Testmetoder för att kinasaktivitet av LRRK2 In vitro

Published 1/18/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Leucin Rich Repeat Kinase 2 är en stor multidomain kinas, mutationer som är den vanligaste genetiska orsaken till Parkinsons sjukdom. Analys av kinase aktiviteten hos detta protein har visat sig vara ett viktigt verktyg för att förstå biologi och dysfunktion av detta protein. I detta papper,

Cite this Article

Copy Citation

Lewis, P. A. Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro. J. Vis. Exp. (59), e3495, doi:10.3791/3495 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Leucin Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) är en 2527 aminosyra medlem av ROCO familj av proteiner, som har en komplex, multidomain strukturer, inklusive en GTPase domän (sk ROC, för Ras av komplexa proteiner) och ett kinas domän 1. Upptäckten år 2004 av mutationer i LRRK2 som orsakar Parkinsons sjukdom (PS) resulterade i LRRK2 vara i fokus för en stor mängd forskning om sin normala funktion och hur proteinet går snett i det sjukdomstillstånd 2,3. Inledande undersökningar av funktion LRRK2 fokuserade på sin enzymaktiviteten 4-6. Även om en klar bild har ännu inte dyka upp av en konsekvent förändring i dessa på grund av mutationer, har data från ett antal grupper betonade vikten av kinas aktivitet LRRK2 i celldöd kopplade till mutationer 7,8. Senaste publikationer har rapporterat hämmare med inriktning på kinase aktiviteten hos LRRK2, vilket ger en viktig experimentell verktyg 9-11. Mot bakgrund av dessa uppgifter, detär troligt att den enzymatiska egenskaper LRRK2 ger oss ett viktigt fönster mot biologi detta protein, även om de är potentiella målproteiner för Parkinsons är öppen för debatt.

Ett antal olika metoder har använts för att analysen av kinasaktivitet av LRRK2. Inledningsvis var analyser utförs med hjälp epitop taggade proteinet överuttryckt i däggdjursceller cellinjer och immunoprecipitated, med analyser utförs med hjälp av detta protein immobiliserade på agaros pärlor 4,5,7. Därefter har renat rekombinant fragment av LRRK2 i lösning också använts, till exempel en GST taggad fragment renat från insektsceller innehåller rester från 970 till 2527 av LRRK2 12. Nyligen rapporterade Daniëls et al. Isolering av full längd LRRK2 i lösning från mänskliga embryonala njur celler, men detta protein är inte allmänt tillgängliga 13. Däremot GST fusion stympad form av LRRK2 är kommersiellt tillgänglig före (från Invitrogen, se tabell 1 för detaljer), och erbjuder ett praktiskt verktyg för demonstration av en assay för LRRK2 kinasaktivitet. Flera olika utgångar för LRRK2 kinasaktivitet har rapporterats. Autophosphorylation av LRRK2 själv, fosforylering av myelin Basic Protein (MBP) som en generisk kinas substrat och fosforylering av ett artificiellt substrat - dubbad LRRKtide, baserat på fosforyleringen av treonin 558 i Moesin - alla har använts, som har en rad förmodad fysiologiska substrat bland annat α-synuklein, Moesin och 4-EBP 14-17. Statusen av dessa proteiner som substrat för LRRK2 förblir oklar, och som sådan protokollet som beskrivs nedan kommer att fokusera på att använda MBP som en allmän substrat, notera nyttan av detta system för analys LRRK2 kinasaktivitet riktad mot en rad möjliga underlag.

Protocol

Säkerhet

Protokollet beskrivs nedan utnyttjar ATP märkta med radioaktiva 32 P i γ fosfat möjlighet att följa kinase aktiviteten hos LRRK2. Den är baserad på den standard protokoll som används i vårt laboratorium, och så när det gäller många av de steg i processen, såsom att köra geler, blotting et cetera västra material och exakta villkor bör ses som en vägledning för den utrustning och protokoll används för dessa processer varierar från laboratorium till laboratorium. Föreningar med isotoper som avger joniserande strålning kan vara skadliga för människors hälsa och strikt tillståndsgivning och förordningar på en institutionell nivå och nationell nivå kontrollera deras användning. Experimenten i detta protokoll har genomförts efter avslutad utbildning i öppen källkod strålning används vid University College London och följa riktlinjer för god laboratoriesed som säkerhet tjänster på högskolan (riktlinjer available på http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). Användning av öppen källkod strålning bör inte försöka innan lämplig utbildning och godkännande. Den reglerande organ som ansvarar för öppen källkod strålning i laboratoriet forskning varierar från land till land. Exempel på dessa är: i Storbritannien, Health and Safety Executive ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ), i USA Nuclear Regulatory Commission ( http:// www.nrc.gov / material / miau / Regs-guider-comm.html ), i Kanada den kanadensiska Nuclear Safety Commission ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), och i Tyskland Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http : / / www.bfs.de / DE / BFS ). Användare i andra länder bör bekräfta lokala regler, föreskrifter och tillståndsmyndigheterna med deras strålning skyddsombud. Säkerhetsåtgärder som är relevanta för detta protokoll har noterats i texten markeras med den radioaktiva strålningssymbolen symbolen ( Symbol 1 ).

1. Förbereda kinase reaktioner

Symbol 1 Alla reaktionsblandningarna upprättats i 1,5 ml provrör med skruvlock innehåller en O-ring för att förhindra spridning av radioaktivitet.

  1. Tina protein på is - LRRK2 vild typ, D1994A, G2019S.
  2. utgör reaktion på is - 10Nm LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5ul av 10x kinas buffert, som består till 50μl med vatten.

2. Köra analysen

Symbol 1 Alla steg som använder 32 P ATP ska ta pspetsar som utsetts strålning områden.

Symbol 1 Lämplig personlig skyddsutrustning bör användas - enligt standardförfarande i vårt laboratorium dessa omfattar labbrock, dubbla handskar och skyddsglasögon.

Symbol 1 Prov som innehåller 32 P ATP bör avskärmas från användare genom 6mm Perspex skärmar för att minska exponeringen.

Symbol 1 I förekommande fall, personliga övervakningsutrustning bör användas - inom UCL måste alla certifierade öppen källkod strålning användaren ha en film badge för att övervaka strålning under experiment.

Symbol 1 Alla experimentella ytor bör bedömas för radioaktiv kontaminering före och efter användning med en GeiGer disk.

Symbol 1 Alla potentiellt förorenade förbrukningsvaror skall hanteras i strikt följsamhet till institutionella riktlinjer för radioaktivt avfall.

  1. Före start analys, som uppvärmning block till 30 ° C och 100 ° C respektive
  2. Ta bort 32 P ATP från -20 frys (observera att förvaringsförhållanden tillbaka 32 P ATP kan variera beroende på leverantör eller typ av begagnade radionucleotides). Symbol 1 skanna utanför behållaren före användning, tina bakom plexiglas skärm.
  3. Med reaktioner på is, lägga 1μl av 32 P ATP till varje tillsammans med 10μM kallt ATP.
  4. Blanda väl med pipett. Symbol 1 Pulscentrifugera att få vätska till botten av röret, vilket minimerar risken för kontaminering.
  5. Ta bort 15μl alikvot för noll tidpunkt end avsluta reaktion i delprov genom tillsats av 5μl av 4x SDS prov buffert och denaturering vid 100 ° C i 10 minuter. Symbol 1 Pulscentrifugera att få vätska till botten av röret, vilket minimerar risken för kontaminering.
  6. Resterande prov placeras i värmeblock och inkuberas vid 30 ° C i 60 minuter.
  7. 15μl bort på 60 minuter tidpunkt och reaktion avslutas med tillsats av 5μl av 4x SDS prov buffert och denaturering vid 100 ° C i 10 minuter. Symbol 1 Pulscentrifugera att få vätska till botten av röret, vilket minimerar risken för kontaminering.

3. Immunoblotting prover och analysera resultat

  1. Prover köra på SDS-PAGE
    1. 10 samt 4-12% Bis-tris polyacrilamide gel beredd på elektrofores med MOPS löpande buffert.
    2. 20μl av varje prov lastas gel tillsammans med 7μl av vassaTain protein standard stege.
    3. Gel köras på 160V i 90 minuter, eller tills färgen front har nått slutet av gelen. Symbol 1 Alla flytande i kontakt med radioisotoper ska behandlas som radioaktivt avfall och kasseras enligt institutionens riktlinjer. UCL föreskrifter anger att flytande radioaktivt avfall skall kasseras genom att hälla ner utsedda av radioaktivt förfogande sänkor med mycket vatten.
  2. Protein överföras till (PVDF) membran via Western blot.
    1. Överför buffert beredda, 1x Tris Glycine plus 20% metanol. PVDF membran och filterpapper kapas till rätt storlek för gel och aktiveras med glacial metanol i fallet av membranet eller pre-vått med transfer buffert i fallet med filtrerpapper. Membranet ska vara pre-märkta med kulspetspenna bläck för att möjliggöra identifiering av orientering. Symbol 1 Gel bort från PlastIC hölje och överskott akrylamid bort och kasseras som radioaktivt avfall.
    2. Gelen formas till en smörgås med membranet och filterpapper, vilket garanterar att inga bubblor finns mellan membranet och gel och sedan ordnas i Western Blot apparaten med membran mellan gel och anod.
    3. Överföring utförs vid 25V i 16 timmar.
  3. Efter protein överföring till PVDF bör membranet torkas vid rumstemperatur. Slutligen bör den torra membran isoleras mellan lakan cellulosaacetat och utsätts för antingen en fosfor skärm eller röntgenfilm för att möjliggöra upptäckt av radioaktivt märkta proteinet. Exponeringstid kan köra från flera timmar till över en vecka beroende på den specifika aktiviteten hos det använda radioisotoper och enzymkinetik av reaktionen.
  4. Phosphoscreen skannade / film bearbetas. Om du använder en fosfor skärm, bör bilden sparas som en högupplöst TIFF eller bitmapp-fil om du använder film sedan den resulterande TRANsparency ska skannas med en stationär scanner och sparas som en högupplöst TIFF eller bitmapp-fil. Bilden kan sedan analyseras i ImageJ, ett gratisprogram som finns på National Institutes of Health webbplats ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).

4. Representativa resultat

Figur 1 visar representativa resultat för en analys utföras med vildtyp, G2019S och D1994A LRRK2 med Myelin Basic Protein som en allmän fosfat acceptor substrat. Autophosphorylation av LRRK2 är synlig på ≈ 200kDa, med flera band som representerar fosforyleras MBP syns från 20-40kDa. Notera avsaknaden av autophosphorylation i D1994A (kinase döda) körfält, och ökad fosforylering på grund av G2019S mutation. Observera också kvarstående fosforyleringen av MBP i kinas döda körfält. Detta kan bero på ofullständig ablation av kinas aktivitet LRRK2 av D1994A muterade eller reflektera närvaro of spår förorena kinaser i reaktionen.

Figur 1
Figur 1.

Discussion

Detta dokument beskriver ett grundläggande protokoll för testmetoder för att kinase aktiviteten hos LRRK2 använda en in vitro-system. I syfte att korta, har detta varit begränsade till en timmes slutpunkt mall med hjälp av en generisk substrat, men den allmänna protokoll gäller för en rad möjliga substrat och mottaglig för mer sofistikerade analyser undersöka kinetik för kinase aktiviteten hos LRRK2 . Detta belyser en av de viktigaste fördelarna med att använda en in vitro-system för att undersöka kinas beteende av ett protein som denna: eftersom det inte finns fullständig kontroll över koncentrationerna av enzym och substrat, är det möjligt att generera kinetiska data och beräkna K m och V max värden för reaktion. För mer detaljerad kinetisk utvärderingar eller utvärdera effekten av förmodade hämmare, är en högre genomströmning system (t.ex. som den som ges med hjälp av LRRKtide substrat, tillgänglig från Invitrogen) en överlägsen alternative den strategi som beskrivs här.

Det är dock viktigt att inse att det reduktionistiska modell som levereras av in vitro-kinas-analyser är bara ett verktyg för att undersöka biologi ett kinas och dess relationer med potentiella substrat. Data från analyser som denna bör användas i kombination med andra metoder att få en övergripande bild av hur ett kinas beter sig in vitro och in en cellulär sammanhang. Till exempel kan en förmodad substrat fosforyleras in vitro analyseras med masspektrometri för att identifiera möjliga phosphosites som sedan kan manipuleras genom riktade mutagenes (t ex. Konvertera serin eller treonin fosfat rester acceptanten till ingen-phosphorylatable restprodukter som alanin) för att undersöka den funktionella Konsekvenserna av fosforylering ex vivo.

En väsentlig aspekt i tolkningen av data från ett in vitro system som detta är sannolikheten för either typ I eller typ II (falskt positiva eller falskt negativa) fel. Den reduktionistiska natur detta system tyvärr avsätter till båda - i fallet med den förra, med ett renat förmodad substrat och renas kinas i konstgjort närhet och vid hög koncentration (jämfört med den cellulära miljön) kan resultera i artefactual fosforylering händelser. Omvänt många kinaser fungera som del av ett komplext inom ramen för cellen, och kräver co-faktorer för fosforylering av ett visst substrat uppstå. Som nämnts ovan, ett positivt resultat fosforyleringen av en förmodad substrat med hjälp av ett in vitro-system ska sedan testas i ett mobilnät för att validera resultat och ett negativt resultat bör tolkas med försiktighet.

Mot denna bakgrund är det viktigt där det är möjligt att ha både positiva och negativa kontroller för att möjliggöra en jämförande studie av verksamheten i din kinas av intresse. Noggrant urval av en positiv control som har en känd aktivitet mot ditt protein av intresse, tillsammans med en negativ kontroll som är osannolikt att fosforylera din förmodade substrat, är oerhört värdefullt. En kandidat kontroll för LRRK2 är Receptor interagerar kinas 3, som har ett nära samband primär sekvensen till kinase domän LRRK2 men har en helt annan övergripande domänstruktur 18. Det finns som rekombinant protein från Invitrogen och används som en standard kontroll i vårt laboratorium.

Det bör också noteras att de kommersiellt tillgängliga formen av LRRK2 saknar N-terminalen av det protein och är märkta med glutation-S-transferas och detta bör beaktas som en möjlig påverkande faktor när de utför kinas försök med detta protein, eftersom det inte är känt vilken roll N-terminal LRRK2 får spela i den normala funktionen av detta protein. Om till exempel, N-terminalen del av LRRK2 som saknas i det protein som används i detta protokollär avgörande för rekryteringen av en viss råvara till kinase domän LRRK2 kommer detta att få stor inverkan på de noterade fosforyleringen av sade substrat i in vitro-system som beskrivs ovan.

Även med dessa förbehåll, betonar dock vikten av att biologi LRRK2 vid Parkinsons forskning nyttan av detta protokoll som ett värdefullt verktyg för att undersöka beteendet hos detta protein i en in vitro inställning.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Författaren är en Parkinsons brittiska Research Fellow (bidrag F1002). Detta arbete stöddes delvis av Wellcome Trust / MRC gemensam utlysning inom neurodegeneration Award (WT089698) till Storbritannien Parkinsons sjukdom Consortium (UKPDC) vars medlemmar är från UCL Institute of Neurology, University of Sheffield och MRC proteinfosforylering enheten vid University of Dundee.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LRRK2 wild type Invitrogen PV4873
LRRK2 G2019S Invitrogen PV4881
LRRK2 D1994A Invitrogen PV6051
Kinase buffer Cell Signaling Technology 9802S
MBP Sigma-Aldrich M1891
32P g ATP PerkinElmer, Inc. BLU002X500UC 500μCi, 30Ci /mMole
4x LDS sample buffer Invitrogen NP0007
2-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich M6250
Protein standards Invitrogen LC5800
MOPS running buffer Invitrogen NP0001
Bis-tris acrylamide gel Invitrogen NP0321 4-12% 1mm 10well
PVDF membrane EMD Millipore IPVH00010
Transfer buffer Invitrogen NP0006
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
Geiger counter Mini Instruments
SDS PAGE tank Invitrogen
Transfer tank Invitrogen
Heat blocks (2) Eppendorf
Phosphor screen GE Healthcare X-ray film can be substituted
Phosphor imager GE Healthcare
Exposure cassette GE Healthcare
Centrifuge Eppendorf
Perspex shielding
1.5ml tubes VWR international Screw top with O ring
Table 2. Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).
  2. Paisan-Ruiz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44, 595-600 (2004).
  3. Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44, 601-607 (2004).
  4. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).
  5. Gloeckner, C. J. The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).
  6. Lewis, P. A. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).
  7. Greggio, E. Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).
  8. Smith, W. W. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).
  9. Deng, X. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2. Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).
  10. Lee, B. D. Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease. Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).
  11. Nichols, R. J. Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease. The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).
  12. Anand, V. S. Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays. FEBS. J. 276, 466-478 (2009).
  13. Daniels, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).
  14. Jaleel, M. LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity. Biochem. J. (2007).
  15. Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).
  16. Imai, Y. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila. Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).
  17. Greggio, E. The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation. J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).
  18. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats