A Based Chitosan, Laser adhesivo activado Thin Film quirúrgica, 'SURGILUX' Preparación y Demostración

Bioengineering

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Summary

La fabricación de una novela, de película delgada adhesivo flexible quirúrgico de los ingredientes aprobados por la FDA, el quitosano y verde de indocianina se describe. La unión de este adhesivo para tejido colágeno a través de un proceso de activación simple con una baja potencia de infrarrojos láser se demuestra.

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Foster, L. J., Karsten, E. A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, 'SurgiLux': Preparation and Demonstration. J. Vis. Exp. (68), e3527, doi:10.3791/3527 (2012).

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Abstract

Las suturas son una tecnología de 4.000 años de edad que siguen siendo el "patrón oro" para cierre de heridas en virtud de su fuerza de reparación (~ 100 KPa). Sin embargo, las suturas pueden actuar como un nido para la infección y en muchos procedimientos son incapaces de efectuar la reparación de heridas o interferir con la regeneración del tejido funcional. 1 pegamentos y adhesivos quirúrgicos, tales como los basados ​​en fibrina y cianoacrilatos, se han desarrollado como alternativas a las suturas para la la reparación de tales heridas. Sin embargo, los actuales adhesivos comerciales también tienen desventajas significativas, que van desde la transferencia viral y priones y la falta de fuerza de reparación como con las colas de fibrina, a toxicidad del tejido y la falta de biocompatibilidad para los adhesivos a base de cianoacrilato. Además, los adhesivos quirúrgicos disponibles actualmente tienden a ser a base de gel y se puede haber extendido los tiempos de curado que limitan su aplicación. 2 Del mismo modo, el uso de láseres UV para facilitar la reticulación mecanismos a base de proteínas o albúmina 'solDers "puede conducir a daños en el ADN durante la soldadura láser del tejido (LTW) predispone a daño térmico a los tejidos. 3 A pesar de sus desventajas, adhesivos y LTW han capturado aproximadamente el 30% del mercado de cierre de la herida informado de que más de 5 dólares EE.UU. millones de dólares al año, un testimonio significativo a la necesidad de una tecnología sin sutura. 4

En la búsqueda de la tecnología de sutura hemos utilizado quitosán como un biomaterial para el desarrollo de una película flexible, delgada, láser adhesivo activado quirúrgico denominado «SURGILUX '. Este bioadhesivo novela utiliza una combinación única de los biomateriales y la fotónica que están aprobados por la FDA y utilizado con éxito en una variedad de aplicaciones biomédicas y productos. SURGILUX supera todas las desventajas asociadas con suturas y adhesivos quirúrgicos actuales (ver Tabla 1).

En esta presentación se presenta el protocolo relativamente sencillo para la fabricación de SURGILUX y demostrarsu activación láser y resistencia de la soldadura del tejido. Películas SURGILUX adherirse a tejido de colágeno sin modificación química tal como la reticulación y mediante irradiación utilizando una comparativamente baja potencia (120 mW) láser de infrarrojos en lugar de luz UV. Películas de quitosano tienen una atracción adhesivo natural pero débil al colágeno (~ 3 KPa), activación por láser de la base de quitosano SURGILUX películas acentúa la fuerza de esta adhesión a través de interacciones de cadena de polímero como consecuencia de la expansión térmica transitoria. 5 Sin esta "activación" proceso , películas SURGILUX se eliminan fácilmente. 6-9 SURGILUX se ha probado tanto in vitro como in vivo en una variedad de tejidos incluyendo los nervios, el intestino, la duramadre y la córnea. En todos los casos se demostró una buena biocompatibilidad y daño térmico insignificante como consecuencia de la irradiación. 6-10

Protocol

1. Preparación de la solución SURGILUX

  1. Preparar un 2% (v / v) de solución de ácido acético usando agua desionizada en un vaso de precipitados de vidrio limpio; utilizar una campana de flujo laminar para evitar la contaminación.
  2. Pesar 0,02% (w / v) del cromóforo, verde de indocianina, ICG, en un tubo Eppendorf estéril; asegura que el tubo se envuelve en papel de aluminio para evitar cualquier penetración de la luz.
  3. Utilizando una pipeta limpia, desechable, transferir aproximadamente 1 ml de la solución de ácido acético diluido al tubo para disolver el colorante, agitar suavemente y mantener envuelto en papel de aluminio.
  4. Transferir el ICG solubilizado en el vaso de precipitados y se añade 2% (w / v) de polvo de quitosano antes de la adición de un agitador magnético estéril.
  5. Cubrir el vaso con Parafilm luego envolver en papel de plata, antes de mezclar el contenido a aproximadamente 125 rpm durante 72 horas a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar.
  6. Transferir el contenido en tubos de centrífuga limpio y se centrifuga a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C para eliminar cualquier particulaTE materia.
  7. Transferir cuidadosamente la solución SURGILUX verde en un vaso de precipitados de vidrio limpio, cubrir con Parafilm luego envolver en papel de plata, antes de almacenar en un refrigerador durante 12 horas para aumentar la viscosidad de la solución.

2. Fundición de SURGILUX Películas

  1. Usando una jeringa estéril, dispensar 8 ml de la solución SURGILUX fría en un recipiente limpio, de Petri de 95 mm de diámetro, y suavemente incline la placa para asegurar la cobertura completa de la solución. Variando la relación de volumen de la solución a la zona de fundición permite el control del espesor de película, véase la figura 1.
  2. Eliminar las burbujas visibles de la solución usando la punta de una aguja estéril. Cubra el plato en papel de aluminio y coloque en el refrigerador para eliminar cualquier residuo de burbujas de tamaño micrométrico.
  3. Después de 20 minutos retirar con cuidado la placa de Petri de la nevera, coloque en una campana de flujo laminar, cubrir con papel de aluminio y dejar que se evapore la solución durante 3 semanas.
  4. Después de la complete evaporación, la puntuación de los bordes exteriores de la película SURGILUX verde claro en la placa de Petri y suavemente 'cáscara' la película lejos de la superficie del plato.
  5. La película SURGILUX debe ser flexible y fácilmente manipulado sin rasgarse o romperse.
  6. La tienda de las películas SURGILUX circulares en la placa de Petri envueltas en papel de plata en seco hasta que esté listo para su uso.

3. La activación de láser SURGILUX películas adhesivas

  1. Para demostrar el proceso de activación del láser que se use un trozo de tejido bovino tales como carne cortada a un tamaño de 15 mm de ancho y 20 mm de longitud. Diseccionar el tejido en una línea recta usando un Número de cuchilla quirúrgica 10, para producir 2 piezas de 15 por 10 mm.
  2. Aproximado las dos piezas de tejido de manera que sus bordes se toquen pero no se superponen, y usando un hisopo de algodón o gasa, suavemente absorber cualquier exceso de líquido.
  3. A continuación, cortar un trozo de película SURGILUX 7 x 9 mm y coloque cuidadosamente los longitudinalmente a través de la película dividida en dos partes pIECE de tejido, luego presione suavemente con un bastoncillo de algodón seco.
  4. Películas SURGILUX se activan usando un láser de diodo de infrarrojos en un ajuste de 120 mW. Como se trata de un láser de clase III B, las medidas de seguridad apropiadas deben ser tomadas, incluyendo el uso de gafas de seguridad apropiadas para todo el personal.
  5. A partir de la esquina, irradiar el SURGILUX con un láser infrarrojo a 120 mW y un tamaño de punto de luz de 1 mm de diámetro. Pasar el punto del haz sobre la película de verde a un ritmo de aproximadamente 1 mm por segundo. Repetir el proceso de irradiación de dos veces más.

4. La fuerza de la reparación

  1. Cuidadosamente asegurar los extremos del tejido en las mordazas de un instrumento de ensayo de tracción. Estamos utilizando un Instron Mini55 sistema con una célula de carga de 50 Newton. La carga máxima, resistencia a la tracción, y la extensión a la rotura se calcularon utilizando software Bluehill ordenador (EE.UU.). Medios de al menos 10 muestras fue determinada (n = 10).
  2. Tomad el 'slack'y luego se separan las piezas de tejido a una velocidad de 1 mm por segundo, hasta que las dos piezas de tejido unidas por la tira SURGILUX separado completamente.

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Representative Results

Centrifugación lleva a una solución transparente verde, lo que aumenta la viscosidad después del almacenamiento a 4-6 ° C. Después de reposar durante 3 semanas, la solución de color verde se convierte en una película transparente verde SURGILUX aproximadamente 20 micras de espesor y, como se demuestra en el vídeo, es fácilmente flexible.

Tras la irradiación con el láser, los lazos de película SURGILUX al tejido. Esto se puede observar en los bordes de la película donde el tejido parece contraerse como el rayo láser pasa a través de la película (Figura 2). No carbonización o ablación del tejido y la película debe ser observada. La resistencia de unión de SURGILUX al tejido debe ser suficiente para levantar las piezas de tejido bisectados, y cuando la resistencia a la tracción se mide debe ser de aproximadamente 15 kPa para el ensayo recogido aquí.

Tabla 1
Tabla 1. </ Strong> Comparación de las propiedades de sistema propuesto SURGILUX fibrina y cianoacrilato comercialmente disponible y adhesivos quirúrgicos.

Figura 1
Figura 1 ilustración esquemática de la SURGILUX fabricación delgada película adhesiva y el proceso de activación;.. Correspondiente al texto del protocolo Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 2
Figura 2 Fotografía (x20) que muestra la película SURGILUX delgado después de la activación láser adherido al tejido intestino bovino y 'contratación' en la incisión del tejido (T A, T B:. Piezas separadas otejido f, I: incisión, S: SURGILUX película).

Figura 3
Figura 3 Gráfico que muestra los puntos fuertes de tejido de adherencia para diversos adhesivos:. Chitosan y películas SURGILUX aplicados sobre el tejido, Tisseel (fibrina) y geles Histoacryl (cianoacrilato) aplicados sobre el tejido.

Figura 4
Figura 4 micrografías electrónicas de barrido (SEMS) ilustran células unidas a las películas; SURGILUX. Linajes celulares humanas (a) células olfativas ensheathing [x1.5k], (b) los fibroblastos del estroma [x500], y (c) músculo esquelético células madre derivadas de satélite [x1.7k]. Haga clic aquí para ampliar la cifra .


Figura 5. Gráfico que muestra el cambio en el espesor de la película con el aumento de volumen SURGILUX colada solución (ml) y un área de fundición constante (7,09 x 10 3 mm 2).

La figura 6
Figura 6. Micrografía electrónica de barrido (SEM) de la película muestra la presencia de 'pezones' (SN) que sobresalen de la superficie (S).

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Discussion

El quitosano puede ser obtenido en una variedad de pesos moleculares y con diferentes grados de deactylation (DDA). Las variaciones en la pureza de quitosano puede conducir a la presencia de partículas en la solución SURGILUX; centrifugación se utiliza para eliminar estos y debería resultar en una solución de color verde transparente. Sin embargo, la filtración también se puede utilizar como una etapa de fabricación adicional o alternativa. Como con cualquier tratamiento de materiales, variaciones, tales como quitosano DDA y el peso molecular, tienen implicaciones para las propiedades fisicoquímicas, biológicas y materiales de las películas SURGILUX resultantes, incluyendo la fuerza de su unión al tejido.

El proceso de fabricación para SURGILUX permite una variación considerable. Por ejemplo, los cambios en la relación de volumen de la solución a la superficie de colada (ml: mm 2) se puede utilizar para ajustar el espesor de la película La figura 5 muestra un incremento lineal en el espesor de las películas finales SURGILUX como el volumen.de solución se vertió en la placa de Petri se incrementó. Del mismo modo, las modificaciones de la superficie de colada se puede utilizar para modificar la morfología de la película superficial. Figura 6 muestra la presencia de micras de tamaño 'pezones' en la superficie de la película de SURGILUX. Tales técnicas de plantillas se pueden utilizar para producir varias superficies para mejorar la adherencia del tejido, impedir la adhesión célula microbiana y promover la reintegración del tejido. 11 Además, varios agentes biológicamente activos se pueden incorporar en el proceso de fabricación para producir una película adhesiva para la administración de fármacos regional. 10

La Tabla 1 resume las ventajas de este sistema SURGILUX delgada película adhesiva en comparación con fibrina convencional y los adhesivos de cianoacrilato. Mientras que la fuerza de la reparación del tejido es inferior a suturas, SURGILUX evita los numerosos inconvenientes de esta técnica de cierre de heridas tradicionales, así como los actuales desfavorecidas adhesivos quirúrgicos comerciales.

La capacidad de SURGILUX para unir varios tejidos de colágeno combinado con su flexibilidad del material sugieren su potencial en laparoscopia, mientras que la versatilidad del proceso de fabricación promueve su desarrollo para aplicaciones en ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Los autores reconocen una beca de la National Health and Medical Research Council de Australia (NHMRC # 1000674) para LJR Foster.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chitosan Sigma-Aldrich 448877
Indocyanine Green Sigma-Aldrich I2633 Also known as Cardiogreen
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099
Infra-red diode laser with fiber delivery. (808 nm, 120 mW, Beam core 200 μm) CNI Lasers Fc-808 Variable system up to 5 W power
Laser safety glasses CNI Lasers LS-G
Tensile testing apparatus Instron Pty Ltd 5542 50 N load cell

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References

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