Mätning Snabb Kalcium flöden i Cardiomyocytes

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi presenterar en metod för att isolera snabb (mikrosekund) kalcium händelser från långsammare flöden i levande celler med hjälp av laserskanning konfokalmikroskopi. Metoden åtgärder fluorescensintensitet variationer av kalcium indikatorer skannar in raden av flera hundra pixlar i en cell. Histogram analys tillåter oss att isolera tidsskalor för olika kalcium flöden.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (57), e3505, doi:10.3791/3505 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cardiomyocytes har flera Ca 2 + flöden av varierande längd som samverkar för att optimera funktionen 1,2. Förändringar i Ca 2 + aktivitet som svar på extracellulära agenter är främst regleras av fosfolipas Cβ-Gα q vägen lokaliserad på plasmamembranet, som stimuleras av medel såsom acetylkolin 3,4. Vi har nyligen funnit att plasmamembranet protein domäner kallas caveolae 5,6 kan snärja aktiveras Gα q 7. Detta entrapment har effekten av att stabilisera det aktiverade stadiet av Gα q och resulterar i förlängd Ca 2 +-signaler i cardiomyocytes och andra celltyper 8. Vi upptäckte detta överraskande resultat genom att mäta dynamiska kalcium svar på en snabb skala i levande cardiomyocytes. Kortfattat, är cellerna laddade med ett fluorescerande Ca 2 + indikator. I våra studier har vi använt Ca 2 + Grön (Invitrogen, Ic) som uppvisar en ökning av fluorescens utsläpp intensitet vid bindning av kalciumjoner. Fluorescensintensiteten sedan in för att använda en line-scanningsläge en laserskanning konfokalmikroskop. Denna metod gör snabba förvärv av tiden under fluorescensintensiteten i pixlar längs en markerad linje, som producerar flera hundra tiden spår på mikrosekund tidsskalan. Dessa mycket snabba spår överförs till Excel och sedan till SigmaPlot för analys, och jämförs med spår som erhålls för elektroniskt brus, utan färg, och andra kontroller. Att dissekera Ca 2 + svar av olika flux priser, genomförde vi ett histogram analys som binned pixel intensiteter med tiden. Binning tillåter oss att samla över 500 spår av skannar och visualisera sammanställt resultaten rumsligt och tidsmässigt på en enda tomt. Således kan den långsamma Ca 2 + vågor som är svåra att urskilja när genomsökningar överlagrade beror på olika topp placering och buller, lätt ses iden binned histogram. Mycket snabb flöden i tidsskala mätningen visar en smal fördelning av intensitet på mycket kort tid soptunnor medan längre Ca 2 + vågor visa binned data med en bred spridning över längre tid papperskorgar. Dessa olika tid distributioner tillåter oss att dissekera tidpunkten för Ca 2 + flöden i cellerna, och för att fastställa deras inverkan på olika cellulära händelser.

Protocol

1. Fylla celler med kalcium indikatorer

  1. Plate celler i 35mm Mattek glas botten rätter (eller något annat glas botten ser kammare).
  2. Om du använder primära myocyter päls kamrarna 1 dag före med 10μg/ml laminin. Plate hjärt myocyter (isolerade från vuxna hundar, neonatala råttor, eller annan organism) i KB buffert (K-återföring Tyrode buffert 35 mmol / L av HEPES, 140 mmol / L KCl, 8 mmol / L KHCO 3, 2 mmol / L av MgCl 2 och 0,4 mmol / L av KH 2 PO 4, pH 7,5) och ändra den gradvis till M199 mediet kompletteras med 15% fetalt bovint serum och 1% streptamycin och 0,5% gentamicin och inkubera vid 37 ° C i 5% CO 2.
  3. Inkubera cellerna med kalcium gröna AM (1-5 mikroM, molekylära sonder) eller valfri kalcium indikator för 30-45 minuter i rumstemperatur. Täck formen med aluminiumfolie för att undvika fotoblekning av färgen.
  4. Tvätta cellerna tre gånger med Leibovitz15 medium med 14mm EGTA (om att utföra experiment i lågt kalcium) eller lämpliga medier visning.
  5. Inkubera i ytterligare 30-45 minuter i Leibovitz15 medelhög containing14mM EGTA.
  6. Om testa effekterna av inhibitorer (dvs 10μM U73122 PLC-hämmare) lägg till dem under det andra inkubation.

2. Microinjecting celler

  1. Kultur cardiomyocytes i Mattek glas botten rätter (eller andra visning kammare) för 24h.
  2. Ändra på medellång till fenol-fri Leibovitz-15 med 14 mm EGTA (cardiomyocytes måste injiceras i kalcium fritt medium, kan andra celler injiceras i medium som innehåller kalcium).
  3. Förbered mikroinjektion lösning - våra studier använt en peptid som eliminerar Gα Q - caveolae interaktioner. Tänk på att endast en liten mängd av volym injiceras in i cellen (~ FL) och så rimligen koncentrerade lager måste användas. Vi använde 2 mikroM av denna peptid, Cav3-schavotten, med DAPI i kalcium-free medium. DAPI är en Blue färgämne som färgar kärnan och möjliggör identifiering av celler som har idag injiceras. DAPI stör inte fluorescens av många kalcium indikatorer. Mängden DAPI varierar och vi använder i allmänhet tillräckligt för att visualisera kärnan (0,5 och 2 M)
  4. Bered kontroll lösning som innehåller DAPI - färgen tracer ensam.
  5. För microinjections använda själv-drog eller kommersiellt tillgängliga nålar. Öva med färg injektion för att bestämma lämplig nål parametrar. Vi noterar att olika celler kan kräva olika nål diameter och tryck mikroinjektion.
  6. Använda automatiska mikroinjektion system, till exempel en InjectMan NI2 med FemtoJet pump från Eppendorf. Ställ insprutningstryck P i till 90 hPa, och ersättningen trycket P C till 45 hPa. Ställ in t injektion tid till 0,7 s. Justera parametrarna för injektion som behövs.
  7. Utför microinjections på ett inverterat mikroskop (t.ex. Zeiss Axiovert 200M) utrustade med långa arbetsdagar avstånd faskontrast mål (till exempel luft-40x fas 2 mål).
  8. Injicera så många celler som möjligt på ett snabbt sätt. Undersök injiceras celler med faskontrast att välja livskraftiga celler.

3. Co-immunofluorescens studier

  1. Tvätta cellerna två gånger med PBS och fixa med 3,7% paraformaldehyd i 30 minuter. Vid behov kan cellerna stimuleras innan fixeringen.
  2. Tvätta fasta celler tre gånger med PBS och inkubera med 0,2% NP40 i PBS för 5minutes.
  3. Block med PBS innehållande 4% get serum (eller annan lämplig serum) för 1 timme.
  4. Inkubera cellerna med primära antikroppen i lämplig spädning med 1% get serum i PBS för 1 timme.
  5. Tvätta cellerna tre gånger 10 minuter med 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6 följdes genom tillsats av fluorescerande märkt sekundär antikropp, som Alexa-Fluor-488 anti-kanin eller Alexa-Fluor-647 anti-mus sekundär antikropp utspädd till 1: 1000 1% get serum i PBS (notera att när sondering för två olika proteiner som de primära antikropparna måste höjas i olika arter och de sekundära måste vara mot motsvarande arter).
  6. Inkubera vid 37 ° C i 1 timme, tvätta tre gånger med TBS.
  7. Visa celler i TBS buffert eller annan lämplig visning medium.

4. Snabb kalcium imaging

  1. Använd laserskanning konfokalmikroskop (till exempel Fluoview 1000 Olympus).
  2. Använd hög numerisk apertur mål.
  3. Ställ förvärvet parametrar. För kalcium gröna använda 488 nm excitation och lång passning 515 utsläpp filter.
  4. Justera pixel tid - för snabb kalcium mätningar ställ in den på 2 ìs / pixel.
  5. Ställ in zoom för att uppnå pixelstorlek på 0,05 till 0,3 ìm.
  6. Välj en linje från en cell i val i en viss region.
  7. Under tiden controller fönstret väljer tid förvärv för minst 1500 scanningar (för att få önskad tidsramsvaret - 1,3 ms / linje skulle ge 2 sekunder).
  8. Spela bakgrundsvärden före stimulering.
  9. Stimulera celler med 5 mikroM karbakol och omedelbart börja spela in data. Håll celler i 1 ml Leibovitz15 medium förbereda 10 mikroM karbakol i Leibovitz15 och tillsätt försiktigt 1 ml i skålen

5. Dataanalys

  1. Extrahera de stödnivåer för varje pixel från inspelade bilden. Spara intensiteten data som en tabell med Fluoview 1000 programvara.
  2. Importera intensitet data till SigmaPlot eller liknande analys av data program och bin data till ~ 9-40 papperskorgar. Jämför styra experiment och elektroniskt brus.

6. Representativa resultat:

Vi avbildade celler laserskanning konfokalmikroskop LSM510 (Zeiss Jena, Tyskland) utrustade med multi-line laser excitation och en 40x/1.2 NA apochromat nedsänkning i vatten mål. I figur. 1 (röd) visar vi distribution av caveolae i hund cardiomyocytes vuxna ventrikulära som har fasta och färgas med en antikropp mot caveolin-3 som är det stora strukturella caveolar protein i cellerna 9. Caveolin-3 var immunolabelled med Alexa-647 och upphetsad med 633-nm linje från en Han: Ne laser. Bilder spelades in med hjälp av LP650-filter nm utsläpp. Fördelningen av caveolin-3 jämfördes Gα q som var immunolabeled med Alexa-488 (grön). Alexa-488 var glada med 488nm Argon-jon-laser linje och bilden togs med BP505-530nm utsläpp filter. I dessa colocalization mätningar var de två fluoroforer upphetsad på ett sekventiellt sätt med hjälp av Multi Track förvärvet. Detta förfarande minimerar kanal överhörning. Dataanalys för colocalization utfördes med hjälp av AIM-programvara medföljer Zeiss LSM510-meta. Som synes är de två proteinerna colocalized.

För att avgöra hur kopplingen mellan caveolin-3 och Gα 2 + Green. Vi glada färgen med en 488nm Argon-jon-laser och samlas in bilder via en LP515 utsläpp filter. Bild ramar samlades in vid 500 ms intervall. Intensitet värden för varje pixel utvanns med Olympus programvara och ImageJ. Linjen Scan Mode har använts för kvantitativ analys av snabbare Ca 2 + transienter och Ca 2 + gnistor. Den pixelstorlek använts i denna studie var 0,1-0,3 ìm. Den line-avsökningshastighet var omkring flera hundra ìs per rad. I figur. 2 visar vi en rad genomsökning av en Ca 2 + Green-lastade cardiomyocyte där pixel dväl tiden var 2 ìs, var linjen tiden 142 ìs. Bilden är sammansatt av 1200 linjer.

Varje rad i skanna motsvarar intensiteten fluktuationer av Ca 2 + Grön består av 71 punkter som tagits under en 142 ìs sortiment och kan användas som en snabb avläsning för kalcium svar. Till exempel i bild. 3 visar vi Ca 2 + aktivitet av en enda rad enskilda cardiomyocyte, mätt som Ca 2 + grön fluorescens intensiteten som funktion av tid i sekunder före (överst) och efter (nederst) tillägg av 5 mikroM karbakol vilket ökar nivån av intracellulära Ca 2 + genom Gα q-PLCβ aktivitet. När många linjer är genomsnitt, producerar karbakol stimulering en ~ 1,8-faldig ökning av Ca 2 + grön intensitet. På grund av variationer i experimentella förhållanden (rumstemperatur, laser makt, detektorns utslag, preparat distributioner, etc), kan denna ökning inte ses i enskildaline skanningar. Även om intensiteten värdena (y-axeln värden) är likartade, är det tydligt att karbakol-stimulerad tomt på botten har mycket bredare toppar, motsvarande mer ihållande kalciumnivåer, än den smala fluktuationen topparna sett förut stimulering. Denna breddning och relativa ökningen i intensitet fördunklar små, långsammare svängningar. Vårt mål är att bättre skilja mellan dessa olika uppenbara typer av kalcium fluktuationer.

Ett annat exempel på dessa snabbt kalcium fluktuationer visas i figur. 4. Den övre grafen visar råa linjen data för stimulerad ventrikulär cardiomyocytes (röd) och i genomsnitt 3 linje spår visas i svart. För att bestämma den mån dessa kalcium fluktuationer förmedlades av Gα Q - caveoline3 interaktioner, idag injiceras vi en peptid som destabiliserar caveolin-3 - Gα q interaktion (dvs Cav3 peptid) vilket eliminerar längre Ca 2 + aktuella och dessa data visas i blått(Vi notera att vi subtraheras 500 från Cav3 peptid intensitet så att de två spåren bättre kan skönjas).

Vi importerade kolumnerna av rådata från vår Excel-filer till SigmaPlot (Jandel, Inc.) och genomförde ett histogram analys. I denna analys är antalet händelser grupperas i lika många rutor (lådor) för att producera ett histogram. Bredden på bin representerar en lika tidsintervall. De stödnivåer som förs in i olika tid binder så att höjden av en viss bin representerar det antal gånger som intensitet uppstår i synnerhet tidsfönster. Eftersom denna typ av analys bara beror på att samla in data på samma avsökningshastighet kan många spår analyseras samtidigt. Dessutom är denna analys inte är känsligt för skillnader i färg nivåer, laser makt, etc., samt elektroniska och bakgrundsljud inträffar vid tidsskalor mycket snabbt och är bara sett i de första 1-2 fack.

Motsvarande histograms av rådata i bild. 4 visas längst ner på sidan. Histogrammet för kontroll cellerna är spridd över ett stort antal lådor som motsvarar en bred tid distribution, som skildras av den röda linjen (linjen är för att styra ögat och ingen modell antas). Däremot är behållare för svaret av celler där Gα Q-Cav3 interaktion stördes av peptid begränsad till en smal bin fördelning tyder på att förekomsten av peptiden eliminerar längre tid flöden. Mikroinjektion av en kontroll peptid som inte stör Gα q-Cav3 ger ett histogram liknande un-injicerade cellerna 8.

I figur. 5 jämför vi den snabba intensitet fluktuationer av Ca 2 + Green i vuxen hund ventrikulär cardiomyocytes (vänster) och färsk, ostimulerade råtta neonatal cardiomyocytes som saknar caveolae (höger). Här var motsvarande histogram intensiteten under en 3 minuters period binned kl 35 för att visa långsammare kalcium händelser. Observera att den neonatala cardiomyocytes visa snabbrörliga fluktuationer på en plan baslinje visar bristen på långsammare Ca 2 + aktivitet, medan ett mer strukturerat baslinjen syns för vuxna celler. Dessa skillnader är lättast ses i histogram.

Figur 1
Figur 1. Bilder av hund cardiomyocytes vuxna ventrikulära som visar fördelningen av Gα q immunolabeled med Alexa-488 där Alexa-488 var glada med 488nm Argon-jon-laser linje och bilden togs med BP505-530nm utsläpp filter. Den övre högra är samma bild att titta på lokalisering av caveolin-3 immunolabeled med Alexa-647, upphetsad med 633-nm linje från en Han: Ne laser och in med LP650-filter nm utsläpp. Det sammanslagna bild där colocalization ses i orange är längst ner till vänster med ett utökat bilden till höger.

"Pdflinebreak">

Figur 2
Figur 2. Kalcium avbildning av en levande hund vuxen ventrikulär cardiomyocyte lastad med Ca 2 + Green. Bilden togs på en konfokala scanning mikroskop system med ett 40x objektiv med hjälp av en 488nm Argon-jon-laser och en LP515 utsläpp filter. Bilden är sammansatt av 1200 linjer, pixeln uppehållstiden var 2 ìs, och pixelstorlek var 0,1 ìm.

Figur 3
Figur 3. TOP Intensiteten fluktuationer av en rad spår från en levande hund vuxen ventrikulär cardiomyocyte lastad med Ca 2 + Green och avbildade som beskrivs, och botten samma cell stimuleras genom tillsats av 5 mikroM karbakol.

/ 3505fig4.jpg "/>
Figur 4. TOP Ett exempel på linje spår från en levande hund vuxen ventrikulär cardiomyocyte lastad med Ca 2 + grön (röd) tagit över 180 ms, när medeltalet av tre spår visas som en svart linje, och jämfört med en cell som var idag injiceras med en peptid som stör Gα Q-caveolin 3 Association (röda) där i genomsnitt tre spår finns i svart. Vi noterar att vi subtraheras 400 intensitet räknas från den lägre uppsättning data för visning ändamål. Ju lägre panelerna är motsvarande histogram av binned uppgifter som beskrivs i texten, och där bin numret är godtycklig och bin räkna (eller helt enkelt räkna) motsvarar den totala intensiteten i just bin. Vi noterar att linjen röda och blå linjer dras i kontrollgruppen (vänster) och peptid (höger) histogram är att möjliggöra lättare identifiering och jämförelser av data och ingen modell förutsätts.

files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg "/>
Figur 5. Intensiteten fluktuationer av Ca 2 + Green i vuxen hund ventrikulär cardiomyocytes (vänster) och färsk, ostimulerade råtta neonatal cardiomyocytes som saknar caveolae (höger) och deras motsvarande histogram visas nedan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har utvecklat en metod för att visa och isolera snabb kalcium signaler i levande cardiomyocytes. Medan de experimentella villkoren för dessa mätningar har tidigare använts på andra cellsystem 10 samt cardiomyocytes 11, tillåter användning av histogram och bin analys data från många Ca 2 + händelser som ska förvärvas. Snabbare händelser lätt kan isoleras från långsammare ettor och modeller anpassade för att förstå de underliggande mekanismer. Odling cardiomyocytes, som många primära cellinjer, kan vara svårt. Medan det är allmänt trott att mätningar ska tas strax efter cellerna förvärvas, har vi funnit att de vuxna hund cardiomyocytes vi använde i denna studie bara börjar förlora sina specifika egenskaper efter 3 dagar. Denna längre tidsram gör att cellerna att ordentligt fästa på underlaget försäkra att cellerna kommer att överleva potentiellt dödliga behandlingar såsom mikroinjektion. Stora engagemang är avgörandeför att lyckas med mikroinjektion.

Vi kontrollerade roll Gα Q-caveolin 3 förening i kalcium flöden av microinjecting en peptid som stör deras interaktion. Vi vill betona att mikroinjektion måste göras med stor försiktighet för att minimera skador på cellen och läckage av cellulära innehåll. Dock måste dessa risker vägas med hjälp av större diameter nålar som behövs för att leverera en tillräcklig mängd av material till de relativt stora cardiomyocytes. Införandet av ett färgämne som DAPI som gör att man kan spåra vilka celler har mikroinjektion är viktigt. Som nämnts är det viktigt att för mikroinjektion myocyter badar i kalcium fritt medium och att den injicerade lösningar är också gratis av kalcium. Inflöde av extracellulärt kalcium initierar sammandragningar och senare död av celler

Mätningarna själva kan anpassas till andra celltyper, färgämnen och konfokala lasersystem för att följa andra snabba cell händelser såsom insoitol 1,4,5 trisphospate och flöden cAMP, även om Ca 2 + flussmedel är säkerligen en av de mest komplexa cellulära budbärare. Man bör vara försiktig med att välja fluorescerande indikatorer som inte är lätt photobleached och har en robust och dynamisk fluorescens respons så att låga laser befogenheter kan användas. Låg laser makt kommer också undvika lokal uppvärmning som kan ge upphov till oönskade cellulära effekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag 2R01 GM53132 och P50 GM071558.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen ABCD1234

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, H., Lederer, M. R., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 270, 148-159 (1996).
  2. Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiol. Rev. 88, 1491-1545 (2008).
  3. Rebecchi, M. J., Pentyala, S. N. Structure, function, and control of phosphoinositide-specific phospholipase. C. Physiol.Rev. 80, 1291-1335 (2000).
  4. Suh, P. Multiple roles of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes. BMB reports. 41, 415-434 (2008).
  5. Schlegel, A. Crowded little caves: structure and function of caveolae. Cell. Signal. 10, 457-463 (1998).
  6. Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199-225 (1998).
  7. Sengupta, P., Philip, F., Scarlata, S. Caveolin-1 alters Ca2+ signal duration through specific interaction with the G{alpha}q family of G proteins. J. Cell. Sci. 121, 1363-1372 (2008).
  8. Guo, Y., Golebiewska, U., Scarlata, S. Modulation of Ca2+ Activity in Cardiomyocytes through Caveolae-G[alpha]q Interactions. Biophysical. Journal. 100, 1599-1607 (1016).
  9. Rybin, V. O., Xu, X., Lisanti, M. P., Steinberg, S. F. Differential targeting of beta -adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase to cardiomyocyte caveolae. A mechanism to functionally regulate the cAMP signaling pathway. J. Biol. Chem. 275, 41447-41457 (2000).
  10. Tovey, S. C. Calcium puffs are generic InsP3-activated elementary calcium signals and are downregulated by prolonged hormonal stimulation to inhibit cellular calcium responses. J. Cell. Sci. 114, 3979-3989 (2001).
  11. Lohn, M. Ignition of Calcium Sparks in Arterial and Cardiac Muscle Through Caveolae. Circ. Res. 87, 1034-1039 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics