Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Immunzytochemische Identifizierung der peripheren sensorischen Nervenfasern Subtypen (und Detektion von Protein-Expression darin) sind der Schlüssel zum Verständnis der molekularen Mechanismen, die periphere Empfindung. Hier beschreiben wir Methoden für die Herstellung von peripheren / viszeralen Gewebeproben, wie Haut-und Gliederschmerzen Knochen, für spezifische Immunfärbung der peripheren sensorischen Nervenfasern.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Erkennung und primäre Verarbeitung von physikalischen, chemischen und thermischen Sinnesreize von peripheren sensorischen Nervenfasern ist der Schlüssel zur sinnlichen Wahrnehmung bei Tieren und Menschen. Diese peripheren sensorischen Nervenfasern ausdrücklichen eine Vielzahl von Rezeptoren und Ionenkanälen Proteine, die erkennen und initiieren spezifische Sinnesreize. Es gibt Methoden, um die elektrischen Eigenschaften der peripheren sensorischen Nervenfasern innervieren die Haut, die auch genutzt werden, um die funktionelle Expression von spezifischen Ionenkanal-Proteinen in diesen Fasern zu identifizieren können charakterisieren. Allerdings sind ähnliche elektrophysiologische Methoden nicht zur Verfügung (und sind auch schwierig zu entwickeln) für den Nachweis der funktionalen Expression von Rezeptoren und Ionenkanälen Proteine ​​in peripheren sensorischen Nervenfasern innervieren anderen inneren Organen, einschließlich der anspruchsvollsten Geweben wie Knochen. Darüber hinaus können solche elektrophysiologischen Methoden nicht genutzt werden, um die Expression von nicht-erregbaren Protein bestimmens in peripheren sensorischen Nervenfasern. Daher bietet Immunfärbung der peripheren / viszeralen Gewebeproben für die sensorische Nerven Fivers den bestmöglichen Weg, um die Expression bestimmter Proteine ​​von Interesse in dieser Nervenfasern ermitteln. Bisher haben die meisten der Proteinexpression Studien in sensorischen Neuronen genutzt Immunfärbung Verfahren in sensorischen Ganglien, wo die Informationen, um die Expression bestimmter Proteine ​​in der Zelle Körper bestimmter Arten oder Untergruppen von sensorischen Neuronen begrenzt ist. Hier berichten wir über detaillierte Methoden / Protokolle für die Herstellung von peripheren / viszeralen Gewebeproben für Immunfärbung der peripheren sensorischen Nervenfasern. Wir haben uns speziell Detail Methoden zur Herstellung von Haut-oder plantar Stanzbiopsie und Knochen (Femur) Abschnitte von Mäusen für Immunfärbung der peripheren sensorischen Nervenfasern. Diese Methoden sind nicht nur ausschlaggebend für die qualitative Bestimmung von Protein-Expression in peripheren sensorischen Neuronen, sondern auch eine quantitative Nachweisverfahren fürBestimmung von Veränderungen in der Proteinexpression Ebenen in bestimmten Arten oder Untergruppen von sensorischen Fasern, sowie für die Bestimmung der morphologischen und / oder anatomische Veränderungen in der Anzahl und Dichte der sensorischen Fasern bei verschiedenen pathologischen Zuständen. Darüber hinaus sind diese Methoden nicht auf die Färbung von nur sensorischen Nervenfasern beschränkt, sondern kann auch zur Färbung alle Arten von Nervenfasern in der Haut, Knochen und anderen viszeralen Gewebe verwendet werden.

Protocol

1. Tierische Perfusion

Alle tierischen Verfahren in dieser Studie durchgeführt werden, durch die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of Iowa zugelassen, und folgen NIH-Richtlinien für die Verwendung von Tieren in der Forschung.

  1. Am Tag vor der Perfusion, bereiten 1 L Phosphat-Puffer (0,2 M PB in doppelt destilliertem H 2 O, pH 7,4) und bei 4 ° C. Dies wird für die Perfusion und Postfixierung Prozesse verwendet werden.
  2. Am Tag der Perfusion, bereiten 500 ml von 4,0% Paraformaldehyd in 0,1 M PB (PFA, pH 7,4) Fixierlösung, ein ausreichendes Volumen für die Perfusion von 2 Mäusen: Mikrowelle 200 ml ddH 2 O in ein Becherglas für 30 sec oder bis sie Ansätze zu kochen. 20 g körniger Paraformaldehyd (PFA) in das Becherglas unter ständigem Rühren unter einer Abzugshaube. 5 ml 5 N NaOH tropfenweise und unter Rühren, bis die Lösung klärt. Wenn der PFA vollständig gelöst ist, kühlen die Lösung auf Raumtemperatur (RT). Slowly add 250 ml von 0,2 M PB unter ständigem Rühren. Mit zunehmend schwächere HCl-Lösungen (6 N bis 1 N bis 0,1 N), den pH-Wert auf 7,4. Passen Sie das endgültige Volumen auf 500 ml und Chill auf Eis. Auch die Zubereitung von 400 ml 0,1 M PB von 0,2 M Lager durch Verdünnung 1:1 in ddH 2 O und Chill auf Eis.
  3. Anesthetize der Maus durch intraperitonial Injektion einer Überdosis Betäubungsmittel (Natrium-Pentobarbital, 80 mg / kg, mit einer 27G Nadel verabreicht).
  4. Während Perfusion, werden mit 50 ml 0,1 M PB (verdünnte 0,2 M PB Lager 1:1 mit ddH 2 O) und 150 ml PFA nacheinander in der Maus Kreislauf geführt werden. Richten Sie die Schlauchpumpe, indem Sie den Schlauch mit PB und Fixierung eines 23 2.1 G Butterfly-Nadel an einem Ende. Tauchen Sie das andere Ende des Schlauches in das Becherglas mit 0,1 M PB. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Schlauchpumpe bis 10 ml / min, und die Pumpe durch eine ausreichende Menge der Lösung, um sicherzustellen, dass es keine Luftblasen in den Schlauch.
  5. Warten Sie, bis die anesthetized Maus nicht mehr zeigt keine Reflexe Aktivität, wie toe / Schwanz kneifen und Blinkreflex. Legen Sie das Tier auf einer Dissektion Tablett Bauchseite im Inneren einer Abzugshaube und sichern Sie die Pfoten mit Klebeband. Sprühen Sie das Fell mit 70% Ethanol. Machen Sie einen Schnitt durch die Haut entlang der Mittellinie des Brustkorbs und der obersten Viertel der Bauchdecke entlarven. Dann durch die Bauchdecke schneiden an der Basis des Brustkorbs. Nach dieser Einschnitt, sollte das Zwerchfell und unteren Ende des Brustbeins sichtbar sein. Sorgfältig von links nach rechts durch den Rand der Membran, und über die gesamte Länge des Brustbeins schneiden, dabei nicht in die Lunge Schaden. Einige kleinere Blutungen aus dem Brustbein in dieser Phase ist normal und gefährden nicht Perfusion. Sobald der Schnitt entlang des Brustbeins vorgenommen worden ist und die Membran geschnitten, es sollte möglich sein, jeweils die Hälfte der Brustkorb nach oben und nach außen, so dass das Herz ausgesetzt ist aufzuheben. Bewegen zur Seite der Lunge, wenn nötig. Beide Hälften des Brustkorbs kannin dieser Position mit dem Einsatz von hämostatischen Klammern gehalten werden. Legen Sie die Butterfly-Nadel (23 1 / 2 G) an der Schlauchpumpe 3-4 mm in den linken Ventrikel, parallel zur Längsachse des Tieres. Diese Platzierung minimiert das Risiko der Nadel immer verdrängt. Machen Sie einen kleinen Schnitt in den rechten Vorhof, damit die Rückkehr Kreislauf fließen aus dem Herzen.
  6. Begin Perfusion mit 0,1 M PB bei 10 ml / min für 4-5 min. Wenn es immer noch eine erhebliche Menge an Blut, die aus der rechten Vorhof an dieser Stelle fortgesetzt, bis der Fluss ist klar.
  7. Stoppen Sie den Fluss von PB und schalten Sie den Eingang auf der Schlauchpumpe auf die 4% PFA-Lösung. Reduzieren Sie die Durchflussmenge zu 5 ml / min und wieder pumpen PFA-Lösung für 20-25 min. Da die PFA in den Kreislauf, die Muskeln in Krampf gehen, und nach ein paar Minuten, sollte das Tier buchstäblich "repariert" werden in Position. Diese Steifigkeit kann durch leichtes Drücken gegen die Hinterpfoten getestet werden, dabei nicht zu bewegen das Tier einnd verdrängen die Kanüle. Gute Durchblutung wird das Bein von Biegen in Reaktion zu verhindern. Nach Perfusion mit PFA abgeschlossen ist, kann die Kanüle und blutstillende Klemmen getrennt, und die kadaver für Gewebedissektion vorbereitet. Die Dissektion Ansatz verwendet wird, hängt von der spezifischen Gewebe.
  8. Bereiten Sie 4% PFA / 5% (v / v) Pikrinsäure (PA; für die Sammlung und post-Fixierung von plantar punch nur) durch Zugabe von gesättigter Pikrinsäure-Lösung auf 4% PFA. Aufnahme von PA deutlich verbessert Antigen Nachweisbarkeit in peripheren neuronalen Geweben 1
  9. Bereiten Knochen / Knorpel Entkalkung / Frostschutzmittel-Lösung - 10% EDTA in 0,1 M PB mit 0,07% Glycerin und 15% Saccharose. EDTA-basierte Lösungen entkalken Gewebe bei gleichzeitiger Wahrung Epitope 2.
  10. Bereiten Sie das Frostschutzmittel Lösung - 30% Saccharose in 0,1 M PB.

2. Gewebedissektion / Entfernen, Post-Fixierung und Schnitte

  1. Plantar Punsch
    Legen Sie die Perfusionsed Tier Bauchseite nach unten auf eine Schneidematte oder andere feste Oberfläche. Halten Sie den Fuß Fußsohle-up, drücken Sie fest mit der Stanzbiopsie Werkzeug (3 mm Durchmesser; Harris Micro-Punsch, Ted Pella Inc.) in die Mitte des Fußes. Schalten Sie die Biopsie-Tool hin und her um 180 Grad um zu bestätigen, die Biopsie-Tool hat durch die Gesamtheit der Hinterpfote geschnitten. Entfernen Sie vorsichtig die Biopsie-Tool aus dem Fuß und Auswerfen der Gewebe in sterile 2 ml Röhrchen mit Deckel, mit 1 ml 4% PFA / 5% PA-Lösung.
  2. Limb Bone (ex. Femur)
    Machen Sie einen seitlichen Einschnitt entlang des Rückens des Tieres auf der Ebene des Beckens, weiterhin entlang beider Hintergliedmaßen. Cut in das Becken und die umliegenden Muskeln zu den Oberschenkelknochen aus dem Becken getrennt und gleichzeitig den proximalen Kopf des Oberschenkelknochens intakt. Cut in die Tibia / Fibula zum Verlassen des distalen Kopf intakt, das Entfernen der umgebenden Muskulatur / Periost vom Knochen Welle. Legen Sie die Oberschenkel in ein 2 ml Röhrchen mit 1 ml 4% PFA /5% PA-Lösung.
  3. Post-fix die Gewebeproben in 4% PFA / 5% PA-Lösung, mit sanftem Mischen auf einer Wippe für 16-18 h bei 4 ° C
  4. Entkalken des Gewebes wie folgt: Für plantar Stempel (die kleinen Knochen des Fußes entkalken) Ort der Gewebestanze in ein steriles 2 ml Röhrchen mit Deckel, mit 1,5 ml 10% EDTA-Lösung in 0,1 M PB mit 0,07% Glycerin und 15 % Saccharose. Das Rohr auf einer Wippe mit einem milden Mischung für 16-18 h bei 4 ° C. Für Extremitätenknochen Ort des Gewebes in einer sterilen 2 ml Röhrchen mit Deckel, mit 1,5 ml 10% EDTA-Lösung in 0,1 M PB mit 0,07% Glycerin und 15% Saccharose. Das Rohr auf einer Wippe mit einem milden Mischung für 6-7 Tage bei 4 ° C. Die Entkalkung Lösung sollte alle 24 Stunden und das Gewebe für den Verlust an Steifigkeit mit einer Pinzette überwacht geändert werden.
  5. Übertragen Sie die Gewebe in ein steriles 2 ml Röhrchen mit Kappe mit 1,5 ml Gefrierschutzmittel-Lösung (30% Saccharose in 0,1 M PB), und legen Sie das Rohr auf einer Wippe wit mild Mischen für 16-18 h bei 4 ° C.
  6. Bereiten Gewebe zum Schneiden: Ort ein Bett Volumen der optimalen Schneiden Temperatur (OCT)-Verbindung (Sakura Finetek USA Inc.) auf einem Kryostat Gewebe Befestigungsblock und lassen Sie in den Kryostaten Kammer einfrieren (in der Regel bei -20 ° C gehalten). Ein Kryo-Aerosol (Cyto-freeze, Control Co. USA) können auch auf der OCT besprüht werden, um das Einfrieren zu beschleunigen. Legen Sie Gewebeprobe auf diesem Bett von OCT und decken mit einer zusätzlichen dünnen Schicht von Oktober Gently Spray diesem OCT mit kryogenen Aerosol, bis es ausgehärtet ist und das Gewebe innerhalb eingefroren. Legen Probe auf den Schneidkopf in den Kryostaten und lassen Sie die Gewebeprobe Block zum Schneiden temperieren - mindestens 1 Stunde. Der Versuch, Abschnitt, wenn die Einbettmasse noch zu kalt Ergebnisse in spröden Abschnitte und Gewebeschäden.
  7. Sobald das Gewebe hat eine optimale Schnittleistung Temperatur erreicht hat, beginnen Schneiden der Probe und erzeugen 40 um Abschnitte.
  8. Für plantar punch sammeln die Gefrierschnitte in 12-well-Zellkulturplatten mit 0,1 M PB mit 10 mM Natriumazid. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte in dieser Lösung bleiben bei 4 ° C getaucht Die Abschnitte können auf diese Weise gespeichert werden für bis zu 4-6 Monaten für Immunfärbung Zwecke. Alternativ können frei schwebende Abschnitte auf unbestimmte Zeit in Gefrierschutzmittel Lösung bei -20 ° C (500 ml 0,1 M PBS, pH 7,2, 30 g Saccharose, 10 g PVP40, 300 ml Ethylenglykol) gespeichert werden. Passen Endvolumen von 1L mit destilliertem Wasser) 3. Für Extremitätenknochen sammeln die Gefrierschnitte direkt auf Gelatine pre-beschichtete Objektträger (oder Superfrost Plus-Objektträger, Fisher Scientific) und an der Luft trocknen lassen für 1 h, vor der Lagerung bei -20 ° C. Knochen-Abschnitte auf Folien auf diese Weise gespeichert werden können für die Immunfärbung Zwecke innerhalb von 2-3 Monaten eingesetzt werden.

3. Immunfärbung von Gewebeschnitten für die sensorischen Nervenfasern

3.1. Plantar PunschAbschnitte - schwimmende Abschnitt Färbung

  1. Mit einer Rasierklinge geschnitten 6-7 mm vom Ende einer 1 ml Mikropipette Spitze. Voraussetzung der Innenseite der Spitze durch die Entnahme von 1% fötalem Rinderserum (FBS) in 0,1 M PB mehrmals (dies verhindert ein Verkleben der Gewebeschnitte an den Wänden der Spitze). Transfer-plantar punch Abschnitte zu einer 24-Well-Gewebekulturplatten gefärbt werden. Normalerweise 8-10 Abschnitte sollten je gut gefärbt werden, um sicherzustellen, mehrere hochwertige Abschnitte pro Immunfärbung generiert werden.
  2. Wash plantar punch Abschnitte mit 500 ul 0,1 M PB pro Vertiefung für 5 min unter kräftigem Mischen auf einer Wippe bei RT. Wiederholen Sie 2 weitere Male.
  3. Entsorgen Sie die Wasch-Lösung, Inkubation der plantaren punch Abschnitte in Blocking-Lösung, bestehend aus 10% Ziegenserum und 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PB (500 ul der Blocking-Lösung pro Well), mit leichtem Rühren auf einer Wippe für 1 h bei 4 ° C.
  4. Entsorgen Sie die Blocking-Lösung und Inkubation der Gewebeschnitte in Primär-Antikörperndy / Antikörper in 250 ul Blockierungslösung für 18-24 h mit leichtem Rühren auf einer Wippe verdünnt bei 4 ° C. Basierend auf Ermittlers experimentellen Anforderungen, single Immunomarkierung (mit einem primären Antikörper gegen ein bestimmtes Protein oder Nervenfaser Marker), oder doppelklicken Immunomarkierung (mit zwei primären Antikörper gegen zwei Proteine ​​oder Nervenfaser Marker) können auf dem gleichen Abschnitt durchgeführt werden. Während der Durchführung Doppel Immunomarkierung ist es wichtig zu überprüfen, ob die beiden primären Antikörper verwendet in verschiedenen Host-Arten erhoben werden (z. B. eine erhöhte in Maus und einem in Kaninchen angehoben), oder alternativ, gereinigte monoklonale Antikörper verschiedener Immunglobulin G (IgG)-Isotypen (zB ein IgG1 und ein IgG2a) verwendet werden kann. Es ist ratsam, die Platte mit Parafilm Siegel für Nacht Inkubationen eine zu starke Verdunstung zu vermeiden. Um die peripheren sensorischen Nervenfasern färben, können mehrere spezifische Antikörper eingesetzt werden. Antikörper gegen das Protein Neurofilament 200 (NF200, Sigma) Label large-Durchmesser Fasern, während Calcitonin gene-related peptide (CGRP; Sigma) und transient receptor potential Vanilloid 1 (TRPV1, Neuromics) Label peptiderge, mit kleinem Durchmesser peripheren sensorischen Fasern. Alle peripheren Nervenfasern können auch mit Antikörpern gegen β3-Tubulin gefärbt werden. In der Haut ist Kollagen IV (Abcam) verwendet werden, um die Basalmembran, dass die Epidermis trennt sich von der Dermis abzugrenzen. Als allgemeine Regel gilt, müssen Antikörper gegen 5-10 mal stärker konzentriert als bei kultivierten Zellen basierende Immunfluoreszenz-Assays, in der Regel bei einem Arbeitsessen Konzentration von 5-10 g / ml sein.
  5. Waschen Sie die Gewebeschnitte mit 500 ul Blockierungslösung (mit Triton X-100) pro Vertiefung für 5 min unter kräftigem Mischen auf einer Wippe bei RT. Wiederholen Sie 3 mal.
  6. Entsorgen Sie die Wasch-Lösung, Inkubation Gewebeschnitten in geeigneter Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (in der Regel verdünnt 1:1000 in Blocking-Lösung, 500 ul) unter leichtem Mischen auf einer Wippe bei 4 ° C. Die Platte must in Alufolie zu vermeiden Bleichen von Fluorophoren gewickelt werden.
  7. Waschen Sie die Gewebeschnitte mit 500 ul Blockierungslösung pro Vertiefung für 10 min unter kräftigem Mischen auf einer Wippe bei RT. Dann mit 500 ul 0,1 M PB abwaschen mit kräftigem Mischen für 10 min bei RT. Schließlich mit 500 ul 0,05 M PB abwaschen mit kräftigem Mischen für 10 min bei RT.
  8. Mit einer 1 ml-Mikropipette mit einem FBS-behandelten Spitze (Schnitt 6-7 mm vom Ende), absaugen Abschnitte aus dem Gewebekulturplatte und Übertragung auf SuperFrost Plus-Objektträgern. Ordnen Sie die Abschnitte und absorbieren überschüssiges Waschpuffer mit einem feinen Pinsel. Vermeiden Sie längeren Belichtung. Inkubieren Sie die Objektträger bei RT, um zu ermöglichen Abschnitte Abschnitte auf Folie (5-30 min) trocknen lassen.
  9. Einige Tropfen Eindeckmedium (ProLongGold, Vectashield oder ähnliches), langsam statt einem Deckglas auf Abschnitte. Lassen Sie die Folien in der Dunkelheit 5 min stehen lassen, und dann Deckglasränder Kanten mit transparentem Nagelpolieren. Lassen Lufttrocknung für 15-20 min. Die Folien können nun visualisiert werden oder bei -20 ° C für mehrere Jahre ohne nennenswerten Verlust der Fluoreszenz.

3.2. Limb Knochenteile - on-Anfärbung

  1. Lassen Sie die Dias auf RT von -20 ° C Lagerung zurück. Mit einem hydrophobe Barriere Stift (Super Pap Flüssiges Blocking Pen, Ted Pella Inc.) umschreiben die Region auf der Folie mit dem Knochen Abschnitte mit einer großzügigen Schicht-Lösung gefärbt werden. Lassen Sie die Luft für 10-15 Minuten trocknen lassen.
  2. Waschen Sie die Knochenteile mit 250 ul 0,1 M PB pro Objektträger für 5 min und wiederholen Sie für 2 weitere Male.
  3. Entsorgen Sie die Wasch-Lösung, Inkubation der Knochen Abschnitte in Blocking-Lösung, bestehend aus 10% Ziegenserum und 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PB (250 ul der Blockierungslösung pro Folie) für 1 h bei 4 ° C.
  4. Entsorgen Sie die Blocking-Lösung und Inkubation der Knochen Abschnitte in Primärantikörper (oder eine Kombination von Primär-Antikörper, für den Fallder doppelten Immunomarkierung wie unter 3.1.4 erwähnt) in 250 ul Blockierungslösung für 18-24 h bei 4 ° C verdünnt Es ist sehr wichtig zu beachten, dass die Folien in einer feuchten Kammer mit einem abgedichteten Deckel gestellt werden muss, um ein Austrocknen zu verhindern primärer Antikörper-Lösung. Um die peripheren sensorischen Nervenfasern Fleck, den oben genannten Satz von Antikörpern (siehe Abschnitt 3.1.4) kann mit ähnlichen Arbeiten Konzentrationen verwendet werden.
  5. Waschen Sie die Gewebeschnitte mit 250 ul Blockierungslösung (mit Triton X-100) pro Objektträger für 15 min bei RT und wiederholen Sie für 3 weitere Male.
  6. Entsorgen Sie die Wasch-Lösung, Inkubation Knochen Abschnitte in geeigneten Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (in der Regel verdünnt 1:1000 in Blocking-Lösung, 250 ul) bei 4 ° C. Die Färbung Kammer muss in Alufolie zu vermeiden Bleichen von Fluorophoren gewickelt werden. Der Einfachheit halber ist es ratsam, dunkle Färbung Kammern (z. B. Slide Inkubationswanne / box, RPI Corp) zu verwenden.
  7. WAsche der Knochen Abschnitte mit 250 ul Blockierungslösung pro Objektträger für 15 min bei RT. Dann mit 500 ul 0,1 M PB gewaschen und 15 min bei RT. Schließlich mit 500 ul 0,05 M PB gewaschen und 15 min bei RT. Dip kurz in ddH 2 O zu spülen Dias und dann bei RT inkubieren, um die Knochen Abschnitte an der Luft trocknen (5-30 min) zu ermöglichen. Vermeiden Sie längeren Belichtung.
  8. Einige Tropfen Eindeckmedium (ProLongGold oder ähnliches) und langsam statt einem Deckglas auf Abschnitte. Lassen Sie die Folien stehen in der Dunkelheit für 5 min und dann Deckglasränder Kanten mit transparentem Nagellack. Trocknen lassen für 15-20 min. Dias können bei -20 ° C für mehrere Jahre ohne Verlust der Fluoreszenz gespeichert.

4. Repräsentative Ergebnisse

4.1. Plantar punch Abschnitte

Plantar punch Gewebeschnitten unter Epifluoreszenzmikroskop visualisiert werden, oder unter einem konfokalen Mikroskop mit 10x, 40x oder 63X Ziel.

Abbildung 1
Abbildung 1. AD zeigen Färbung mit Kollagen IV Antikörper (grün) in Basalmembranen, an der epidermal-dermale Übergang und im Knorpel und Muskeln. Zahlreiche CGRP-(AB, rot) und NF200-positive Fasern (CD, rot) sind in der Haut von Mäusen in die plantare Region (Pfeile) verteilt. β3-Tubulin ist ein pan-neuronalen Marker (E, rot), während TRPV1-Färbung (F; rot) ist vor allem für kleine Durchmesser Fasern, die auch CGRP-positive (; Pfeilspitzen grün) beschränkt. A und C sind Epifluoreszenz Bilder mit einer 10X-Objektiv (Maßstab -500 um) genommen; B, D, E und F sind konfokale Abbildung Verbundwerkstoffe aus einem 11-image Z-Stapel bei 2 mm-Schritten unter einem 60X Objektiv (Maßstab genommen generiert bar - 50 um).

4.2. Limb Knochenteile

Limb Knochengewebe Abschnitte können auch unter Epifluoreszenzmikroskop, oder unter einem konfokalen Mikroskop visualisierte mit einem 10X, 40X oder 63X Ziel.

Abbildung 2
. Abbildung 2 zeigt Immunfärbung mit anti-CGRP (AB, rot, Pfeile), anti-NF200 (CD, rot, Pfeile), anti-β3-Tubulin (E, rot) und Anti-TRPV1 (F; rot) co-gefärbt mit anti-CGRP-Antikörper (grün; Pfeile). Diese Bilder zeigen Subtypen von sensorischen Nervenfasern während der Knochenmatrix in der schwammigen Kopfbereich Maus Femur verteilt. A und C sind Epifluoreszenz Bilder mit einer 10X-Objektiv (Maßstab -500 um) genommen; B, D, E und F sind konfokale Abbildung Verbundwerkstoffe aus einem 11-image Z-Stapel bei 2 mm-Schritten unter einem 60X Objektiv (Maßstab genommen generiert bar - 50 um).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier haben wir die Methoden zur Vorbereitung der Haut von Mäusen und Knochengewebe Abschnitte für Immunfärbung und Erkennung von peripheren sensorischen Nervenfasern beschrieben. Die Abschnitte von plantar Stanzbiopsien produziert enthalten sowohl kahl und behaarte Haut, was bedeutet, das Protokoll über jeden Hauttyp verwendet werden kann. Diese Techniken können auch eingesetzt werden, um andere Zelltypen in diesen Geweben Flecken (z. B. Leukozyten, vaskulären Endothelzellen, glatte Muskelzellen ua) werden. Diese Methoden stellen einen optimalen Kompromiss zwischen optimaler ultrastrukturelle Konservierung (die von Glutaraldehyd Fixierung erreicht wird, sondern führt häufig zu Störungen der Epitope und verminderte Immunfärbung Färbung Qualität) und immunzytochemische Nachweisbarkeit, wenn die Verfahren eingehalten werden Schritt-für-Schritt in eine rigorose Art und Weise.

Erkennung von sensorischen Nervenfasern in diesen Geweben finden Sie in unserem Verständnis der Regulation der peripheren Neuritenwachstum Hilfe und sprießen 4, eins sowie anatomische Veränderungen in peripheren sensorischen Afferenzen unter verschiedenen pathologischen Bedingungen. Darüber hinaus können Veränderungen in der Expression von Neurotransmittern, Rezeptoren, Ionenkanäle oder andere phänotypische Marker in der normalen Entwicklung oder pathologischen Bedingungen auch 3,5-10 untersucht werden. Zusammen mit entsprechenden elektrophysiologischen, biochemischen und Verhaltenstests, können solche Veränderungen in peripheren sensorischen Neuronen Färbungsmuster verwendet werden, um Hypothesen zu verschiedenen Schmerzzuständen 6,9, Entzündungen 11 und Neuropathien 5,12 zu testen. Zusammenfassend bieten diese Techniken eine unschätzbare Quelle der In-vivo-Daten, ergänzt und verstärkt andere anatomische, strukturelle und funktionelle Daten über weitere Ansätze erworben, die Förderung unseres Verständnisses der Verordnung und den Erwerb von Plastizität in peripheren sensorischen Nervenfasern in Gesundheit und Krankheit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Yuriy M. Usachev für seine Hilfe in der ersten Standardisierung der konfokalen Mikroskopie / Bildgebung der Maus plantar Stanzbiopsie Immunfärbung und Dr. Donna L. Hammond für ihre weitere Unterstützung und konstruktive Kritik an dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NINDS / NIH (NS069898), und eine Idee Development Grant Award von dem Department of Defense Prostate Cancer Research Program (DoD-PCRP-101096) zur DPM finanziert

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella, Inc. 15094
Perfusion pump Material VWR international 23609-170
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material Research Products International Corp. 248270 (tray) 248270-A (lid)
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella, Inc. 11859
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
  2. Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
  3. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
  4. Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
  5. Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
  6. Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
  7. Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
  8. Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
  9. Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
  10. Persson, A. -K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
  11. Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
  12. Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics