Pull-down van calmoduline-bindende eiwitten

Published 1/23/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Calmoduline (CAM) pull-down test is een effectieve manier om de interactie van CaM te onderzoeken met verschillende eiwitten. Deze methode maakt gebruik van CAM-sepharose kralen voor een efficiënte en specifieke analyse van de CAM-bindende eiwitten. Dit levert een belangrijk instrument om CaM signalering verkennen in cellulaire functie.

Cite this Article

Copy Citation

Kaleka, K. S., Petersen, A. N., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Pull-down of Calmodulin-binding Proteins. J. Vis. Exp. (59), e3502, doi:10.3791/3502 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Calcium (Ca 2 +) is een ion van vitaal belang bij het ​​reguleren van cellulaire functie door een verscheidenheid van mechanismen. Een groot deel van Ca 2 + signalering wordt gemedieerd door de calcium-bindende eiwit bekend als calmodulin (CAM) 1,2. CaM is betrokken op verschillende niveaus in bijna alle cellulaire processen, met inbegrip van apoptose, metabolisme, gladde spiercontractie, synaptische plasticiteit, zenuwgroei, ontsteking en de immuunrespons. Een aantal van de eiwitten helpen reguleren deze routes door hun interactie met Cam. Veel van deze interacties zijn afhankelijk van de conformatie van CAM, dat is duidelijk anders wanneer gebonden aan Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) in tegenstelling tot de Ca 2 +-vrije staat (ApoCaM) 3.

Terwijl de meeste doelwit eiwitten binden Ca 2 +-CAM, bepaalde eiwitten binden aan ApoCaM. Sommige binden CaM door middel van hun IQ-domein, met inbegrip neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, en bepaalde myosins 7, postsynaptische functie 8, en samentrekken van de spieren 9 te spelen, respectievelijk. Hun vermogen om te binden en laat CaM in de afwezigheid of aanwezigheid van Ca 2 + staat centraal in hun functie. In tegenstelling tot vele eiwitten binden Ca 2 +-CaM en vereisen deze binding voor hun activering. Voorbeelden hiervan zijn myosine lichte keten kinase 10, Ca 2 + / CAM-afhankelijke kinasen (CaMKs) 11 en fosfatasen (bijv. calcineurine) 12, en spectrin kinase 13, die een verscheidenheid van directe en downstream effecten 14 hebben.

De effecten van deze eiwitten op cellulaire functie zijn vaak afhankelijk van hun vermogen om te CaM te binden in een Ca 2 +-afhankelijke manier. Bijvoorbeeld, testten we de relevantie van Ng-CaM verbindend in synaptische functie en hoe de verschillende mutaties deze binding beïnvloeden. We genereerden een GFP-gelabelde Ng construct met specifieke mutaties in het IQ-domein dat het vermogen van Ng om CaM te binden in een Ca 2 +-afhankelijke manier zou veranderen. De studie van deze verschillende mutaties gaf ons veel inzicht in belangrijke processen die betrokken zijn bij synaptische functie 8,15. Echter, in deze studies, is het essentieel om aan te tonen dat de gemuteerde eiwitten de verwachte gewijzigde binding aan CaM hebben.

Hier presenteren we een methode voor het testen van het vermogen van proteïnen om naar CaM te binden in de aanwezigheid of afwezigheid van Ca 2 +, met behulp van CaMKII en Ng als voorbeelden. Deze methode is een vorm van affiniteitschromatografie aangeduid als een CAM pull-down test. Het maakt gebruik van CAM-Sepharose kralen om te testen eiwitten die zich binden aan CaM en de invloed van Ca 2 + op deze bindend. Het is aanzienlijk meer tijd efficiënter en vereist minder eiwit ten opzichte van kolomchromatografie en andere testen. Alles bij elkaar levert dit een waardevol instrument is om Ca 2 + verkennen / CAM-signalering en eiwitten die interact met CAM.

Protocol

Zie figuur 1 voor een basis-schema van de procedure te beginnen met de homogenaat. Geschatte tijd vanaf de voorbereiding van de cellulaire extracten om elutie van CAM-gebonden eiwitten is ongeveer zes tot zeven uur.

1. Tissue voorbereiding

  1. Injecteer organotypische hippocampale plakken met een virus met een plasmide dat het recombinante eiwit van belang (in dit voorbeeld, groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld Ng) en laat een nacht weefsel te drukken eiwit.
  2. Ongeveer 12 tot 18 uur na virale injectie (afhankelijk van het virale uitdrukking tijd), voor te bereiden op de weefsels te verzamelen. Voeg 1 ml dissectie buffer (10 mM glucose, 4mm KCl, 26mm NaHCO3, 233mm sucrose, 5mM MgCl2, 1 mM CaCl2, en 0,1% fenol-rood, vergast met 5% CO 2 van 95% O 2) tot een petrischaal. Transfer gekweekte weefsel / insert aan petrischaal en voeg 2 ml buffer dissectie van de voegen onder water het weefsel.
  3. Collect organotypische hippocampus weefsel (tussen 5 en 10 plakjes) door voorzichtig schrapen het weefsel vrij zijn van de insert membraan met behulp van een scalpel. In het bijzonder het verwijderen van een bepaalde regio van belang (bijvoorbeeld CA1) is ook een optie. Overdracht van het gesuspendeerde vaatweefsel op een 1,5 ml microcentrifugebuis met behulp van een omgekeerde Pasteur pipet.
  4. Centrifugeer monsters op 1500 RCF gedurende 1 minuut aan het weefsel te scheiden van de dissectie buffer. Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie. Zorg ervoor dat niet aan de pellet te verstoren.
  5. Voor elk segment gebruikt, voeg 30 tot 60 ul van homogenisering buffer (150mm NaCl, 20mm Tris pH 7,5, 1 mM DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antipain, 1μg/mL pepstatine, en 1% Triton X -100) naar het weefsel en grondig gehomogeniseerd met stamper.
  6. Met het oog op cellulair vuil te verwijderen, centrifuge de resterende homogenaat in 1100 RCF gedurende 10 minuten en voorzichtig het supernatant te verwijderen door aspiratie terwijl het vermijden van verontreiniging van de pellet.
  7. Nemen 10% van de supernatant als een voorbeeld van de input (sample 1). Bewaar de overblijvende supernatant op het ijs tijdens de bereiding van de CAM-sepharose kralen voor gebruik in stap 3.

Opmerking: Het weefsel hier gebruikt zijn organotypische hippocampus plakjes. Kan echter een gebruik losgekoppeld neuronen of een andere cel kweken systeem. In een dergelijk geval, te beginnen bij stap 1.4 na het verzamelen van uw weefsel op de juiste manier.

2. Voorbereiding van de kralen voor pull-down

Bij de afhandeling van de korrels, is het belangrijk om de kralen te redden en de efficiëntie van de reacties te maximaliseren door te voorkomen dat de kralen van het drogen aan de zijkanten van de buis. Om dit te doen, is het het beste om je tubes draaien aan hun kant, waardoor oplossing voor de kralen nat op de wanden van de buis, vlak voor centrifugeren.

  1. Voor elke pull-down, pipet 400 pi van zwevende Calmoduline-Sepharose kralen in een 2 ml microcentrifugebuis met een relatief flaT-bottom aan de oppervlakte en de interactie van uw oplossingen te maximaliseren met de kralen tijdens uw incubaties.
  2. Centrifugeer kralen aan 21.000 RCF gedurende 30 seconden en voorzichtig het supernatant te verwijderen door aspiratie. Zorg ervoor dat u de kralen te verstoren.
  3. Te wassen de kralen, voeg 100 ul van de respectievelijke homogenisering buffer bestaande uit 2 mM CaCl 2 die wordt gebruikt om pull-down Ca 2 +-CaM bindende eiwitten en 2 mM EDTA (een bekende Ca 2 + chelator) voor kralen naar beneden te trekken ApoCaM bindende eiwitten. Tik voorzichtig de buis om opnieuw te schorsen kralen en centrifugeer op 1500 RCF gedurende 1 minuut. Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie, ervoor te zorgen dat niet op de kralen te verstoren.

Opmerking: Voor alle aspiratie stappen, is het aanbevolen om een ​​pipet tip dat een fijne opening (bijv. een gel laden tips) om de verwijdering van de oplossing mogelijk te maken zonder het verwijderen van kralen moet gebruiken.

3. Cam-Sepharose binding van eiwitten

  1. Splits uw supernatant in twee condities met een gelijk volume. Afhankelijk van uw conditie, voeg de juiste hoeveelheid CaCl 2 of EDTA om uw supernatant tot 2 mM concentratie voor elk.
  2. Voeg supernatans van stap 1.7 tot kralen gewassen in de overeenkomstige homogenisering buffer. Tik voorzichtig de buis om te mengen.
  3. Incubeer monsters bij 4 ° C gedurende 3 uur op een shaker Re-schorten kralen elke 30 minuten of zo om de efficiëntie van binding te verhogen.
  4. Centrifugebuis met de monsters en kralen op 1500 RCF gedurende 3 minuten.
  5. Neem 50μL van supernatant als een steekproef van niet-gebonden eiwit (voorbeeld 2) en voorzichtig de resterende supernatant te verwijderen door aspiratie en gooi ze weg.
  6. Was kralen drie keer, zoals beschreven in stap 2.3 met behulp van 100μL van de respectieve homogenisering buffer.

4. Elutie

  1. Voeg 50μL van elutie buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, en 150 mm NaCl) met het tegenovergestelde toestand (10mm Cacl 2 of 10mm EDTA) om de kralen. Bijvoorbeeld, monsters die werden gehomogeniseerd en gebonden in een buffer met Ca 2 + worden geëlueerd in elutiebuffer met EDTA en vice-versa.

Optioneel: Warming de elutiebuffer tot 37 ° C voor het toevoegen aan korrels kunnen het rendement te verbeteren.

  1. Broed-oplossing met kralen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een shaker. Meng de kralen door zachtjes tikken op de buis ongeveer om de 5 minuten.
  2. Centrifugeer kralen bij 1.500 RCF gedurende 3 minuten en zorgvuldig de 50μL van de supernatant te verwijderen voor het gebonden eiwit (voorbeeld 3) door aspiratie. Zorg ervoor dat u de kralen te verstoren.
  3. Voeg eiwit laadbuffer om alle monsters (dwz homogenaat, ongebonden en gebonden eiwit evenals die nog steeds gebonden aan de beads).

Opmerking: Om elutie (vooral in het geval van inefficiënte elutie) te maximaliseren, voeg 50μL van de overeenkomstige elutiebuffer (bv. toevoeging van EDTA met buffer aan kralen gebonden zijn in de CaCl 2) om de kralen vóór het verwarmen monsters te helpen elueren resterende gebonden eiwit en herhaal de stappen beschreven in 4.3 van de resterende gebonden eiwitten te verwijderen.

5. SDS-PAGE en western blot

Gedrag SDS-PAGE en analyseren met behulp van western blot door te zoeken naar uw proteïne van interesse en probe voor een eiwit waarvan bekend is CaM binden in de tegenovergestelde toestand als een positieve controle.

6. Representatieve resultaten

Figuur 2B toont een voorbeeld van een CAM-pull-down test het testen van de CaM binding van GFP-gelabelde Ng ten opzichte van endogene Ng. Om dit te doen, was GFP-Ng tot overexpressie gebracht in onze organotypische hippocampale slices 's nachts en het weefsel werd gehomogeniseerd. Het homogenaat werd geïncubeerd met CaM-sepharose kralen in de aanwezigheid van een Ca 2 + of EDTA. Homogenaat ingang toont aan dat de GFP-Ng werd uitgedrukt in naast endogeen Ng en Ca 2 + / CAM-afhankelijke kinase II(CaMKII). Zoals verwacht op basis van de bekende binding van endogene Ng (geïllustreerd in Fig. 2A), GFP-gelabelde Ng werd geëlueerd in de afwezigheid van Ca 2 + (EDTA gebonden eiwit) en ongebonden in de aanwezigheid van Ca 2 + (Fig. 2B) . Daarentegen was de controle, CaMKII, geëlueerd alleen in de aanwezigheid van Ca 2 + (gebonden eiwit) en was ongebonden in zijn afwezigheid (EDTA). Hieruit blijkt dat de CAM kralen goed zijn functioneren en de eluties waren efficiënt. Het belangrijkste is, toont dit aan dat GFP-Ng bindt aan ApoCaM in een vergelijkbare wijze als de endogene vorm, wat suggereert dat het GFP-tag niet de functie van onze recombinant eiwit te veranderen.

Figuur 1
Figuur 1. Schets van de Cam pull-down test
(A) Tissue homogenaat wordt afgedraaid om cellulaire vuil te verwijderen. Ongeveer 10% van de supernatant wordt beschouwd als een monster van de input (1). De overige supernatant is gelijk verdeeld voor de verschillendevoorwaarden en de juiste reagentia (CaCl 2 of EDTA) worden toegevoegd aan bindend te testen in deze voorwaarden. Elke supernatant (met of CaCl 2 of EDTA) is geladen op de respectievelijk voorbereide CaM-sepharose kralen en (B) geïncubeerd om bindend. Niet-gebonden eiwitten worden verwijderd (2) en (C) de gebonden eiwitten (3) worden geëlueerd off van de kralen met behulp van elutiebuffer (EB) met de tegenovergestelde voorwaarde als bindend. De eiwitsamenstelling van deze drie eiwit monsters kunnen worden geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE en western blot-analyse.

Figuur 2
Figuur 2. A.) Schematische voorstelling van Ca 2 +-afhankelijke CaM binding en elutie in pull-down test worden voorbeelden gegeven van twee soorten eiwitten die zich binden CaM in een Ca 2 +-afhankelijke manier. Neurogranin (Ng) vertegenwoordigt eiwitten die zich binden apo-CAM en CaMKII eiwitten die zich binden aan Ca 2 +-rijke vertegenwoordigtCam. CaM is te zien in de gedissocieerde toestand voorafgaand aan incubatie met de homogenaat eiwitten. Zodra geïncubeerd onder omstandigheden van hoge Ca 2 +-concentraties (2 mm) of in de aanwezigheid van een Ca 2 + chelator, EDTA (2 mM), de eiwitten zal dienovereenkomstig binden aan CAM. Ng bindt CaM in de EDTA staat omdat er weinig tot geen Ca 2 + aanwezig is, en zou worden geëlueerd uit de CAM-Sepharose kralen in de aanwezigheid van Ca 2 +. CaMKII zou echter binden aan CaM in de aanwezigheid van grote hoeveelheden Ca 2 + en zou distantiëren zodra de Ca 2 + was chelaatvorm.
B.) De resultaten van bijvoorbeeld CaM pull-down test. Deze figuur toont het verwachte eindresultaat van een CAM-sepharose naar beneden trekken met de monsters gepeild Voor aardgas-en CaMKII. Zowel de endogene Ng en GFP-Ng aanwezig zijn in de lanen van eiwitten gebonden aan CaM in de aanwezigheid van EDTA. Geen Ng is gebonden wanneer monsters worden geïncubeerd met CaM in de aanwezigheid van Ca 2 +, waaruit blijkt dat Ng bindt alleen apo-Cam. Onze positieve controle, CaMKII, aan de andere kant, bindt zich aan CaM alleen in de aanwezigheid van Ca 2 +.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De verstrekte protocol maakt gebruik van CaM-sepharose kralen te onderzoeken van de Ca 2 +-afhankelijkheid van de CAM-bindende eiwitten. Veel eiwitten binden CaM in een Ca 2 +-afhankelijke manier. Deze interacties zijn van groot belang gezien het aantal van de Cam-bindende eiwitten en hun kritische rol in vele signaleringsroutes. In dit protocol zijn CaM-sepharose kralen gebruikt voor het CAM-bindende eiwitten te scheiden van weefsel homogenaat in de aanwezigheid of afwezigheid van Ca 2 +. De resultaten van deze eenvoudige aanpak zal verder het begrip van hoe eiwitten kunnen met CaM interactie in een Ca 2 +-afhankelijke manier. Deze benadering verschilt van een veel gebruikte techniek in de eiwitbinding studies, kolomchromatografie, in dat de CAM-Sepharose kralen zijn in de oplossing in plaats van gefixeerd in een matrix.

Vermijden van het gebruik van een kolom is een voordeel van deze aanpak, want zonder de kolom het protocol is minder tijdrovend, omdat er geen need op een kolom equilibreren of wacht tot de zwaartekracht flow-through. Als gevolg van de deugd van de efficiëntie, de CAM pull-down vergt aanzienlijk minder weefsel dan kolomchromatografie en vereenvoudigt de monstervoorbereiding, zoals scheiding van cellulaire puin van het eiwit monster vereist alleen een kort centrifugeren voor de CAM-sefarose pull-down beschreven. Columns vereisen eiwit monsters die vrij zijn van cellulaire puin, dat kan extra zuiveringsstappen. Deze aanpak heeft ook voordelen ten opzichte van andere pull-down methoden, zoals co-immunoprecipitatie, die een antilichaam tegen het eiwit aas te vangen en eventuele interagerende eiwitten in het monster vereist. Het gebruik van een antilichaam aan het aas eiwit vast te leggen kan een beperking worden als arm interacties tussen het antilichaam en het eiwit tijdens het experiment kan leiden naar een inefficiënt te trekken. Deze potentiële problemen worden vermeden met het gebruik van de beschreven Cam-sepharose pull-down.

Echter, zoalsde co-immunoprecipitatie en kolomchromatografie assays, de CAM-sepharose pull-down is beperkt tot de ex vivo CAM-bindend. De verkregen resultaten kunnen niet overeen met de in vivo realiteit van CaM interacties. Bijvoorbeeld, post-translationele modificaties vaak van invloed zijn eiwit interacties. Dit is het geval voor neurogranin, waarvan de wisselwerking met cam is voorkomen door PKC-gemedieerde fosforylering van de IQ-domein 5. Homogeniseren weefsel kunnen veranderen post-translationele modificaties door bijvoorbeeld enzymen zoals kinases of fosfatasen te richten op eiwitten die normaal gesproken worden geïsoleerd van de enzymen in de cel te openen. Verstoring van lokalisatie-en / of compartimentering kan ook een bindend wanneer de twee eiwitten normaal gesproken niet zou een kans om samen te werken in de cel te hebben. Te minimaliseren deze reacties, is het belangrijk om alle monsters op te slaan op het ijs tussen de voorbereiding en laden. Het is ook om deze reden dat de incubatie met de kralen is done bij 4 ° C. Fosfatase-remmers of andere enzym-remmers kunnen ook worden toegevoegd aan de homogenisering buffers om te helpen beperken de gevolgen ervan.

Een positieve controle is belangrijk voor dit experiment om ervoor te zorgen dat er geen significante fouten zijn opgetreden tijdens het experiment. Het kan er ook voor zorgen dat de verschillen in omstandigheden die voldoende waren om conformationele veranderingen in CaM veroorzaken, waardoor deze verschillende eiwitten te binden in de aanwezigheid en afwezigheid van Ca 2 +. Bijvoorbeeld, als er geen signaal voor het eiwit van belang, kan dit te wijten zijn aan het laden fout of andere mogelijke fouten. Peilen voor een ander eiwit waarvan bekend is dat te binden in de overige voorwaarden (zoals CaMKII in de daarvoor bestemde voorbeeld) kan helpen bij het oplossen mogelijke fouten. Lage Ca 2 + of Ca 2 + chelator (bijv. EDTA) concentraties kunnen ook interfereren met de verwachte resultaten. EDTA is met succes gebruikt, maar andere Ca 2 + chelatoren (bijv. EGTA) kan effectiever zijn als nog hoger CONCENTRATionen zijn niet effectief. Overmatig CaM-bindend eiwit kan ook leiden tot onverwachte resultaten als het kan verzadigen van de beschikbare CAM-sepharose kralen, waardoor elutie van het eiwit wanneer deze moet worden gebonden. Dit is te zien in het getoonde voorbeeld als een relatief kleine hoeveelheid van GFP-Ng is geëlueerd in de EDTA conditie. Kwantificering van eiwit voor de incubatie met kralen kan helpen verbeteren dit.

Een goede voorbereiding en afhandeling van de CAM-Sepharose kralen gedurende het hele experiment is ook essentieel voor succes. Kralen kunnen gemakkelijk verloren gaan tijdens het experiment, hetzij per ongeluk verwijderd worden met supernatant te worden weggegooid of geplakt op de zijkanten en bovenkant van de 2,0 mL buis. Dit kan worden vermeden door het gebruik voorzichtig tijdens het verwijderen van supernatant en het waarborgen van grondig mengen onmiddellijk voorafgaand aan centrifugeren. Probeer het niet te laten zitten tussen de monsters mengen en centrifugeren omdat hiermee CaM-sepharose kralen te drogen aan de zijkanten van de buis. Als voorzorgsmaatregel, resuspendeer kralen en rotate oplossing rond buis om natte parels vlak voor centrifugeren. Grondige onderdompeling van de monsters met de kralen zowel tijdens de binding en elutie incubaties is erg belangrijk. Zonder een passende menging van het monster met de kralen, zal bindend en elutie waarschijnlijk inefficiënt.

Dit protocol is veelzijdig en kan eenvoudig worden aangepast voor andere doeleinden. Het uitvoeren van dit experiment met afgeknotte of gemuteerde eiwitten kunnen onthullen informatie over de regio (s) en residuen van het eiwit die belangrijk zijn voor CaM bindend en Ca 2 +-afhankelijkheid, indien waargenomen. In het geval van Ng, waren we in staat om aan te tonen dat de GFP-Ng, net als de endogene eiwit, CaM bindt alleen in de afwezigheid van Ca 2 + 8. Om verder te verkennen deze functie van deze binding verschillende mutaties van dit eiwit behoud van de IQ-domein te helpen om de aard van de interactie Ng te begrijpen met CAM, alsmede de functie van de post-translationele modificaties, die dit Intera veranderenctie. We testten het belang van Ng-CaM binding met twee verschillende mutanten: een phosphomimic aspartaat in plaats van een serine (S36D of Ng-SD) en een IQ-less Ng om te voorkomen dat de binding aan CAM. We hebben ook geleid tot een mutant (Ng-SFAW) die heeft verbeterde binding aan CAM, blijven zelfs verplicht in de aanwezigheid van Ca 2 +. Tot slot hebben we gebruik gemaakt van een niet-fosforyleerbare mutant (Ng-SA), die aan CaM bindt in een Ca 2 +-afhankelijke manier vergelijkbaar met endogene Ng, maar voorkomt dat fosforylering van proteïne kinase C (PKC). De CAM pull-down test hielp testen van de functionaliteit van deze verschillende mutanten en hielp tonen het belang van Ng-CaM verbindend in synaptische functie acht en hoe Ng fosforylatie helpt fine-tunen synaptische plasticiteit 15.

Daarnaast kan eiwitten die zich binden aan CAM-bindende eiwitten worden geëlueerd. Dit zou verdere toepassingen van deze test bij het bepalen van eiwitten die indirect binden CaM. Het laat de studie van deze andere interactieionen en andere potentiële downstream effecten van CAM en het bindende partners.

Kortom, de CaM pull-down test zorgt voor een efficiënte en effectieve manier om Ca 2 +-afhankelijkheid van de CAM-eiwit interacties te onderzoeken. Dit kan een belangrijk instrument om CAM-eiwit interacties te bestuderen en hoe de verschillende mutaties of aanpassingen kunnen van invloed zijn deze interacties zijn. Dit kan waardevol zijn in het verkennen van de regulering van Ca 2 + / CAM signaleringsroutes. Bovendien kunnen we dit gebruiken om pathologieën worden veroorzaakt door storingen in de Ca 2 + / CAM-signalering te verkennen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

De auteurs willen graag Tiffany Cherry bedanken in haar te helpen bij het optimaliseren van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door National Institute of Aging (AG032320), evenals het bevorderen van een gezondere Wisconsin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calmodulin-Sepharose beads GE Healthcare 17-0529-01
Anti-CamKII alpha Sigma-Aldrich C6974
Anti-neurogranin EMD Millipore 07-425
Gel Loading Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-138 Use for aspiration of supernatants
Microcentrifuge tubes (2.0 mL) Fisher Scientific 05-408-146 Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vincenzi, F. F. Calmodulin in the regulation of intracellular calcium. Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).
  2. Cheung, W. Y. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation. Science. 207, 19-27 (1980).
  3. Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin. Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).
  4. Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein. J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).
  5. Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain. Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).
  6. Bahler, M., Rhoads, A. Calmodulin signaling via the IQ motif. FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).
  7. Routtenberg, A. Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth. Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).
  8. Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).
  9. Needham, D. M. Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction. Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).
  10. Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).
  11. Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain. J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).
  12. Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).
  13. Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes. Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).
  14. Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides. Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).
  15. Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats