Un Based Chitosano, Laser attivato sottile pellicola adesiva chirurgici, 'SURGILUX': Preparazione e dimostrazione

Bioengineering

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Summary

La fabbricazione di un romanzo, flessibile adesivo a film sottile chirurgico con ingredienti approvati dalla FDA, chitosano e verde indocianina è descritto. Incollaggio di questo adesivo al tessuto collagene attraverso un processo di attivazione semplice con una bassa potenza laser infrarosso è dimostrata.

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Foster, L. J., Karsten, E. A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, 'SurgiLux': Preparation and Demonstration. J. Vis. Exp. (68), e3527, doi:10.3791/3527 (2012).

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Abstract

Le suture sono una tecnologia vecchia 4000 anni che rimangono il 'gold standard' per la chiusura della ferita in virtù della loro forza riparazione (~ 100 kPa). Tuttavia, suture può agire come un nidus di infezione e in molte procedure sono in grado di effettuare la riparazione della ferita o interferire con la rigenerazione del tessuto funzionale. 1 colle chirurgiche e adesivi, come quelli a base di fibrina e cianoacrilati, sono stati sviluppati come alternative per suture la riparazione di tali ferite. Tuttavia, gli attuali adesivi commerciali anche svantaggi significativi, che vanno dal trasferimento virale e prioni e una mancanza di forza riparazione come con le colle di fibrina, a tossicità per i tessuti e la mancanza di biocompatibilità per gli adesivi a base di cianoacrilati. Inoltre, adesivi chirurgiche attualmente disponibili tendono ad essere a base di gel e può essere esteso tempi di polimerizzazione che limitano la loro applicazione. 2 Analogamente, l'uso dei laser UV per facilitare meccanismi di reticolazione a base di proteine ​​o albumina 'solDers 'può portare a danni al DNA, mentre il tessuto di saldatura laser (LTW) predispone danno termico ai tessuti. 3 Nonostante i loro svantaggi, adesivi e LTW hanno catturato circa il 30% del mercato chiusura della ferita risulta essere superiore a 5 miliardi di dollari all'anno, una testimonianza significativa alla necessità di una tecnologia sutureless. 4

Nella ricerca della tecnologia sutureless abbiamo utilizzato chitosano come biomateriale per lo sviluppo di un flessibile, film sottile, laser adesivo attivato chirurgica denominata 'SURGILUX'. Questo bioadesivo romanzo utilizza una combinazione unica di biomateriali e fotonica che sono approvati dalla FDA e utilizzato in una varietà di applicazioni biomediche e prodotti. SURGILUX supera tutti gli svantaggi associati a suture chirurgiche e adesivi attuali (cfr. tabella 1).

In questa presentazione riportiamo il protocollo relativamente semplice per la fabbricazione di SURGILUX e dimostraresua attivazione laser e saldatura resistenza del tessuto. Film SURGILUX aderire al tessuto collagenoso senza modificazione chimica come reticolazione per irradiazione e con una relativamente bassa potenza (120 mW) laser infrarosso invece di luce UV. Film chitosano hanno un'attrazione naturale ma debole adesivo collagene (~ 3 KPa), l'attivazione del laser basato chitosano SURGILUX film sottolinea la forza di questa adesione tramite interazioni di catena polimerica come conseguenza della dilatazione termica transitoria. 5 Senza questo processo di 'attivazione' , film SURGILUX sono facilmente rimovibili. 6-9 SURGILUX è stata testata sia in vitro che in vivo su una varietà di tessuti compresi nervo, intestino, dura madre e cornea. In tutti i casi è dimostrato buona biocompatibilità e trascurabile danno termico come conseguenza di irradiazione. 6-10

Protocol

1. Preparazione della Soluzione SURGILUX

  1. Preparare un 2% (v / v) di acido acetico con acqua deionizzata in un bicchiere di vetro pulito, utilizzare una cappa a flusso laminare per evitare la contaminazione.
  2. Pesare 0,02% (w / v) del cromoforo, verde indocianina, ICG, in una provetta Eppendorf sterile; garantire il tubo viene avvolto in carta stagnola per evitare la penetrazione della luce.
  3. Utilizzando un pulito, pipetta monouso, trasferire circa 1 ml della soluzione di acido acetico diluito al tubo di sciogliere il colorante, agitare delicatamente e tenere avvolto in carta.
  4. Trasferire l'ICG solubilizzato nel becher e aggiungere 2% (w / v) di polvere chitosano prima di aggiungere un agitatore magnetico sterile.
  5. Coprire il becher con Parafilm poi avvolgere in lamina d'argento, prima di mescolare il contenuto a circa 125 giri al minuto per 72 ore a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare.
  6. Trasferire il contenuto in provette da centrifuga pulite e centrifugare a 15.000 xg per 15 min a 4 ° C per rimuovere qualsiasi particulate la materia.
  7. Trasferire accuratamente la soluzione verde SURGILUX in un bicchiere di vetro pulito, coprire con Parafilm poi avvolgere in carta stagnola, prima di riporre in frigorifero per 12 ore per aumentare la viscosità della soluzione.

2. Fusione di SURGILUX Films

  1. Utilizzando una siringa sterile, dispensare 8 ml della soluzione SURGILUX freddo in un ambiente pulito, piastra di Petri di 95 mm di diametro, e inclinate leggermente la piastra per garantire la copertura completa della soluzione. Variando il rapporto di volume di soluzione di area di colaggio permette di controllare lo spessore del film, vedi Figura 1.
  2. Rimuovere eventuali bolle visibili nella soluzione con la punta di un ago sterile. Coprire il piatto in foglia argento e posto in frigorifero per rimuovere eventuali residui di micron di dimensioni bolle.
  3. Dopo 20 min rimuovere attentamente la piastra Petri dal frigorifero, posto in una cappa a flusso laminare, coprire con carta argentata e lasciare evaporare la soluzione per 3 settimane.
  4. Dopo aver coevaporazione mplete, punteggio i bordi esterni della pellicola trasparente SURGILUX verde nella capsula Petri e delicatamente 'buccia' del film dalla superficie della parabola.
  5. Il film SURGILUX dovrebbe essere flessibile e facilmente manipolata senza strappi o rotture.
  6. Conservare i film SURGILUX circolari in una capsula di Petri avvolto in lamina d'argento asciutta fino al momento dell'uso.

3. L'attivazione del laser SURGILUX pellicole adesive

  1. Per dimostrare il processo di attivazione laser useremo un pezzo di tessuto bovino come bistecca tagliata a una dimensione di 15 mm di larghezza e 20 mm di lunghezza. Sezionare il tessuto in una linea retta con una lama chirurgica Number 10, per produrre due pezzi di 15 per 10 mm.
  2. Approssimativo i due pezzi di tessuto in modo che i loro bordi si toccano ma non si sovrappongono, e l'utilizzo di un tampone di cotone o garza, delicatamente assorbire il liquido in eccesso.
  3. Quindi, tagliare un pezzo di pellicola SURGILUX 7 x 9 mm e depositarla lunghezza del cinema in tutto il bisecato pIECE di tessuto, quindi premere delicatamente con un tampone di cotone asciutto.
  4. Film SURGILUX viene attivato utilizzando raggi infrarossi laser a diodi ad una regolazione di 120 mW. Poiché si tratta di un laser di classe III B, appropriate misure di sicurezza dovrebbero essere prese, compreso l'uso di occhiali di sicurezza adeguate per tutto il personale.
  5. Avvio in un angolo, irradiare la SURGILUX con un laser infrarosso fissato a 120 mW e una dimensione del punto del fascio di 1 mm di diametro. Passare il punto del fascio sulla pellicola verde ad una velocità di circa 1 mm al secondo. Ripetere il processo di irraggiamento altre due volte.

4. Forza della riparazione

  1. Attentamente fissare le estremità del tessuto nei morsetti di un apparecchio di controllo di trazione. Stiamo usando un Instron Mini55 sistema con una cella di carico di 50 Newton. Il carico massimo, resistenza alla trazione e allungamento a rottura sono stati calcolati utilizzando Bluehill software (USA). Mezzi di almeno 10 campioni sono stati determinati (n = 10).
  2. Prendete il 'gioco'e poi separare i pezzi di tessuto ad una velocità di 1 mm al secondo, fino a quando i due pezzi di tessuto tenuti insieme dal nastro SURGILUX separata completamente.

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Representative Results

Centrifugazione conduce ad una soluzione trasparente verde, che aumenta la viscosità dopo conservazione a 4-6 ° C. Dopo riposo per 3 settimane, la soluzione verde è convertito in una pellicola trasparente SURGILUX verde di circa 20 micron e, come dimostrato nel video, è facilmente flessibile.

Su irraggiamento con il laser, i legami SURGILUX pellicola al tessuto. Ciò può essere osservato i bordi del film in cui il tessuto sembra contrarsi come il fascio laser passa sopra il film (Figura 2). No carbonizzazione o l'ablazione del tessuto e film dovrebbe essere rispettato. La resistenza della giunzione SURGILUX al tessuto dovrebbe essere sufficiente per sollevare i pezzi di tessuto bisecato, e quando la resistenza alla trazione è misurata deve essere di circa 15 kPa per il test riportati qui.

Tabella 1
Tabella 1. </ Strong> Confronto delle proprietà di sistema proposto SURGILUX fibrina e disponibili in commercio e cianoacrilati adesivi chirurgici.

Figura 1
Figura 1 Illustrazione schematica della fabbricazione SURGILUX sottile pellicola adesiva e processo di attivazione,.. Corrispondente al testo del protocollo Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2
Figura 2 Fotografia (x20) la proiezione del film sottile SURGILUX dopo l'attivazione laser aderito al tessuto intestino dei bovini e 'contraente' nell'incisione tessuto (T A, T B:. Pezzi separati of tessuto, I: incisione, S: SURGILUX film).

Figura 3
Figura 3 Grafico che mostra i punti di forza di adesione dei tessuti per vari adesivi:. Chitosano e film SURGILUX applicati su tessuto, Tisseel (fibrina) e gel Histoacryl (cianoacrilato) applicati sul tessuto.

Figura 4
Figura 4 Scansione al microscopio elettronico (SEM) che illustrano le cellule collegate al film; SURGILUX. Linee cellulari umane (a) le cellule olfattive ensheathing x1.5k [], (b) fibroblasti stromali [x500], e cellule (c) del muscolo scheletrico staminali derivate satellitari [x1.7k]. Clicca qui per ingrandire la figura .


Figura 5. Grafico che mostra la variazione di spessore del film con l'aumentare del volume SURGILUX colata soluzione (ml) e una zona di colata continua (7,09 x 10 3 mm 2).

Figura 6
Figura 6. Scanning electron microfotografia (SEM) di film che mostra la presenza di "nippli" (SN) sporgenti dalla superficie (S).

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Discussion

Chitosano può essere ottenuto in una varietà di pesi molecolari e con diversi gradi di deactylation (DDA). Variazioni purezza chitosano può portare alla presenza di particelle nella soluzione SURGILUX; centrifugazione viene utilizzato per eliminare questi e dovrebbe risultare in una soluzione trasparente verde. Tuttavia, filtrazione può anche essere usato come un passo fabbricazione aggiunta o alternativa. Come per ogni lavorazione dei materiali, le variazioni, come ad esempio chitosano DDA e peso molecolare, hanno implicazioni per le fisico-chimiche, proprietà biologiche e materiali dei film SURGILUX conseguenti, compresa la forza del suo legame con il tessuto.

Il processo di fabbricazione per SURGILUX consente considerevoli variazioni. Ad esempio, le modifiche al rapporto tra volume della soluzione alla superficie di colata (ml: mm 2) può essere utilizzata per regolare lo spessore del film figura 5 mostra un aumento lineare dello spessore di film SURGILUX finali come il volume.di soluzione versata in una capsula di Petri è stata aumentata. Analogamente, modifiche della superficie di getto può essere utilizzato per modificare la morfologia della superficie del film. Figura 6 mostra la presenza di dimensioni micron "nippli" sulla superficie della pellicola SURGILUX. Tali tecniche templating può essere utilizzato per produrre diverse superfici per migliorare l'adesione dei tessuti, prevenire attaccamento cellulare microbica e il reinserimento del tessuto. 11 Inoltre, vari agenti biologicamente attivi possono essere incorporati nel processo di fabbricazione per produrre il film adesivo per la somministrazione di farmaci regionale. 10

La tabella 1 riassume i vantaggi di questo sistema SURGILUX sottile pellicola adesiva rispetto alla fibrina convenzionale e adesivi cianoacrilati. Mentre la forza di riparazione tissutale è minore di suture, SURGILUX evita i numerosi inconvenienti di questa tecnica tradizionale chiusura della ferita e le correnti favorite adesivi commerciali chirurgici.

La capacità di legame di SURGILUX vari tessuti collagene unite alla flessibilità del materiale suggeriscono il suo potenziale in laparoscopia, mentre la versatilità del processo di fabbricazione promuove il suo ulteriore sviluppo per applicazioni in ingegneria tissutale e medicina rigenerativa.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono un finanziamento della National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC # 1000674) per LJR Foster.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chitosan Sigma-Aldrich 448877
Indocyanine Green Sigma-Aldrich I2633 Also known as Cardiogreen
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099
Infra-red diode laser with fiber delivery. (808 nm, 120 mW, Beam core 200 μm) CNI Lasers Fc-808 Variable system up to 5 W power
Laser safety glasses CNI Lasers LS-G
Tensile testing apparatus Instron Pty Ltd 5542 50 N load cell

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References

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