Tissue Forberedelse og immunfarvning af Mouse sensoriske nervefibre innerverer hud og lemmer Bones

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Immuncytokemiske identifikation af perifer sensorisk nerve fiber undertyper (og påvisning af protein udtryk deri) er nøglen til forståelsen af ​​molekylære mekanismer, der ligger perifert sensation. Her har vi beskrive metoder til udarbejdelse af perifere / viscerale vævsprøver, såsom hud og lemmer knogler, for specifikke immunfarvning af perifere sensoriske nervefibre.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Detection og primær behandling af fysiske, kemiske og termiske sensoriske stimuli af perifere sensoriske nervefibre er nøglen til sansning i dyr og mennesker. Disse perifere sensoriske nervefibre udtrykke et væld af receptorer og ion-kanal proteiner, som registrerer og iværksætte specifikke sensoriske stimuli. Der findes metoder til karakterisere de elektriske egenskaber af perifere sensoriske nervefibre innerverer huden, som også kan bruges til at identificere funktionelle udtryk for specifikke ion-kanal proteiner i disse fibre. Men lignende elektrofysiologiske metoder er ikke tilgængelige (og er også vanskeligt at udvikle) til påvisning af den funktionelle udtryk af receptorer og ion-kanal proteiner i perifere sensoriske nervefibre innerverer andre indre organer, herunder de mest udfordrende væv såsom knogle. Desuden kan sådanne elektrofysiologiske metoder ikke anvendes til at bestemme et udtryk for ikke-overgearet proteinS i perifere sensoriske nervefibre. Derfor immunfarvning af perifere / viscerale vævsprøver for sensoriske nerve Håndbold giver den bedst mulige måde til at bestemme et udtryk for specifikke proteiner af interesse i disse nervefibre. Hidtil har de fleste protein udtryk studier i sensoriske neuroner udnyttet immunfarvning procedurer i sensoriske ganglier, hvor oplysningerne er begrænset til ekspression af specifikke proteiner i cellen kroppen af ​​bestemte typer eller delmængder af sensoriske neuroner. Her rapporterer vi detaljerede metoder / protokoller for udarbejdelsen af ​​perifere / viscerale vævsprøver for immunfarvning af perifere sensoriske nervefibre. Vi har specielt detalje metoder til forberedelse af huden eller plantar punch biopsi og knogler (femur) afsnit fra mus til immunfarvning af perifere sensoriske nervefibre. Disse metoder er ikke kun nøglen til kvalitativ bestemmelse af protein udtryk i perifere sensoriske neuroner, men også give en kvantitativ analyse metode tilafgørende ændringer i protein udtryk niveauer i bestemte typer eller delmængder af sensoriske fibre, samt til bestemmelse af morfologiske og / eller anatomiske ændringer i antallet og tætheden af ​​sensoriske fibre under forskellige patologiske tilstande. Desuden er disse metoder ikke begrænset til farvning af kun sensoriske nervefibre, men kan også bruges til farvning alle typer af nerve fibre i huden, knogler og andre viscerale væv.

Protocol

1. Animal perfusion

Alle dyreforsøg udføres i denne undersøgelse er godkendt af Institutional Animal Care og brug udvalg fra University of Iowa, og følg NIH retningslinier for brug af dyr i forskningsøjemed.

  1. På dagen før perfusion, forberede 1 L af fosfat buffer (0,2 M PB i dobbelt destilleret H 2 O, pH 7,4), og opbevares ved 4 ° C. Dette vil blive anvendt til perfusion og post-fiksering processer.
  2. På dagen for perfusion, forberede 500 ml 4,0% paraformaldehyd i 0.1M PB (PFA, pH 7,4) fikseringsopløsning, et volumen tilstrækkelig til perfusion af 2 mus: mikrobølgeovn 200 ml af Hedeselskabet 2 O i et glas bægerglas i 30 sek eller indtil den nærmer sig kogepunktet. Tilsæt 20 g granulat paraformaldehyd (PFA) til bægerglasset med konstant omrøring under en emhætte. Tilsæt 5 ml 5 N NaOH dråbevist og rør indtil opløsningen rydder. Når PFA er helt opløst, Opløsningen afkøles til stuetemperatur (RT). Slowly tilsættes 250 ml af 0,2 M PB under stadig omrøring. Brug gradvist svagere HCl-løsninger (6 N til 1 N til 0,1 N), justere pH til 7,4. Det endelige rumfang justeres til 500 ml og chill på is. Også forberede 400 ml 0,1 M PB fra 0,2 M lager ved at fortynde 1:1 i Hedeselskabet 2 O og chill på is.
  3. Bedøver musen ved intraperitonial injektion af en overdosis af bedøvelse (sodium pentobarbital, 80 mg / kg, administreret med en 27G kanyle).
  4. Under perfusion, vil 50 ml af 0,1 M PB (fortynde 0,2 M PB lager 1:1 med DDH 2 O) og 150 ml af PFA være bestået sekventielt ind i musen omløb. Konfigurer peristaltisk pumpe ved at fylde slangen med PB og fastsættelse af en 23 1 / 2 G butterfly nål i den ene ende. Fordyb den anden ende af slangen i bægeret indeholder 0,1 M PB. Sæt hastigheden på peristaltisk pumpe til 10 ml / min, og pumpe gennem en tilstrækkelig mængde af løsningen for at sikre, at der ikke er luftbobler i slangen.
  5. Vent, indtil den anesthetized musen ikke længere viser nogen refleks aktivitet, som f.eks toe / hale knivspids og blinke refleks. Læg dyret på en dissektion bakke ventrale side op inde i et stinkskab og sikre poter med tape. Spray pelsen med 70% ethanol. Lav et snit gennem huden langs midterlinjen at blotlægge brystkassen og den øverste fjerdedel af bugvæggen. Derefter skar gennem bugvæggen i bunden af ​​brystkassen. Efter at denne incision, skal mellemgulvet og nederste del af brystbenet være synlige. Skær forsigtigt fra venstre mod højre gennem margenen af ​​mellemgulvet, og langs den fulde længde af brystbenet, pas på ikke at beskadige lungerne. Nogle mindre blødning fra brystbenet i denne fase er normalt og vil ikke gå på kompromis perfusion. Når snit langs brystbenet er blevet foretaget, og mellemgulvet snit, bør det være muligt at løfte hver halvdel af brystkassen opad og udad, således at hjertet er udsat for. Flyt til side i lungerne, hvis det er nødvendigt. Begge halvdele af brystkassen kanholdes i denne position med brugen af ​​hæmostatisk klemmer. Sæt butterfly nål (23 1 / 2 G) knyttet til den peristaltiske pumpe 3-4 mm ind i venstre hjertekammer, parallelt med den lange akse af dyret. Denne placering minimerer risikoen for, at nålen bliver fortrængt. Lav et lille snit i højre atrium at returnere cirkulation til at flyde ud af hjertet.
  6. Begynd perfusion med 0,1 M PB ved 10 ml / min i 4-5 min. Hvis der er stadig en betydelig mængde blod stammer fra højre atrium på dette tidspunkt, fortsætter, indtil strømmen er klar.
  7. Stop strømmen af ​​PB og skifte indløb på peristaltisk pumpe til 4% PFA løsning. Reducer flow til 5 ml / min og genoptage pumpning PFA-løsning i 20-25 min. Da PFA kommer ind i omsætning, muskler gå i spasmer, og efter et par minutter, bør dyret bogstaveligt "fast" i stilling. Denne stivhed kan afprøves ved forsigtigt at skubbe mod hindpaws, pas på ikke at flytte dyret ennd løsne kanylen. Gode ​​perfusion vil forhindre lemmer fra nedbøjning som svar. Når perfusion med PFA er fuldført, kan kanylen og hæmostatisk klemmer være afbrudt, og den døde krop klar til væv dissektion. Den dissektion anvendte metode afhænger af den specifikke væv.
  8. Forbered 4% PFA / 5% (v / v) pikrinsyre (PA, for indsamling og efterfølgende fiksering af plantar Punch kun) ved at tilføje mættet pikrinsyre løsning på 4% PFA. Inddragelse af PA forbedrer antigen sporbarhed i perifert neuronale væv 1
  9. Forbered knogle / brusk væv afkalkningsprogram / kryoprotektant løsning - 10% EDTA i 0,1 M PB med 0,07% glycerol og 15% saccharose. EDTA-baserede løsninger afkalke væv og samtidig bevare epitoper 2.
  10. Forbered kryoprotektant løsning - 30% saccharose i 0,1 M PB.

2. Tissue Dissektion / Fjernelse, Post-fiksering og Sektionering

  1. Plantar Punch
    Placer perfused dyr ventrale nedad på en Skæreunderlag eller andre robust overflade. Hold foden plantar overflade-up, tryk hårdt nedad med punch biopsi værktøj (3 mm i diameter; Harris mikro-punch, Ted Pella Inc.) ind i midten af ​​foden. Drej biopsi værktøjet frem og tilbage gennem 180 grader for at bekræfte biopsi værktøjet har skåret igennem hele den bageste pote. Fjern forsigtigt biopsi værktøjet fra foden og skubbe vævet ind i sterile 2 ml rør med hætte, indeholdende 1 ml 4% PFA / 5% pa løsning.
  2. Limb Bone (ex. femur)
    Lav en lateral snit langs bagsiden af ​​dyret på niveau med bækken og fortsætter ned langs begge bagben. Skær i bækkenet og de omkringliggende muskler til at adskille låret fra bækken, mens de forlader proximale hovedet på lårbenet intakt. Skæres i skinnebenet / fibula til at forlade den distale hovedet intakt, fjerne de omkringliggende muskler / periost fra knoglerne akslen. Placer lårbenet i en 2 ml rør, som indeholder 1 ml 4% PFA /5% pa løsning.
  3. Post-fix de vævsprøver i 4% PFA / 5% PA-løsning, med blid blanding på en rocker for 16-18 timer ved 4 ° C
  4. Afkalkningen af væv som følger: For plantar punch (afkalkningen af små knogler i foden) sted i vævet punch i et sterilt 2 ml rør med hætte, indeholdende 1,5 ml 10% EDTA-opløsning i 0,1 M PB med 0,07% glycerol og 15 % saccharose. Læg røret på en rocker med mild blanding til 16-18 timer ved 4 ° C. For lemmer knogler placere vævet i et sterilt 2 ml rør med hætte, indeholdende 1,5 ml 10% EDTA-opløsning i 0,1 M PB med 0,07% glycerol og 15% saccharose. Læg røret på en rocker med mild blanding for 6-7 dage ved 4 ° C. Den afkalkning Opløsningen skal skiftes hver 24 timer og vævet overvåges for tab af stivhed med et par pincet.
  5. Overfør væv i en steril 2 ml rør med hætte med 1,5 ml kryoprotektant opløsning (30% saccharose i 0,1 M PB), og placer røret på en rocker wed mild blanding for 16-18 timer ved 4 ° C.
  6. Forbered væv til sektionering: placere en seng mængde optimale skære temperatur (OLT) sammensatte (Sakura Finetek USA Inc.) på en kryostat væv Monteringsklods og lad dem fryse i kryostat kammer (typisk holdes på -20 ° C). En kryogen aerosol (CYTO-fryse, Control Co USA) kan også sprøjtes på OLT til at fremskynde frysning processen. Placer vævsprøve på denne seng af OLT og dække med et ekstra tyndt lag af oktober Forsigtigt spray dette OLT med kryogene aerosol, indtil det er hærdet og vævet inden er frosset. Placer prøven på at skære hovedet i kryostat kammer og lad vævsprøve blokken afbalancere til at skære temperatur - mindst 1 time. Forsøger at afsnittet, når indlejring sammensatte er stadig for koldt resultater i sprøde sektioner og vævsskader.
  7. Når vævet har nået en optimal skære temperatur, begynder at skære prøven og generere 40 μm sektioner.
  8. For plantar Punch indsamle cryosections i 12-såvel vævskultur plader indeholder 0,1 M PB med 10 mM natriumazid. Sørg for, at sektioner forbliver nedsænket i denne løsning ved 4 ° C. Sektioner kan opbevares på denne måde i op til 4-6 måneder for immunfarvning formål. Alternativt kan frit svævende sektioner opbevares på ubestemt tid i kryoprotektant løsning ved -20 ° C (500 ml 0,1 M PBS, pH 7,2, 30 g sukker, 10 g PVP40, 300 ml ethylenglycol). Juster endelige volumen til 1L med destilleret vand) 3. For lemmer knogler indsamle cryosections direkte på gelatine pre-belagt slides (eller SuperFrost Plus dias, Fisher Scientific) og lad det lufttørre i 1 time, før opbevaring ved -20 ° C. Bone afsnittene om dias opbevaret på denne måde kan bruges til immunfarvning formål inden for 2-3 måneder.

3. Immunfarvning af vævssnit for Sanse nervefibre

3.1. Plantar Punchsektioner - flydende sektion farvning

  1. Ved hjælp af et barberblad, skåret 6-7 mm fra enden af ​​en 1 ml mikropipette spids. Forudsætning indersiden af ​​spidsen ved sugning 1% føtalt bovint serum (FBS) i 0,1 M PB flere gange (dette hæmmer stikke af vævssnit til væggene i spidsen). Overførsel plantar Punch Rubrikker, der skal farves til en 24-såvel vævskultur pladen. Normalt 8-10 sektioner skal farves per brønd for at sikre flere af høj kvalitet sektioner er genereret pr immunfarvning.
  2. Vask plantar Punch sektioner med 500 μl af 0,1 M PB per godt i 5 min med kraftig blander på en rocker på RT. Gentag 2 gange.
  3. Kassér vaskeopløsning og inkuber plantar Punch sektioner i blokerende opløsning, bestående af 10% ged serum og 0,3% Triton X-100 i 0,1 M PB (500 μl blokerende opløsning pr godt), med blid blanding på en rocker i 1 time ved 4 ° C.
  4. Kassér blokerende opløsning, og inkubér vævssnit i primær antibody / antistoffer fortyndet i 250 μl blokerende opløsning for 18-24 timer med blid blanding på en rocker ved 4 ° C. Baseret på investigators eksperimenterende krav, enkelt immunolabeling (med et primært antistof mod et bestemt protein eller nerve fiber markør), eller dobbelt immunolabeling (med to primære antistoffer mod to proteiner eller nerve fiber markører) kan udføres på den samme sektion. Under udførelsen dobbelt immunolabeling er det vigtigt at kontrollere, at de to primære anvendte antistoffer er rejst i forskellige værtsarter (fx én opvokset i mus og et opvokset i kanin), eller alternativt, renset monoklonale antistoffer af forskellige immunglobulin G (IgG) isotypes (fx en IgG1 og et IgG2a) kan anvendes. Det er tilrådeligt at forsegle skiltet med Parafilm for overnatning inkubationer for at undgå for stor fordampning. For at bejdse de perifere sensoriske nervefibre, kan flere specifikke antistoffer anvendes. Antistoffer mod proteinet neurofilament 200 (NF200, Sigma) label LARGE-diameter fibre, mens calcitonin gen-relateret peptid (CGRP, Sigma) og forbigående receptor potentielle vanilloid 1 (TRPV1, Neuromics) label peptidergic, lille diameter perifere sensoriske fibre. Alle perifer nerve fibre kan også farves med antistoffer mod β3-tubulin. I huden, er kollagen IV (Abcam), der anvendes til at afgrænse kælderen membran, der adskiller epidermis fra dermis. Som en generel regel, skal antistoffer at være 5-10 gange mere koncentreret end for kultiverede cellebaserede immunfluorescens assays, typisk på en arbejdsgruppe koncentration på 5-10 mg / ml.
  5. Vask vævssnit med 500 μl af blokerende opløsning (med Triton X-100) per godt i 5 min med kraftig blander på en rocker på RT. Gentag 3 gange.
  6. Kassér vaskeopløsning og inkuber vævssnit i passende fluoroforen-konjugerede sekundære antistoffer (typisk fortyndet 1:1000 i blokerende opløsning, 500 μl) med blid blanding på en rocker ved 4 ° C. Pladen must være indpakket i aluminiumsfolie for at undgå fotoblegning af fluorophores.
  7. Vask vævssnit med 500 μl af blokerende opløsning per brønd i 10 min med kraftig blander på en rocker på RT. Derefter vaskes med 500 μl af 0,1 M PB med kraftig blanding i 10 min ved RT. Endelig vaskes med 500 μl af 0,05 mio PB med kraftig blanding i 10 min ved RT.
  8. Ved hjælp af en 1 ml mikropipette med en FBS-behandlede spids (skåret 6-7 mm fra enden), opsug sektioner fra vævskultur pladen og overførsel til SuperFrost Plus objektglas. Arranger de sektioner og absorberer overskydende vaskebuffer med en fin pensel. Undgå langvarig udsættelse for lys. Inkubér dias på RT, for at give sektioner for at tørre sektioner på slide (5-30 min).
  9. Påfør adskillige dråber Mounting Medium (ProLongGold, Vectashield eller lignende), langsomt placere et dækglas på sektioner. Lad dias til at sidde i mørke i 5 min, og derefter forsegle dækglasset kanterne med gennemsigtige neglepolish. Tillad luft-tørring i 15-20 min. De slides kan nu visualiseres eller opbevares ved -20 ° C i flere år uden væsentligt tab af fluorescens.

3.2. Limb knogle sektioner - on-slide farvning

  1. Lad dias at vende tilbage til RT fra -20 ° C opbevaring. Ved hjælp af en vandafvisende barriere pen (Super Pap Liquid Blokering Pen, Ted Pella Inc.) afgrænse området på diaset indeholder knoglen sektioner, der skal farves med en generøs lag af opløsningen. Lad dem lufttørre i 10-15 min.
  2. Vask knoglen sektioner med 250 μl af 0,1 M PB pr slide i 5 min og gentag til 2 gange mere.
  3. Kassér vaskeopløsning og inkuber knoglen sektioner i blokerende opløsning, bestående af 10% ged serum og 0,3% Triton X-100 i 0,1 M PB (250 μl blokerende opløsning pr dias) i 1 time ved 4 ° C.
  4. Kassér blokerende opløsning og inkuber knoglen sektioner i de primære antistof (eller en kombination af primære antistoffer, i tilfældeaf dobbelt immunolabeling som nævnt under 3.1.4) fortyndes i 250 μl blokerende opløsning i 18-24 timer ved 4 ° C. Det er meget vigtigt at bemærke, at dias skal placeres i et befugtet kammer med et forseglet låg, for at undgå udtørring af primær antistof løsning. For at bejdse de perifere sensoriske nervefibre, ovennævnte sæt af antistoffer (se afsnit 3.1.4) kan anvendes med samme arbejde koncentrationer.
  5. Vask vævssnit med 250 μl af blokerende opløsning (med Triton X-100) pr slide i 15 min ved RT og gentag for 3 gange mere.
  6. Kassér vaskeopløsning og inkuber knogle sektioner i passende fluoroforen-konjugerede sekundære antistoffer (typisk fortyndet 1:1000 i blokerende opløsning, 250 μl) ved 4 ° C. Den farvning Kammeret skal være pakket ind i aluminiumsfolie for at undgå fotoblegning af fluorophores. For nemheds skyld, er det tilrådeligt at bruge mørke-farvede pletter kamre (f.eks Slide inkubation bakke / kasse, RPI Corp).
  7. Waske knoglen sektioner med 250 μl af blokerende opløsning pr slide i 15 min ved RT. Derefter vaskes med 500 μl af 0,1 M PB i 15 min ved RT. Endelig vaskes med 500 μl af 0,05 mio PB i 15 min ved RT. Dip kort i Hedeselskabet 2 O at skylle dias og derefter inkuberes ved RT, således at knoglen sektioner for at lufttørre (5-30 min). Undgå langvarig udsættelse for lys.
  8. Påfør adskillige dråber Mounting Medium (ProLongGold eller lignende) og langsomt placere et dækglas på sektioner. Lad objektglassene stå i mørke i 5 min, og derefter forsegle dækglasset kanterne med gennemsigtig neglelak. Tillad tørring i 15-20 min. Slides kan opbevares ved -20 ° C i flere år uden tab af fluorescens.

4. Repræsentative resultater

4.1. Plantar Punch sektioner

Plantar Punch vævssnit kan visualiseres under epifluorescence mikroskop, eller under en konfokal mikroskop med en 10X, 40X og 63X mål.

Figur 1
Figur 1. AD show farvning med Collagen IV antistof (grøn) i kælderen membraner, på epidermal-dermal Junction og i brusk og muskler. Talrige CGRP-(AB, rød) og NF200-positive fibre (CD, red) er fordelt over hele musen huden i plantar regionen (pile). β3-tubulin er et pan-neuronal markør (E, rød), mens TRPV1 farvning (F; rød) hovedsageligt er begrænset til lille diameter fibre, der også er CGRP-positive (grønne, pilespidser). A og C er epifluorescence billeder taget med et 10X mål (skala bar -500 μm), B, D, E og F er konfokal billede kompositter genereret fra en 11-billede z-stack taget ved 2 μm trin under en 60X målsætning (skala bar - 50 m).

4.2. Limb knogle sektioner

Limb knoglevæv sektioner kan også visualiseres under epifluorescence mikroskop, eller under en konfokal microscope med en 10X, 40X og 63X mål.

Figur 2
. Figur 2 viser immunfarvning med anti-CGRP (AB, rød, pile), anti-NF200 (CD, rød, pile), anti-β3-tubulin (E, rød) og anti-TRPV1 (F; rød) co-farvet med anti-CGRP antistof (grøn; pile). Disse billeder viser undertyper af sensoriske nervefibre fordelt over hele knoglematrix i den svampede hovedet regionen musen lårbenet. A og C er epifluorescence billeder taget med et 10X mål (skala bar -500 μm), B, D, E og F er konfokal billede kompositter genereret fra en 11-billede z-stack taget ved 2 μm trin under en 60X målsætning (skala bar - 50 m).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her har vi detaljeret de metoder til udarbejdelse af mus hud-og knoglevæv sektioner for immunfarvning og afsløring af perifere sensoriske nervefibre. Afsnittene fremstillet af plantar hudbiopsier indeholder både glatte og behårede hud, hvilket betyder, at protokollen kan bruges på enhver hudtype. Disse teknikker kan også anvendes til farvning af andre celletyper i disse væv (fx leukocytter, vaskulær endothelia, glatte muskelceller blandt andre). Disse metoder giver et glimrende kompromis mellem optimale ultrastrukturelle bevarelse (som er opnået ved glutaraldehyd fiksering, men ofte resulterer i forstyrrelser af epitoper og formindskede immunfarvning farvning kvalitet) og immuncytokemiske sporbarhed, hvis procedurerne er fulgt trin-for-trin på en streng måde.

Påvisning af sensoriske nervefibre i disse væv kan støtte i vores forståelse af reguleringen af perifere neurite udvækst og spiring 4, ens samt anatomiske ændringer i perifer sensorisk afferenter under forskellige patologiske tilstande. Desuden kan ændringer i udtrykket af neurotransmittere, receptorer, ionkanaler eller andre fænotypiske markører i normale udviklingsmæssige eller patologiske betingelser også blive undersøgt 3,5-10. Sammen med passende elektrofysiologiske, biokemiske og adfærdsmæssige test, kan sådanne ændringer i perifer sensorisk neuron farvede mønstre kan bruges til at teste hypoteser relateret til forskellige smerter hedder 6,9, inflammation 11 og neuropatier 5,12. Konklusionen er, giver disse teknikker en uvurderlig kilde til in vivo-data, der supplerer og styrker andre anatomiske, strukturelle og funktionelle data indhentet via yderligere tiltag, fremme vores forståelse af regulering og erhvervelse af plasticitet i perifere sensoriske nervefibre i sundhed og sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Yuriy M. Usachev for hans hjælp i den indledende standardisering af konfokal mikroskopi / billeder af mus plantar punch biopsi immunfarvning, og Dr. Donna L. Hammond for hendes fortsatte hjælp og konstruktiv kritik i dette arbejde. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra NINDS / NIH (NS069898), og en Idéudvikling Grant Award fra Department of Defense Prostate Cancer Research Program (DoD-PCRP-101096) til DPM

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella, Inc. 15094
Perfusion pump Material VWR international 23609-170
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material Research Products International Corp. 248270 (tray) 248270-A (lid)
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella, Inc. 11859
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
  2. Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
  3. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
  4. Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
  5. Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
  6. Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
  7. Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
  8. Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
  9. Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
  10. Persson, A. -K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
  11. Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
  12. Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics