (30% de saccharose dans 0,1 M PB), et placer le tube sur un rocker wvec un mélange doux pendant 16-18 h à 4 ° C.
  6. Préparer le tissu pour la coupe: placer un volume de lit de la température de coupe optimale (PTOM) composé (Sakura Finetek Unis Inc) sur un bloc de tissu cryostat montage et permettent de geler dans la chambre de cryostat (généralement maintenu à -20 ° C). Un aérosol cryogénique (Cyto-gel, contrôle Co. Etats-Unis) peut aussi être pulvérisé sur les PTOM afin d'accélérer le processus de congélation. Placer un échantillon de tissu sur ce lit de l'OCT et couvrir avec une couche mince supplémentaire de l'OCT. Pulvérisez doucement ce PTOM avec les aérosols cryogéniques jusqu'à ce qu'il ait durci et le tissu intérieur a gelé. Placer l'échantillon sur la tête de coupe dans la chambre de cryostat et permettre le bloc échantillon de tissu pour s'équilibrer à la température de coupe - au moins 1 heure. Essayer de la section lorsque le composé est encore intégrer les résultats dans les sections trop froid cassant et endommager les tissus.
  7. Une fois le tissu a atteint la température de coupe optimale, commencer à couper l'échantillon et de générer des 40 sections um.
  8. pour Punch plantaires recueillir les cryocoupes en plaques de 12 puits de culture tissulaire contenant 0,1 M PB avec 10 mM d'azoture de sodium. Assurez-vous que les sections restent immergées dans cette solution à 4 ° C. Les articles peuvent être stockés de cette manière pour un maximum de 4-6 mois à des fins immunomarquage. Alternativement, flottant sections peuvent être stockées indéfiniment dans une solution de cryoprotecteur à -20 ° C (500 ml PBS 0,1 M, pH 7,2, 30 g de saccharose, 10 g PVP40, 300 ml d'éthylène glycol). Ajuster le volume final à 1 litre d'eau distillée) 3. Pour des os des membres recueillir les cryocoupes directement sur ​​la gélatine pré-lames recouvertes (ou Superfrost Diapositives Plus, Fisher Scientific) et laisser sécher à l'air pendant 1 h, avant le stockage à -20 ° C. Sections d'os sur des lames stockés de cette manière peut être utilisée pour des fins immunomarquage dans les 2-3 mois.

3. Immunocoloration des coupes de tissus pour les fibres nerveuses sensorielles

3.1. Plantaire poinçonsections - coloration section flottante

  1. En utilisant une lame de rasoir, coupe 6-7 mm de l'extrémité d'une pointe de 1 ml micropipette. Pré-condition à l'intérieur de la pointe en aspirant 1% de sérum de veau fœtal (SVF) à 0,1 fois PB M de plusieurs (ce qui inhibe le collage des coupes de tissus sur les murs de la pointe). Transfert des sections perforation plantaire à être teinté d'une plaque de 24 puits de culture de tissu. Normalement 8-10 sections doivent être colorés par puits pour assurer plusieurs sections de haute qualité sont générés par immunomarquage.
  2. Lavez sections perforation plantaire avec 500 ul de 0,1 M PB par puits pendant 5 min avec une agitation vigoureuse sur une bascule à RT. Répétez 2 fois plus.
  3. Jeter la solution de lavage et incuber les sections perforation plantaire dans une solution de blocage, composée de sérum de chèvre 10% et 0,3% de Triton X-100 dans 0,1 M PB (500 pl d'une solution de blocage par puits), en mélangeant doucement sur une bascule pour 1 h à 4 ° C.
  4. Jeter la solution de blocage et incuber les coupes de tissus dans l'enseignement primaire Antibody / anticorps dilué dans 250 ul solution de blocage pendant 18-24 h, avec un mélange doux sur une bascule à 4 ° C. Basé sur les exigences expérimentales enquêteur, immunomarquage simples (avec un anticorps primaire contre une protéine spécifique ou un marqueur de fibres nerveuses), ou immunomarquage double (avec deux anticorps primaires contre deux protéines ou de marqueurs de fibres nerveuses) peuvent être effectuées sur la même section. Tout en exécutant immunomarquage doubles, il est important de vérifier que les deux anticorps primaires utilisés sont soulevées dans différentes espèces hôtes (par exemple celle soulevée dans les souris et un soulevées dans le lapin), ou alternativement, purifié des anticorps monoclonaux différents immunoglobuline G (IgG) isotypes (par exemple une IgG1 et IgG2a une) peut être utilisé. Il est conseillé de sceller la plaque avec du parafilm pour les incubations nuit pour éviter une évaporation excessive. Afin de colorer les fibres nerveuses sensitives périphériques, plusieurs anticorps spécifiques peuvent être utilisés. Des anticorps contre l'neurofilaments 200 protéines (NF200; Sigma) étiquette LARGE diamètre des fibres, tandis que la calcitonine gene-related peptide (CGRP; Sigma) et transient receptor étiquette peptidergiques potentiel vanilloïde 1 (TRPV1, neuromique), de petit diamètre des fibres sensorielles périphériques. Toutes les fibres nerveuses périphériques peuvent aussi être colorées avec des anticorps contre les β3-tubuline. Dans la peau, le collagène IV (Abcam) est utilisé pour délimiter la membrane basale qui sépare l'épiderme du derme. En règle générale, les anticorps doivent être 5-10 fois plus concentré que pour les cultures cellulaires immunofluorescence, typiquement à une concentration de travail de 5-10 ug / ml.
  5. Laver les coupes de tissus avec 500 pi de solution de blocage (avec du Triton X-100) par puits pendant 5 min avec agitation vigoureuse sur une bascule à RT. Répétez 3 fois plus.
  6. Jeter la solution de lavage et des coupes de tissus appropriés incuber dans un fluorophore conjugué anticorps secondaire (généralement diluée à 1:1000 dans une solution de blocage, 500 pi) avec un mélange doux sur une bascule à 4 ° C. La plaque de must être enveloppés dans du papier aluminium pour éviter de photoblanchiment des fluorophores.
  7. Laver les coupes de tissus avec 500 pi de solution de blocage par puits pendant 10 min avec agitation vigoureuse sur une bascule à RT. Ensuite laver avec 500 ul de 0,1 M PB avec une agitation vigoureuse pendant 10 min à température ambiante. Enfin, laver avec 500 ul de 0,05 M PB avec une agitation vigoureuse pendant 10 min à température ambiante.
  8. Utiliser une micropipette 1 ml avec une pointe de FBS-traitée (coupe 6-7 mm de la fin), aspirer les sections de la plaque de culture de tissus et de transfert sur SuperFrost De plus des lames de microscope. Disposez les sections et d'absorber l'excès de tampon de lavage avec un pinceau fin. Éviter l'exposition prolongée à la lumière. Incuber les lames à température ambiante, afin de permettre aux sections de sécher les sections sur la lame (5-30 min).
  9. Appliquer quelques gouttes de milieu de montage (ProLongGold, Vectashield ou similaire), lentement place une lamelle de verre sur les sections. Autoriser les diapositives de s'asseoir dans l'obscurité pendant 5 min, puis sceller les bords avec un clou lamelle transparentepolir. Laisser sécher à l'air pendant 15-20 min. Les diapositives peuvent désormais être visualisés ou stockés à -20 ° C pendant plusieurs années sans perte significative de la fluorescence.

3.2. Sections d'os Limb - sur diapositives coloration

  1. Autoriser les diapositives pour retourner à la RT de -20 ° C de stockage. Utiliser un stylo barrière hydrophobe (Super Pen Liquid Pap blocage, Ted Pella Inc) circonscrire la région sur la diapositive contenant les sections d'os à être colorés avec une généreuse couche de solution. Laisser sécher à l'air pendant 10-15 min.
  2. Laver les coupes osseuses avec 250 pi de 0,1 M PB par diapositive pendant 5 minutes et répétez l'opération pour deux fois plus.
  3. Jeter la solution de lavage et incuber les sections d'os dans la solution de blocage, composée de sérum de chèvre 10% et 0,3% de Triton X-100 dans 0,1 M PB (250 pl d'une solution de blocage par diapositive) pendant 1 h à 4 ° C.
  4. Jeter la solution de blocage et incuber les sections d'os dans l'anticorps primaire (ou une combinaison d'anticorps primaires, en casd'immunomarquage doubles tel que mentionné sous 3.1.4) dilué dans 250 ul solution de blocage pendant 18-24 h à 4 ° C. Il est très important de noter que les lames doivent être placés dans une chambre humidifiée avec un couvercle étanche, afin d'éviter le dessèchement de la solution d'anticorps primaire. Afin de colorer les fibres nerveuses sensitives périphériques, le ci-dessus ensemble des anticorps (voir section 3.1.4) peut être utilisé avec des concentrations similaires de travail.
  5. Laver les coupes de tissus avec 250 pi de solution de blocage (avec du Triton X-100) par diapositive pendant 15 min à température ambiante et répétez 3 fois plus.
  6. Jeter la solution de lavage et incuber sections d'os dans appropriés fluorophore conjugué anticorps secondaire (généralement diluée à 1:1000 dans une solution de blocage, 250 pi) à 4 ° C. La chambre de coloration doit être enveloppé dans du papier aluminium pour éviter de photoblanchiment des fluorophores. Pour plus de commodité, il est conseillé d'utiliser des chambres coloration foncée (p.ex. boîte d'incubation Glisse plateau /, RPI Corp.)
  7. Wles sections de cendres d'os avec 250 pl d'une solution de blocage par diapositive pendant 15 min à température ambiante. Ensuite laver avec 500 ul de 0,1 M PB pendant 15 min à température ambiante. Enfin, laver avec 500 ul de 0,05 M PB pendant 15 min à température ambiante. Tremper brièvement dans ddH 2 O pour le rinçage des diapositives et puis incuber à température ambiante afin de permettre à des sections d'os à l'air sec (5-30 min). Éviter l'exposition prolongée à la lumière.
  8. Appliquer quelques gouttes de milieu de montage (ProLongGold ou similaire) et lentement place une lamelle de verre sur les sections. Laissez les diapositives se dans l'obscurité pendant 5 min, puis sceller les bords lamelle avec du vernis à ongles transparent. Laissez sécher pendant 15-20 min. Les diapositives peuvent être stockés à -20 ° C pendant plusieurs années sans perte de fluorescence.

4. Les résultats représentatifs

4.1. Plantaire sections poinçon

Plantaire des coupes de tissus poinçon peuvent être visualisées sous microscope à épifluorescence, ou sous un microscope confocal avec un 10X, 63X ou 40X objectif.

Figure 1
Figure 1. AD montrent une coloration au collagène IV d'anticorps (vert) dans les membranes basales, à la jonction dermo-épidermique et dans le cartilage et le muscle. De nombreuses fibres CGRP (AB, rouge) et NF200-positifs (CD, rouge) sont distribués à travers la peau de la souris dans la région plantaire (flèches). β3-tubuline est un marqueur pan-neuronale (E, rouge), alors que TRPV1 coloration (F; rouge) se limite principalement à des fibres de petit diamètre qui sont également CGRP-positives (vert; pointes de flèches). A et C sont des images prises à épifluorescence avec un objectif 10X (barre d'échelle -500 um), B, D, E et F sont des composites image confocale généré à partir d'une image de 11 z-stack prises à incréments de 2 um sous un objectif 60X (échelle bar - 50 microns).

4.2. Sections d'os Limb

Sections Limb tissu osseux peuvent également être visualisés sous microscope à épifluorescence, ou sous un microscop confocalee avec un 10X, 63X ou 40X objectif.

Figure 2
. La figure 2 montre immunomarquage anti-CGRP (AB, rouge, flèches), anti-NF200 (CD, rouge, flèches), anti-β3-tubuline (E; rouge) et anti-TRPV1 (F; rouge) co-tachés avec des anticorps anti-CGRP (vert, flèches). Ces images montrent les sous-types de fibres nerveuses sensitives réparties dans la matrice osseuse dans la région de la tête spongieuse du fémur de souris. A et C sont des images prises à épifluorescence avec un objectif 10X (barre d'échelle -500 um), B, D, E et F sont des composites image confocale généré à partir d'une image de 11 z-stack prises à incréments de 2 um sous un objectif 60X (échelle bar - 50 microns).

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Discussion

Ici, nous avons détaillé les méthodes de préparation de la peau des souris et des coupes de tissus osseux pour immunomarquage et la détection des périphériques fibres nerveuses sensitives. Les sections produite à partir de biopsies plantaires contiennent à la fois la peau glabre et poilue, ce qui signifie que le protocole peut être utilisé sur tout type de peau. Ces techniques peuvent également être employées pour colorer les autres types de cellules dans ces tissus (leucocytes, vasculaire endothélium, muscle lisse, entre autres). Ces méthodes fournissent un excellent compromis entre la préservation ultrastructurale optimale (ce qui est réalisé par fixation glutaraldéhyde, mais donne souvent lieu à des perturbations des épitopes et diminué la qualité de coloration immunologique) et la détectabilité immunocytochimiques, si les procédures sont suivies étape par étape, de manière rigoureuse.

Détection des fibres nerveuses sensorielles dans ces tissus peut contribuer à notre compréhension de la régulation de la croissance des neurites périphériques et la germination 4, uns ainsi que les changements anatomiques dans les zones périphériques des afférences sensorielles dans différentes conditions pathologiques. Par ailleurs, des changements dans l'expression des neurotransmetteurs, les récepteurs, canaux ioniques ou d'autres marqueurs phénotypiques dans des conditions normales ou pathologiques de développement peuvent également être étudiés 3,5-10. Avec les tests électrophysiologiques, biochimiques et comportementaux appropriés, de tels changements dans sensorielle périphérique schémas de coloration des neurones peuvent être utilisés pour tester les hypothèses relatives à des états de douleur différentes 6,9, 11 et l'inflammation des neuropathies 5,12. En conclusion, ces techniques fournissent une source inestimable de données in vivo qui complètent et renforcent anatomiques, les données structurelles et fonctionnelles acquises par d'autres approches, approfondir notre compréhension de la régulation et l'acquisition de la plasticité dans les zones périphériques des fibres nerveuses sensorielles dans la santé et la maladie.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêts déclarés.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr M. Yuriy Usachev pour son aide dans la normalisation initiale de la microscopie confocale / imagerie de la souris immunomarquage plantaires biopsie, et le Dr Donna L. Hammond pour son aide continue et la critique constructive à ce travail. Ce travail a été financé par des subventions du NINDS / NIH (NS069898), et une attribution de subvention Idée de développement du ministère de la Défense de la prostate Cancer Research Programme (DoD-PCRP-101096) pour DPM

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella, Inc. 15094
Perfusion pump Material VWR international 23609-170
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material Research Products International Corp. 248270 (tray) 248270-A (lid)
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella, Inc. 11859
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930

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References

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