Tissue Upprättande och immunfärgning av Mouse känselnervtrådar Innervating Hud och Limb Bones

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Immuncytokemiska identifiering av perifer sensorisk subtyper nervtråd (och upptäckt av proteinuttryck däri) är nyckeln till förståelsen av molekylära mekanismerna bakom perifera sensation. Här beskriver vi metoder för beredning av perifer / visceral vävnadsprover, till exempel hud och lem ben, för specifika immunfärgning av perifera sensoriska nervtrådar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Upptäckt och primär behandling av fysiska, kemiska och termiska sensoriska stimuli genom perifer känselnervtrådar är nyckeln till sensorisk perception hos djur och människor. Dessa perifera sensoriska nervtrådar uttrycker en uppsjö av receptorer och jon proteiner kanal som upptäcker och initiera specifika sensoriska stimuli. Det finns metoder att karakterisera de elektriska egenskaperna hos perifera sensoriska nervtrådar innervating huden, som också kan utnyttjas för att identifiera den funktionella uttrycket av specifika proteiner jonkanaler i dessa fibrer. Men liknande elektrofysiologiska metoder finns inte (och är också svårt att utveckla) för detektion av den funktionella uttryck av receptorer och jon proteiner kanal i perifera sensoriska nervtrådar innervating andra inre organ, inklusive de mest utmanande vävnader såsom ben. Dessutom kan sådana elektrofysiologiska metoder inte användas för att bestämma ett uttryck för icke-hetsiga proteinS i perifera sensoriska nervtrådar. Därför ger immunfärgning av perifer / viscerala vävnadsprover för sensorisk nerv fivers på bästa möjliga sätt för att bestämma uttrycket av specifika proteiner av intresse för dessa nervtrådar. Hittills har de flesta av de studier proteinuttryck i sensoriska neuroner utnyttjas immunfärgning förfaranden i sensoriska ganglier, där informationen är begränsad till uttryck av specifika proteiner i cellen organ av specifika typer eller delmängder av sensoriska neuroner. Här rapporterar vi detaljerade metoder / protokoll för beredning av perifer / viscerala vävnadsprover för immunfärgning av perifera sensoriska nervtrådar. Vi specifikt detalj metoder för beredning av huden eller plantar punsch biopsi och ben (lårbenet) sektioner från möss immunfärgning av perifera sensoriska nervtrådar. Dessa metoder är inte bara nyckeln till kvalitativ bestämning av proteinuttryck i perifera sensoriska neuron, utan även ge en kvantitativ metod för att fastställaatt bestämma förändringar i proteinnivåer uttryck i specifika typer eller delmängder av sensoriska fibrer, samt för att bestämma morfologiska och / eller anatomiska förändringar i antalet och densitet av sensoriska fibrer vid olika sjukdomstillstånd. Dessutom är dessa metoder inte är begränsad till färgning av endast sensoriska nervfibrer, men kan även användas för färgning alla typer av nervtrådar i hud, ben och andra viscerala vävnader.

Protocol

1. Animal perfusion

Alla animaliska ingrepp i denna studie är godkända av Institutional Animal Care och användning kommitté vid universitetet i Iowa, och följa NIH riktlinjer för användning av djur i forskning.

  1. På dagen innan perfusionen, förbereda ett L i fosfatbuffert (0,2 M PB i dubbeldestillerat H 2 O, pH 7,4) och förvara vid 4 ° C. Detta kommer att användas för perfusion och efter fixering processer.
  2. På dagen av perfusionen, förbereda 500 ml 4,0% paraformaldehyd i 0,1 miljoner PB (PFA, pH 7,4) Fixeringslösning, en volym tillräcklig för att genomblödningen i två möss: mikrovågsugn 200 ml DDH 2 O i en glasbägare på 30 sek eller tills den närmar sig kokande. Tillsätt 20 g granulat paraformaldehyd (PFA) i bägaren under ständig omrörning i ett dragskåp. Tillsätt 5 ml 5 N NaOH droppvis och rör tills lösningen försvinner. När PFA helt upplöst, Kyl lösningen till rumstemperatur (RT). Slowly tillsätt 250 ml 0,2 M PB under ständig omrörning. Använda progressivt svagare HCl lösningar (6 N till 1 N till 0,1 N), justera pH till 7,4. Justera den slutliga volymen till 500 ml och chill på is. Också förbereda 400 ml 0,1 M PB från 0,2 miljoner aktier genom att späda 1:1 i DDH 2 O och chill på is.
  3. Bedöva musen genom intraperitonial injektion av en överdos av narkosmedel (natrium pentobarbital, 80 mg / kg, ges tillsammans med en 27G nål).
  4. Under perfusion, kommer 50 ml 0,1 M PB (späda 0,2 M PB lager 1:1 med DDH 2 O) och 150 ml av PFA föras sekventiellt i musen cirkulationen. Ställ in peristaltiska pumpen genom att fylla slangen med PB och fastställande av en 23 1 / 2 G fjäril nål i ena änden. Sänk den andra änden av slangen i bägaren innehållande 0,1 M PB. Ställ in hastigheten på peristaltiska pumpen till 10 ml / min, och pumpen genom en tillräcklig mängd av lösningen för att säkerställa att det inte finns några luftbubblor i slangen.
  5. Vänta tills ennesthetized musen inte längre visar några reflex aktivitet, såsom tå / svans nypa och blinkar reflex. Lägg djur på en dissekering bricka ventralsidan upp inuti ett dragskåp och säkra tassar med tejp. Spraya pälsen med 70% etanol. Gör ett snitt genom huden längs med mittlinjen att exponera bröstkorgen och den översta fjärdedelen av bukväggen. Sedan skär genom bukväggen vid basen av bröstkorgen. Efter att detta snitt bör membranet och nedre delen av bröstbenet vara synlig. Skär försiktigt från vänster till höger via marginalen i mellangärdet, och längs hela av bröstbenet, se till att inte skada lungorna. Vissa mindre blödning från bröstbenet i detta skede är normalt och kommer inte att äventyra perfusion. När snitt längs bröstbenet har gjorts och membranet skär, bör det vara möjligt att lyfta varje halva av bröstkorgen uppåt och utåt, så att hjärtat utsätts för. Flytta undan lungorna om det behövs. Båda halvorna av bröstkorgen kanhålls i denna position med hjälp av BLODSTILLANDE klämmor. Sätt fjärilen nålen (23 1 / 2 G) bifogas Slangpumpar 3-4 mm i vänster kammare, parallellt med den långa axeln av djuret. Denna placering minimerar risken för nålen rubbas bli. Gör ett litet snitt i höger förmak så att återvända cirkulationen att flöda ut från hjärtat.
  6. Börja perfusion med 0,1 M PB på 10 ml / min i 4-5 min. Om det fortfarande finns en stor mängd blod som kommer från höger förmak vid denna punkt, fortsätta tills flödet är klart.
  7. Stoppa flödet av PB och slå inloppet på peristaltiska pumpen till 4% PFA-lösning. Minska flödet till 5 ml / min och fortsätta pumpa PFA lösning för 20-25 min. Som PFA går in i cirkulationen, musklerna gå in spasm, och efter några minuter, ska djuret bokstavligen "fast" i sitt läge. Denna stelhet kan testas genom att försiktigt trycka mot hindpaws, se till att inte flytta djuret ennd lossa kanylen. Bra perfusion kommer att hindra lem från böjning som svar. När perfusion med PFA är klar kan kanylen och BLODSTILLANDE klämmor kopplas bort och kadaver förberedd för mjukpapper dissekering. Den dissektion metod som används beror på den specifika vävnad.
  8. Förbered 4% PFA / 5% (v / v) pikrinsyra (PA, för insamling och efter fixering av plantar punch endast) genom att lägga mättad pikrinsyra lösning på 4% PFA. Införande av PA förbättrar avsevärt antigen spåras i perifera neuronala vävnader 1
  9. Förbered ben / broskvävnad AVKALKAR / frysskyddsmedel lösning - 10% EDTA i 0,1 M PB med 0,07% glycerol och 15% sackaros. EDTA-baserade lösningar kalka av vävnad och samtidigt bevara epitoper 2.
  10. Förbered frysskyddsmedel lösningen - 30% sackaros i 0,1 M PB.

2. Tissue Dissection / borttagning, Post-fixering och Sektionering

  1. Plantar Punch
    Placera perfused djur ventrala sidan nedåt på en skärmatta eller annat stadigt underlag. Håll foten plantar ytan upp, tryck mot huden med punch biopsi verktyg (3 mm diameter, Harris mikro-punsch, Ted Pella Inc.) i mitten av foten. Vrid biopsi verktyget fram och tillbaka i 180 grader för att bekräfta biopsi verktyget har skurit igenom hela den bakre tass. Ta försiktigt bort biopsi verktyget från foten och mata ut vävnaden i sterila 2 ml tub med lock, innehållande 1 ml 4% PFA / 5% PA-lösning.
  2. Limb Bone (ex. lårben)
    Gör en lateral snitt längs baksidan av djuret i nivå med bäckenet, fortsätter ner längs båda bakbenen. Skär i bäckenet och omgivande muskler att skilja lårbenet från bäckenet samtidigt som den proximala huvudet av lårbenet intakt. Skär i tibia / fibula att lämna distala huvudet intakt, ta bort den omgivande muskler / periostet från benet axeln. Placera lårbenet i en 2 ml rör som innehåller 1 ml 4% PFA /5% PA-lösning.
  3. Post-fix vävnadsproverna i 4% PFA / 5% PA-lösning, med varsam blandning på en rocker för 16-18 timmar vid 4 ° C
  4. Avkalka vävnaden enligt följande: För plantar Punch (för att kalka av den lilla ben i foten) plats vävnaden punch i ett sterilt 2 ml rör med lock, innehållande 1,5 ml 10% EDTA lösning i 0,1 M PB med 0,07% glycerol och 15 % sackaros. Placera röret på en rocker med mild blandning för 16-18 h vid 4 ° C. För lem ben plats vävnaden i ett sterilt 2 ml rör med lock, innehållande 1,5 ml 10% EDTA lösning i 0,1 M PB med 0,07% glycerol och 15% sackaros. Placera röret på en rocker med mild blandning under 6-7 dagar vid 4 ° C. Den avkalkning lösningen ska bytas var 24 timmar och vävnad övervakas för förlust av styvhet med en pincett.
  5. Överför vävnaden i en steril 2 ml rör med lock med 1,5 ml frysskyddsmedel lösning (30% sackaros i 0,1 M PB) och placera röret på en rocker wed mild blandning för 16-18 timmar vid 4 ° C.
  6. Förbered vävnad för sektionering: placera en säng volym optimal kapning temperatur (oktober) förening (Sakura Finetek USA Inc.) på en kryostat vävnad Monteringskloss och låt frysa i kryostat kammare (vanligtvis hålls vid -20 ° C). En kryogen aerosol (Cyto-frys, Control Co USA) kan även sprayas på oktober för att påskynda frysa processen. Placera vävnadsprov på denna bädd av oktober och täck med ett extra tunt lager av oktober Försiktigt spraya detta oktober med kryogen aerosoler tills det har härdat och vävnaden i har frusit. Placera provet på skärhuvudet i kryostat kammaren och låt vävnadsprov blocket att balansera på styckning temperatur - minst 1 timme. Att försöka avsnittet när inbäddning föreningen är fortfarande för kallt ger spröda sektioner och vävnadsskada.
  7. När vävnaden har nått optimal kapning temperatur, börjar såga provet och skapa 40 ìm sektioner.
  8. För plantar punsch samla kryosnitt till 12-brunnars plattor vävnadsodling innehållande 0,1 M PB med 10 mM natriumazid. Se till att delarna förblir nedsänkt i denna lösning vid 4 ° C. Avsnitten kan lagras på detta sätt i upp till 4-6 månader för immunfärgning ändamål. Alternativt kan fritt flytande sektioner lagras på obestämd tid i frysskyddsmedel lösning vid -20 ° C (500 ml 0,1 M PBS, pH 7,2, 30 g sackaros, 10 g PVP40, 300 ml etylenglykol). Anpassa den slutliga volymen till 1L destillerat vatten) 3. För lem ben samla kryosnitt direkt på gelatin pre-belagd diabilder (eller SuperFrost Plus diabilder, Fisher Scientific) och låt lufttorka under 1 timme, innan den förvaras vid -20 ° C. Bone avsnitt om bilder som lagras på detta sätt kan användas för immunfärgning ändamål inom 2-3 månader.

3. Immunfärgning av vävnadssnitt för känselnervtrådar

3,1. Plantar punchsektioner - flytande avsnitt färgning

  1. Använda ett rakblad, skär 6-7 mm från slutet av en 1 ml mikropipett spets. Förutsättning insidan av spetsen med aspirera 1% fetalt bovint serum (FBS) i 0,1 M PB flera gånger (detta hämmar stickningen av vävnadssnitten till väggarna i spetsen). Överför plantar punch avsnitt som färgas med ett 24-väl vävnadskultur plattan. Normalt 8-10 sektioner bör färgas per brunn för att se flera högkvalitativa delar genereras per immunfärgning.
  2. Tvätta plantar punsch sektioner med 500 l 0,1 M PB per brunn i 5 min med kraftfull blandning på en rocker vid RT. Upprepa två gånger till.
  3. Kasta tvättlösning och inkubera plantar punch avsnitten i blockerande lösningen, som består av 10% get serum och 0,3% Triton X-100 i 0,1 M PB (500 ìl av blockerande lösningen per brunn), med varsam blandning på en vippa för 1 h vid 4 ° C.
  4. Kasta den blockerande lösningen och inkubera vävnaden avsnitt i primära antibody / antikroppar utspätt i 250 l blockerande lösningen för 18-24 h med varsam blandning på en rocker vid 4 ° C. Baserat på utredarens experimentella krav, enda immunolabeling (med en primär antikropp mot ett specifikt protein eller nervtråd markör) eller dubbelklicka immunolabeling (med två primära antikroppar mot två proteiner eller nerv markörer fiber) kan utföras på samma avsnitt. Vid utförandet av dubbla immunolabeling är det viktigt att kontrollera att de två primära används antikroppar tas upp i olika värdarter (t ex en uppvuxen i mus och en uppvuxen i kanin), alternativt renade monoklonala antikroppar av olika immunglobulin G (IgG) isotyper (t.ex. en IgG1 och en IgG2a) kan användas. Det är lämpligt att försegla plattan med Parafilm för övernattning inkubationer att undvika överdriven avdunstning. För att färga det perifera sensoriska nervtrådar kan flera specifika antikroppar användas. Antikroppar mot proteinet neurofilament 200 (NF200, Sigma) etikett LARGE-diameter fibrer, medan calcitonin gene-related peptide (CGRP, Sigma) och Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1, Neuromics) etikett peptidergic, med liten diameter perifera sensoriska fibrer. Alla perifera nervtrådar kan också färgas med antikroppar mot β3-tubulin. I huden, är collagen IV (Abcam) används för att avgränsa de basalmembranet som skiljer överhuden från läderhuden. Som en allmän regel, antikroppar måste vara 5-10 gånger mer koncentrerad än för odlade cellbaserade immunofluorescens analyser, vanligtvis på en fungerande koncentration av 50-10 mikrogram / ml.
  5. Tvätta vävnadssnitt med 500 ìl blockerande lösningen (med Triton X-100) per brunn i 5 min med kraftfull blandning på en rocker vid RT. Upprepa 3 gånger till.
  6. Kasta tvättlösning och inkubera sektioner vävnad i lämpliga fluoroforen-konjugerade sekundära antikroppar (vanligen utspädd 1:1000 i blockerande lösningen, 500 l) med varsam blandning på en rocker vid 4 ° C. Plattan must vara insvept i aluminiumfolie för att undvika fotoblekning av fluoroforer.
  7. Tvätta vävnadssnitt med 500 ìl av blockerande lösningen per brunn i 10 min med kraftfull blandning på en rocker vid RT. Tvätta sedan med 500 l 0,1 M PB med kraftfull blandning i 10 min vid RT. Slutligen, tvätta med 500 l av 0,05 M PB med kraftfull blandning i 10 min vid RT.
  8. Använda en 1 ml mikropipett med en FBS-behandlade spetsen (klipp 6-7 mm från änden), aspirera avsnitten från vävnadsodling plattan och överförs till ett SuperFrost Plus objektglas. Ordna avsnitten och absorbera överskottet tvättbuffert med en fin pensel. Undvik långvarig exponering för ljus. Inkubera objektglasen på RT, så att avsnitten torka avsnitten om bilden (5-30 min).
  9. Applicera några droppar monteringsmedium (ProLongGold, Vectashield eller liknande), långsamt placera ett glas täckglas på sektioner. Låt bilderna att sitta i mörker i 5 minuter och sedan försegla täckglas kanterna med transparent spikpolska. Låt lufttorkning i 15-20 min. Bilderna kan nu visualiseras eller lagras vid -20 ° C under flera år utan större förlust av fluorescens.

3,2. Limb ben sektioner - på bild färgning

  1. Låt bilderna för att återgå till RT från -20 ° C förvaring. Med hjälp av en hydrofob barriär penna (Super Pap Liquid Blockering Pen, Ted Pella Inc.) avgränsar området i bilden som innehåller ben avsnitt som färgas med ett generöst lager av lösning. Låt lufttorka i 10-15 min.
  2. Tvätta benet sektioner med 250 l 0,1 M PB per bild i 5 min och upprepa för mer än 2 gånger.
  3. Kasta tvättlösning och inkubera benet avsnitten i blockerande lösningen, som består av 10% get serum och 0,3% Triton X-100 i 0,1 M PB (250 ìl av blockerande lösningen per bild) för 1 h vid 4 ° C.
  4. Kasta den blockerande lösningen och inkubera benet avsnitten i primär antikropp (eller kombination av primära antikroppar, i fallav dubbla immunolabeling som nämns i 3.1.4) utspätt i 250 l blockerande lösningen för 18-24 timmar vid 4 ° C. Det är mycket viktigt att notera att bilderna måste placeras i en fuktig kammare med en förseglad lock, för att undvika uttorkning av primär antikropp lösning. För att färga det perifera sensoriska nervtrådar, de ovan nämnda uppsättning av antikroppar (se avsnitt 3.1.4) kan användas med samma brukslösningar.
  5. Tvätta vävnadssnitt med 250 ìl blockerande lösningen (med Triton X-100) per bild i 15 minuter vid RT och upprepa för 3 gånger.
  6. Kasta tvättlösning och inkubera ben avsnitt i lämpliga fluoroforen-konjugerade sekundära antikroppar (vanligen utspädd 1:1000 i blockerande lösningen, 250 l) vid 4 ° C. Den färgning Kammaren skall vara insvept i aluminiumfolie för att undvika fotoblekning av fluoroforer. För enkelhetens skull är det lämpligt att använda mörka fläckar kammare (t.ex. Skjut inkubation fack / låda, FPI Corp).
  7. Waska benet sektioner med 250 ìl av blockerande lösningen per bild i 15 min vid RT. Tvätta sedan med 500 l 0,1 M PB i 15 min vid RT. Slutligen, tvätta med 500 l på 0,05 M PB i 15 min vid RT. Doppa en kort stund i DDH 2 O att skölja diabilder och inkubera vid RT så att benet delar lufttorka (5-30 min). Undvik långvarig exponering för ljus.
  8. Applicera några droppar monteringsmedium (ProLongGold eller liknande) och långsamt placera ett glas täckglas på sektioner. Låt glasen stå i mörker i 5 minuter och sedan försegla täckglas kanterna med genomskinlig nagellack. Låt torka i 15-20 min. Objektglas kan förvaras vid -20 ° C under flera år utan förlust av fluorescens.

4. Representativa resultat

4,1. Plantar punch sektioner

Plantar punch vävnadssnitt kan visualiseras i epifluorescensmikroskop, eller under en konfokalmikroskop med en 10X, 40X och 63x objektiv.

Figur 1
Figur 1. Annons visas färgning med Kollagen IV antikropp (grön) i källaren membran, vid epidermal-dermal korsningen och i brosk och muskler. Många CGRP-(AB, röd) och NF200-positiva fibrer (CD, röd) är fördelade över hela musen huden i plantar regionen (pilar). β3-tubulin är en pan-neuronal markör (E, röd), medan TRPV1 fläckar (F, röd) är i huvudsak begränsad till liten diameter fibrer som också är CGRP-positiva (grön, pilspetsar). A och C är epifluorescence bilder som tagits med en 10X mål (Skalningsfält -500 mikrometer), B, D, E och F är konfokala bild kompositmaterial som genereras från en 11-image z-stack fattas vid 2 ìm steg under en 60X mål (skala Bar - 50 mikrometer).

4,2. Limb ben sektioner

Limb benvävnad sektioner kan också visualiseras i epifluorescensmikroskop, eller under en konfokala microscope med ett 10X, 40X och 63x objektiv.

Figur 2
. Figur 2 visar immunfärgning med anti-CGRP (AB, röd, pilar), anti-NF200 (CD, röd, pilar), anti-β3-tubulin (E, röd) och anti-TRPV1 (F, röd) co-färgade med anti-CGRP antikropp (grön, pilar). Dessa bilder visar subtyper av sensoriska nervtrådar distribueras i hela benmatrix i svampiga huvudet regionen mus lårbenet. A och C är epifluorescence bilder som tagits med en 10X mål (Skalningsfält -500 mikrometer), B, D, E och F är konfokala bild kompositmaterial som genereras från en 11-image z-stack fattas vid 2 ìm steg under en 60X mål (skala Bar - 50 mikrometer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här har vi detaljerade metoder för beredning av mus skinn och ben sektioner vävnad för immunfärgning och detektion av perifer sensorisk nervtrådar. Avsnitten produceras från plantar punsch biopsier innehåller både glabrous och håriga huden, vilket innebär att protokollet kan användas på alla hudtyper. Dessa tekniker kan även användas för att färga andra celltyper i dessa vävnader (t.ex. leukocyter, vaskulära endothelia, glatt muskulatur bland andra). Dessa metoder ger en utmärkt kompromiss mellan optimal ultrastrukturella bevarande (vilket uppnås genom glutaraldehyd fixering, men ofta leder till avbrott i epitoper och minskad immunfärgning färgning kvalitet) och immuncytokemiska upptäcktsrisken, om de förfaranden som följs steg för steg på ett rigoröst sätt.

Upptäckt av sensoriska nervfibrer i dessa vävnader kan vara till hjälp i vår förståelse av regleringen av perifera neurite utväxt och spirande 4, enar samt anatomiska förändringar i perifera sensoriska afferenta nerver under olika sjukdomstillstånd. Vidare kan förändringar i uttryck av neurotransmittorer, receptorer, jonkanaler eller andra fenotypiska markörer i normal utveckling eller sjukdomstillstånd också studeras 3,5-10. Tillsammans med lämpliga elektrofysiologiska, biokemiska och beteende tester, kan sådana förändringar i perifera sensoriska mönster neuron färgning användas för att testa hypoteser i samband med olika smärta stater 6,9, inflammation 11 och neuropatier 5,12. Sammanfattningsvis dessa tekniker ger en ovärderlig källa för in vivo-data som kompletterar och förstärker andra anatomiska, strukturella och funktionella data som förvärvats genom ytterligare metoder, främja vår förståelse av regleringen och förvärv av plasticitet i perifera sensoriska nervtrådar i hälsa och sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi tackar Dr Yuriy M. Usachev för hans hjälp under den första standardiseringen av konfokalmikroskopi / avbildning av mus plantar stansbiopsi immunfärgning, och doktor Donna L. Hammond för hennes fortsatta hjälp och konstruktiv kritik i detta arbete. Detta arbete har finansierats av bidrag från NINDS / NIH (NS069898), och en idéutveckling Grant Award från försvarsdepartementet Prostate Cancer Research Program (DoD-PCRP-101.096) till DPM

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella, Inc. 15094
Perfusion pump Material VWR international 23609-170
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material Research Products International Corp. 248270 (tray) 248270-A (lid)
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella, Inc. 11859
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
  2. Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
  3. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
  4. Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
  5. Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
  6. Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
  7. Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
  8. Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
  9. Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
  10. Persson, A. -K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
  11. Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
  12. Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics