يعاير النشاط كيناز من LRRK2 في المختبر

Published 1/18/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

يسين كيناز كرر ريتش 2 هو كيناز متعددة المجالات الكبيرة ، والطفرات التي هي السبب الأكثر شيوعا الجينية لمرض الشلل الرعاش. وقد أثبت تحليل للنشاط هذا البروتين كيناز ليكون أداة حاسمة في فهم البيولوجيا واختلال وظيفي في هذا البروتين. في هذه الورقة ،

Cite this Article

Copy Citation

Lewis, P. A. Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro. J. Vis. Exp. (59), e3495, doi:10.3791/3495 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يسين كيناز كرر ريتش 2 (LRRK2) هو 2527 عضو من الأحماض الأمينية للأسرة روكو من البروتينات ، والتي تمتلك بنية معقدة متعددة المجالات ، بما في ذلك المجال GTPase (وهو ما يسمى ROC ، على رأس مجمع للبروتينات) والمجال كيناز 1. أدى هذا الاكتشاف في عام 2004 طفرات في LRRK2 التي تسبب مرض باركنسون (PD) في LRRK2 يجري التركيز على الكم الهائل من البحوث في وظيفتها الطبيعية ، وكيف ينتقل هذا البروتين منحرف في حالة المرض 2،3 وركزت التحقيقات الأولية في وظيفة LRRK2 عن أنشطته الأنزيمية 4-6. على الرغم من أن صورة واضحة لم يخرج من التغيير المستمر في هذه بسبب الطفرات ، وقد أبرزت البيانات من عدد من المجموعات على أهمية النشاط كيناز من LRRK2 في موت الخلية مرتبطة 7،8 الطفرات. وذكرت المنشورات الحديثة مثبطات استهداف النشاط كيناز من LRRK2 ، وتوفير أداة رئيسية التجريبية 9-11. في ضوء هذه المعطيات ، فإنهومن المرجح أن خصائص الأنزيمية من LRRK2 تحمل لنا نافذة هامة في البيولوجيا من هذا البروتين ، على الرغم من ما إذا كانت الأهداف المحتملة للدواء باركنسون هو مفتوح للنقاش.

وقد تم استخدام عدد من الأساليب المختلفة لفحص النشاط كيناز من LRRK2. في البداية ، وأجريت فحوصات خارج باستخدام بروتين حاتمة الموسومة overexpressed في خطوط خلايا الثدييات وimmunoprecipitated ، مع المقايسات نفذت باستخدام هذا البروتين على أداء وظائفها الخرز agarose 4،5،7. لاحقا ، منقى من شظايا المؤتلف LRRK2 في حل وقد تم أيضا استخدام ، على سبيل المثال جزء من ضريبة السلع والخدمات الموسومة تنقية الخلايا التي تحتوي على مخلفات الحشرات 970-2527 من LRRK2 12. في الآونة الأخيرة ، وآخرون دانيلز وأفادت عزلة LRRK2 طول كامل في حل من خلايا الكلى البشرية الجنينية ، بيد أن هذا البروتين لا يتوفر على نطاق واسع 13. في المقابل ، فإن الانصهار اقتطاع ضريبة السلع والخدمات هو شكل من أشكال LRRK2 المتوفره تجارياه (من Invitrogen ، انظر الجدول رقم 1 للحصول على التفاصيل) ، ويوفر أداة مناسبة ليدل على مقايسة للنشاط كيناز LRRK2. تم الإبلاغ عن نواتج مختلفة للنشاط كيناز LRRK2. Autophosphorylation من LRRK2 نفسها ، الفسفرة من البروتين الأساسي المايلين (MBP) باعتبارها الركيزة كيناز العامة والفسفرة من الركيزة الاصطناعية -- LRRKtide يطلق ، على أساس من الفسفرة ثريونين 558 في Moesin -- وقد استخدمت جميع ، وكذلك سلسلة من ركائز الفسيولوجية المفترضة بما في ذلك α - synuclein ، وMoesin 4 - EBP 14-17. حالة من هذه البروتينات بمثابة ركائز لLRRK2 يزال من غير الواضح ، وعلى هذا النحو المبين أدناه البروتوكول سوف تركز على استخدام MBP باعتبارها الركيزة عامة ، مشيرا الى ان فائدة هذا النظام لفحص النشاط كيناز LRRK2 موجه ضد مجموعة من ركائز المحتملة

Protocol

سلامة

البروتوكول هو موضح أدناه يستخدم ATP المسمى مع P 32 المشعة في γ موقف الفوسفات لمتابعة النشاط كيناز من LRRK2. لأنه يقوم على البروتوكولات القياسية المستخدمة في المختبر لدينا ، وذلك فيما يتعلق بالعديد من الخطوات في عملية تشغيل مثل المواد الهلامية ، وهلم جرا غرب النشاف ينبغي أن تؤخذ في المواد وشروط دقيقة كدليل على المعدات والبروتوكولات المستخدمة في هذه العمليات تختلف من مختبر لمختبر. المركبات التي تحتوي على النظائر المشعة التي تنبعث منها الإشعاعات المؤينة ويحتمل أن تكون ضارة على صحة الإنسان ومنح التراخيص واللوائح الصارمة في عنصر تحكم المستوى المؤسسي والوطني استخدامها. وأجريت التجارب في هذا البروتوكول في أعقاب التدريب على استخدام المصادر المفتوحة الاشعاع في جامعة لندن والمبادئ التوجيهية التالية مختبر الممارسة الجيدة التي توفرها خدمات السلامة في الكلية (المبادئ التوجيهية افاilable في http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). يجب عدم استخدام الإشعاع مفتوحة المصدر يكون حاول قبل التدريب المناسب وموافقة الجهات التنظيمية. الهيئة التنظيمية المسؤولة عن الإشعاع المصدر المفتوح في البحوث المختبرية يختلف من بلد إلى آخر. ومن أمثلة هذه هي : في المملكة المتحدة ، واللجنة التنفيذية للصحة والسلامة ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ) ، في الولايات المتحدة واللجنة التنظيمية النووية ( http:// www.nrc.gov / المواد / miau / البندان - دلائل comm.html - ) ، في كندا الكندية لجنة السلامة النووية ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ) ، وداس في ألمانيا Strahlenschutz FÜR الاتحادي لل( HTTP : / / www.bfs.de / دو / BFS ). يجب على المستخدمين في بلدان أخرى تأكيد القواعد المحلية والأنظمة والسلطات الترخيص لها مع الإشعاع ضابط السلامة. ولوحظ وجود احتياطات السلامة ذات الصلة في هذا البروتوكول في النص ، وأبرزت مع رمز البرسيم المشعة ( الرمز 1 ).

1. إعداد ردود الفعل كيناز

الرمز 1 جميع المخاليط رد فعل أعد في أنابيب العينات 1.5ml مع قبعات المسمار تحتوي على حلقة O لمنع انتشار المواد المشعة.

  1. ذوبان الجليد على البروتين -- LRRK2 نوع البرية ، D1994A ، G2019S.
  2. تشكل ردود الفعل على الجليد -- 10nM LRRK2 ، 0.5μg/μl MBP ، 5ul العازلة من كيناز 10X ، تتكون ل50μl بالماء.

2. تشغيل مقايسة

الرمز 1 وينبغي الاستفادة من جميع الخطوات 32 ف ع اتخاذ ATPالدانتيل الإشعاع في المناطق المعينة.

الرمز 1 وينبغي ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة -- تحت إجراءات التشغيل القياسية في مختبرنا وتشمل هذه معطف المختبر ، وقفازات ونظارات واقية مزدوجة.

الرمز 1 وينبغي أن العينات التي تحتوي على 32 محمية ف ATP من المستخدمين عن طريق شاشات البرسبيكس 6mm ل تقليل التعرض.

الرمز 1 حيث ينبغي أن تستخدم للتطبيق ، وأجهزة الرصد الشخصية -- ضمن دوري أبطال أوروبا ، يجب على أي شهادة الإشعاع مفتوحة المصدر مستخدم لها شارة الفيلم لرصد التعرض للإشعاع أثناء التجارب.

الرمز 1 وينبغي تقييم كل الأسطح تجريبية لتلوث إشعاعي قبل وبعد الاستخدام باستخدام GEIGER العداد.

الرمز 1 يجب التخلص من جميع المواد الاستهلاكية التي قد تكون ملوثة للفي الالتزام الصارم بالمبادئ التوجيهية المؤسسية للتخلص من النفايات المشعة.

  1. قبل البدء في الفحص ، تعيين كتل التدفئة إلى 30 درجة مئوية و 100 درجة مئوية على التوالي
  2. إزالة 32 ف -20 ATP من الفريزر (لاحظ أن ظروف التخزين جيئة وذهابا 32 ف ATP قد تختلف اعتمادا على نوع المورد أو radionucleotides المستخدمة). الرمز 1 فحص خارج الحاوية قبل استخدامها ، ذوبان الجليد وراء الشاشة البرسبيكس.
  3. مع ردود الفعل على الجليد ، إضافة للاعبي التنس المحترفين 1μl ف 32 إلى كل جانب من بطولة 10μM الباردة.
  4. مزيج جيد مع ماصة. الرمز 1 نبض الطرد المركزي لجلب السائل إلى أسفل الأنبوب ، والتقليل من خطر التلوث.
  5. إزالة قسامة 15μl لنقطة الصفر مرة anد إنهاء رد فعل من قبل في قسامة إضافة 5μl 4X العازلة من عينة SDS وتمسخ عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. الرمز 1 نبض الطرد المركزي لجلب السائل إلى أسفل الأنبوب ، والتقليل من خطر التلوث.
  6. العينة المتبقية وضعت في كتلة التدفئة والمحتضنة في 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  7. 15μl إزالتها عند 60 نقطة زمنية دقيقة ، وردود الفعل من قبل إنهاء إضافة 5μl 4X العازلة من عينة SDS وتمسخ عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. الرمز 1 نبض الطرد المركزي لجلب السائل إلى أسفل الأنبوب ، والتقليل من خطر التلوث.

3. Immunoblotting العينات وتحليل النتائج

  1. تعمل على عينات SDS - PAGE
    1. 10 ٪ هلام جيدا 12/04 polyacrilamide مكرر تريس أعدت لاجتماعات الأطراف الكهربائي باستخدام العازلة على التوالي.
    2. 20μl من كل عينة تحميلها على هلام مع 7μl من الأدوات الحادةtain سلم البروتين القياسية.
    3. هلام تشغيل في 160v لمدة 90 دقيقة ، أو حتى أمام الصبغة قد وصل إلى نهاية الجل. الرمز 1 وينبغي معاملة جميع السائل في اتصال مع النظائر المشعة والنفايات المشعة والتخلص من المبادئ التوجيهية المؤسسية في الحال. دوري أبطال أوروبا لوائح الدولة التي يجب التخلص من النفايات المشعة السائلة التي تنهمر المعينة بالوعات تصريف المياه المشعة مع غزير.
  2. نقل البروتين لطخة عبر الغشاء (PVDF) الغربية.
    1. العازلة نقل معدة ، 1X تريس جليكاين الميثانول زائد 20 ٪. قطع غشاء PVDF ورقة الترشيح لتصحيح حجم الجل وتفعيلها مع الميثانول الجليدية في حالة الغشاء أو ما قبل الرطب مع العازلة نقل في حالة ورقة الترشيح. ينبغي أن يكون الغشاء قبل المسمى مع أقلام الحبر السائل للسماح تحديد الاتجاه. الرمز 1 من هلام إزالة بلاستجيم غلاف الأكريلاميد الزائدة وإزالتها والتخلص منها كنفايات مشعة.
    2. وينبغي تشكيل الهلام في شطيرة مع الغشاء ورقة الترشيح ، وضمان عدم وجود فقاعات بين الغشاء وهلام ، ورتبت بعد ذلك في جهاز وصمة عار الغربية مع الغشاء بين جل والأنود و.
    3. قام بها في نقل 25V لمدة 16 ساعة.
  3. بعد نقل البروتين لPVDF ، ينبغي أن يجفف الغشاء في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، يجب أن تكون معزولة الغشاء يجف بين صحائف خلات السليلوز وإما يتعرضون للشاشة فوسفورية او فيلم الأشعة السينية للسماح للكشف عن البروتين إشعاعيا. ويمكن تشغيلها من وقت التعرض لأكثر من عدة ساعات في الأسبوع اعتمادا على نشاط محدد من النظائر المشعة المستخدمة وحركية إنزيم من رد الفعل.
  4. تفحص Phosphoscreen / الفيلم معالجتها. اذا كنت تستخدم شاشة الفوسفور ، ينبغي حفظ الصورة في شكل TIFF عالية الدقة أو ملف صورة نقطية ، إذا به الفيلم ثم تران الناتجةوينبغي أن تفحص sparency باستخدام ماسح سطح المكتب وحفظها كملف TIFF عالية الدقة أو ملف صورة نقطية. ويمكن بعد ذلك تكون الصورة التي تم تحليلها في ImageJ ، وهو برنامج مجاني متاح في المعاهد الوطنية للصحة موقع ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).

4. ممثل النتائج

الشكل 1 يبين نتائج ممثلة لمقايسة نفذت باستخدام نوع البرية ، وG2019S LRRK2 D1994A مع بروتين المايلين الأساسية باعتبارها الركيزة الفوسفات متقبل عام. Autophosphorylation من LRRK2 مرئيا في ≈ 200kDa ، مع فرق متعددة تمثل MBP فسفرته مرئية من 40kDa - 20. لاحظ غياب autophosphorylation في حارة (كيناز قتيلا) D1994A ، وزيادة الفسفرة بسبب الطفرة G2019S. علما الفسفرة المتبقية أيضا MBP في حارة القتلى كيناز. هذا قد يكون راجعا إلى الاجتثاث ناقصة النشاط كيناز LRRK2 من قبل طافرة D1994A أو تعكس وجود سو تلويث تتبع تحركات في رد الفعل.

الشكل 1
الشكل 1.

Discussion

توضح هذه الورقة الأساسية لبروتوكول يعاير النشاط كيناز من LRRK2 باستخدام النظام في المختبر. لمصلحة من الإيجاز ، فقد اقتصر هذا إلى قالب نقطة نهاية مدته ساعة واحدة باستخدام الركيزة عامة ، ولكن البروتوكول عامة تنطبق على مجموعة من ركائز المحتملة وقابلة للتحليلات أكثر تطورا دراسة حركية النشاط كيناز من LRRK2 . هذا يسلط الضوء على واحدة من المزايا الرئيسية لاستخدام النظام في المختبر لدراسة السلوك من بروتين كيناز مثل هذا : لأن هناك سيطرة كاملة على تركيز الانزيم والركيزة ، فمن الممكن لتوليد البيانات الحركية وحساب K م والخامس القيم القصوى للتفاعل. لتقييم حركية أكثر تفصيلا أو تقييم تأثير مثبطات المفترضين ، نظام أعلى إنتاجية (مثل تلك التي يوفرها استخدام الركيزة LRRKtide ، التي تتوفر من Invitrogen) هو alternati متفوقةلقد لنهج وصفها هنا.

ومن المهم ، مع ذلك ، أن نعترف بأن النظام النموذجي الاختزالية التي قدمها في فحوصات المختبر كيناز ما هو إلا أداة واحدة لدراسة علم الأحياء لكيناز وعلاقاتها مع ركائز المحتملة. وينبغي استخدام البيانات من مثل هذه المقايسات بالاقتران مع المناهج الأخرى للحصول على صورة شاملة عن كيفية كيناز في المختبر ، ويتصرف في سياق الخليوي. على سبيل المثال ، يمكن تحليل ركيزة المفترضة فسفرته في المختبر عن طريق قياس الطيف الكتلي لتحديد phosphosites المحتملة التي يمكن أن تكون ثم يتلاعب بها الطفرات المستهدفة (على سبيل المثال. السيرين ثريونين أو تحويل مخلفات الفوسفات متقبل مقابل لا شيء ، مثل بقايا phosphorylatable ألانين) لدراسة وظيفية عواقب فيفو السابقين الفسفرة.

وهناك اعتبار رئيسي في تفسير البيانات من نظام فحص في المختبر مثل هذا احتمال eitheص النوع الأول أو النوع الثاني (إيجابية أو سلبية كاذبة كاذبة) أخطاء. الطبيعة الاختزالية لهذا النظام يتصرف مع الأسف ، فهو على حد سواء -- لا يمكن في حالة من السابق ، بعد أن ركيزة المنقى المفترضة وتنقيته كيناز على مقربة بشكل مصطنع وعلى تركيز عال (بالمقارنة مع الوسط الخليوي) نتيجة الأحداث في الفسفرة artefactual. على العكس ، الكثير من تحركات وظيفة كجزء من مجمع في إطار الخلية ، وتتطلب التعاون من عوامل الفسفرة ركيزة تعطى للتحدث. ثم ينبغي على النحو المذكور أعلاه ، وهذه نتيجة إيجابية من الفسفرة من المفترض ركيزة باستخدام نظام مقايسة في المختبر يتم اختبارها في نظام الهاتف الخلوي للتحقق من صحة ذلك ، وينبغي أن تفسر نتيجة سلبية بحذر.

في ضوء ذلك ، فمن الأهمية بمكان حيث من الممكن أن الضوابط الإيجابية والسلبية للسماح للدراسة المقارنة للنشاط كيناز اهتمامك. الاختيار الدقيق لكنترول إيجابيةل الذي يحتوي على البروتين نحو النشاط المعروف اهتمامك ، جنبا إلى جنب مع الرقابة السلبية التي من غير المرجح أن phosphorylate الركيزة الخاص المفترضة ، هي قيمة للغاية. عنصر تحكم واحد مرشح لLRRK2 هو التفاعل مستقبلات كيناز 3 ، والذي لديه صلة وثيقة تسلسل الأولية إلى المجال كيناز من LRRK2 ولكن لديها مختلفة تماما بنية المجال العام 18. هذا هو متاح في المؤتلف من البروتين Invitrogen ويستخدم كعنصر تحكم قياسية في مختبرنا.

وينبغي أيضا أن يلاحظ أن النموذج متاح تجاريا LRRK2 يفتقر إلى N - محطة من البروتين ، والموسومة ب اكسيداز - S - ترانسفيراز وينبغي أن يؤخذ ذلك في الاعتبار كعامل الخلط المحتملة عند تنفيذ المقايسات كيناز مع هذا البروتين ، كما ليس من المعروف ما هو الدور الذي يمكن للمحطة من N - LRRK2 يلعب في وظيفة طبيعية من هذا البروتين. إذا ، على سبيل المثال ، جزء من محطة N - LRRK2 أن تغيب في البروتين المستخدم في هذا البروتوكولهو أمر حاسم لتجنيد ركيزة معينة إلى المجال كيناز من LRRK2 فهذا سيكون له تأثير كبير على الفسفرة وحظ من قال الركيزة في المختبر في النظام الموصوف أعلاه.

حتى مع هذه المحاذير ، ولكن ، على الأهمية التي توليها لبيولوجيا LRRK2 في البحوث باركنسون يسلط الضوء على فائدة هذا البروتوكول بمثابة أداة قيمة للتحقيق في سلوك هذا البروتين في الإعداد في المختبر.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

والمؤلف هو باركنسون زميل أبحاث في المملكة المتحدة (منحة F1002). وأيد هذا العمل في جزء من الدعوة ترست / MRC يلكوم المشتركة في الجائزة تنكس عصبي (WT089698) لكونسورتيوم مرض باركنسون في المملكة المتحدة (UKPDC) أعضاؤها من المعهد دوري أبطال أوروبا لعلم الأعصاب ، وجامعة شيفيلد والفسفرة البروتين MRC الوحدة في جامعة دندي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LRRK2 wild type Invitrogen PV4873
LRRK2 G2019S Invitrogen PV4881
LRRK2 D1994A Invitrogen PV6051
Kinase buffer Cell Signaling Technology 9802S
MBP Sigma-Aldrich M1891
32P g ATP PerkinElmer, Inc. BLU002X500UC 500μCi, 30Ci /mMole
4x LDS sample buffer Invitrogen NP0007
2-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich M6250
Protein standards Invitrogen LC5800
MOPS running buffer Invitrogen NP0001
Bis-tris acrylamide gel Invitrogen NP0321 4-12% 1mm 10well
PVDF membrane EMD Millipore IPVH00010
Transfer buffer Invitrogen NP0006
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
Geiger counter Mini Instruments
SDS PAGE tank Invitrogen
Transfer tank Invitrogen
Heat blocks (2) Eppendorf
Phosphor screen GE Healthcare X-ray film can be substituted
Phosphor imager GE Healthcare
Exposure cassette GE Healthcare
Centrifuge Eppendorf
Perspex shielding
1.5ml tubes VWR international Screw top with O ring
Table 2. Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).
  2. Paisan-Ruiz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44, 595-600 (2004).
  3. Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44, 601-607 (2004).
  4. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).
  5. Gloeckner, C. J. The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).
  6. Lewis, P. A. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).
  7. Greggio, E. Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).
  8. Smith, W. W. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).
  9. Deng, X. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2. Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).
  10. Lee, B. D. Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease. Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).
  11. Nichols, R. J. Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease. The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).
  12. Anand, V. S. Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays. FEBS. J. 276, 466-478 (2009).
  13. Daniels, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).
  14. Jaleel, M. LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity. Biochem. J. (2007).
  15. Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).
  16. Imai, Y. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila. Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).
  17. Greggio, E. The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation. J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).
  18. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats