Isolierung und biophysikalische Untersuchung der Cuticula

Biology
 

Summary

Oberirdischen Pflanzenteile werden durch die Kutikula, einem supramolekularen Biopolyester-Wachs Montage geschützt. Wir präsentieren Protokolle, um die selektive Entfernung von epi-und intracuticular Wachsen aus Tomatenfrucht Nagelhaut auf molekularer und Micro-Bereich durch Festkörper-NMR-und Rasterkraftmikroskopie, bzw. zu überwachen und die Vernetzung von technischen Kapazität kutikularen Biopolyester beurteilen.

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Chatterjee, S., Sarkar, S., Oktawiec, J., Mao, Z., Niitsoo, O., Stark, R. E. Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles. J. Vis. Exp. (61), e3529, doi:10.3791/3529 (2012).

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Abstract

Die Nagelhaut, eine hydrophobe Schutzschicht auf den oberirdischen Teilen von Landpflanzen, Funktionen als vielseitiger Schutzwall um verschiedene biotische und abiotische Stressfaktoren und regelt auch die Wassermenge aus der äußeren Umgebung. 1 A Biopolyester (Cutin) und langkettigen Fettsäuren ( Wachse) bilden den wichtigsten strukturellen Rahmen der Kutikula, die funktionelle Integrität der Kutikula ist abhängig von der äußeren 'epikutikulären' Schicht als auch die Mischung, bestehend aus dem Biopolymer und Cutin 'intracuticular' Wachse 2 Im Folgenden stellen wir ein umfassendes Protokoll zu beschreiben. Wachse erschöpfend Auszug aus kommerziellen Tomate (Solanum lycopersicum) Obst oder Nagelhaut zu epikutikulären und intracuticular Wachse sequenziell und selektiv zu entfernen, aus der Kutikula Composite. Verfahren nach Jetter und Schäffer (2001) wurde zum schrittweisen Extraktion epikutikulärer und intracuticular Wachse aus der Frucht Cuticula ausgebildet. 3,4 Bei dieser AnwendungProzess der sequentiellen Wachs entfernen, Solid-State-Kreuz-Polarisation Magic-Angle-Spinning (CPMAS) 13 C-NMR-Spektroskopie wurde parallel mit der Rasterkraftmikroskopie (AFM) verwendet und bietet auf molekularer Ebene strukturelle Profile der Schüttgüter durch Informationen über die ergänzt die mikro-Topographie und Rauheit der Oberflächen Kutikula. Um die Vernetzung der Fähigkeiten entwachste Nagelhaut aus kultivierten Wildtyp-und Single-Gen-Mutante Tomatenfrüchten auszuwerten, wurde MAS 13 C-NMR verwendet, um die relativen Anteile von Sauerstoff aliphatische (CHO und CH 2 O) chemischen Einheiten zu vergleichen.

Ausführliche Entparaffinieren durch schrittweise Soxhlet-Extraktion mit einer Reihe von Lösungsmitteln von unterschiedlicher Polarität bietet ein wirksames Mittel zur Wachs-Einheiten auf der hydrophoben Eigenschaften der aliphatischen und aromatischen Bestandteilen-Isolat, unter Beibehaltung der chemischen Struktur des Cutin Biopolyester. Die mechanische Gewinnung von epikutikulärer Wachse und Selective Entfernung von intracuticular Wachse, wenn sie von komplementären physikalischen Methoden überwacht, bietet eine beispiellose Mittel, um die Kutikula Anordnung zu untersuchen: Dieser Ansatz zeigt die supramolekulare Organisation und strukturelle Integration verschiedener Arten von Wachsen, die Architektur des Cutin-Wachsmatrix, und die chemische Zusammensetzung der einzelnen Bestandteile. Darüber hinaus enthüllt Solid-State-13 C-NMR Unterschiede in den relativen Zahlen von CHO und CH 2 O chemischen Einheiten für Wildtyp und Mutante roten reifen Tomaten Früchte. Die NMR-Techniken bieten außergewöhnliche Werkzeuge zur Fingerabdruck die molekulare Struktur der Kutikula Materialien, die unlöslichen, amorphen und chemisch heterogen sind. Als nicht-invasive-selektive Oberfläche bildgebendes Verfahren, AFM liefert ein effektives und direktes Mittel, um die strukturelle Organisation der Kutikula der Montage auf der nm-Längenskala um zu sondieren.

Protocol

1. Enzymatische Isolierung von Tomato Schuppenschicht 5

  1. Setzen Sie mehrere kommerzielle oder kultivierten Tomaten in eine Schüssel geben. Ziehen Sie die Haut von den Früchten in großen Teilen; entsorgen Sie den inneren Fruchtwand Gewebe. Waschen Sie die Tomaten-Skins mit VE-Wasser und bewahren sie unter Wasser in einem Becher.
  2. Herstellen einer 50 mM pH 4,0 Natriumacetatpuffer (bei ​​31 ° C), indem 1,22 g Natriumacetat-Trihydrat (M r. 136,08 g / mol) und 2,34 ml Eisessig (17,485 M) in einem Becherglas, Zugabe von 200 ml VE-Wasser, und dann den pH-Wert bis 4,0 bei 31 ° C Vorbereiten einer Mischung, die 4 ml Pektinase (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1 TCI America), 0,2 g Cellulase (EC 232.734.4; 1,3 Einheiten / mg Feststoff, Sigma Aldrich) und 13 mg NaN 3, und fügen Sie dann 196 ml Natriumacetat-Puffer auf die Enzym-Mischung zu 200 ml des fertigen Enzym-Cocktail zu erhalten. 5 vollständig einzutauchen den geschälten Tomaten Haut in der Enzym-Cocktail und inkubierenbei 31 ° C für 24 Stunden unter ständigem Schütteln (G24 Environmental Incubator Shaker, New Brunswick Scientific Co.).
  3. Sammeln Sie die Tomatenhäuten mit einem Küchensieb oder Büchner-Trichter und waschen Sie sie mit VE-Wasser. Danach legen Sie sie in einem Vakuumofen bei Raumtemperatur für eine Stunde. Schützen wir die getrockneten Tomaten Skins in einer verschlossenen Flasche etikettiert und für die anschließende Entparaffinierung Verfahren.

2. Ausgiebige Entwachsen durch Soxhlet-Extraktion 6

  1. Die Ausrüstung für die abschließende Entparaffinierung verwendet besteht aus einer Wärmequelle (Heizmantel und Variac Controller), Rundkolben für eine Lösungsmittel-Reservoir, Soxhlet, Sinter-oder Einweg-Glas Fingerhut Extraktionshülse, Antiprellvorrichtung Chips und einem Kondensator (siehe Abb. 1). Beachten Sie, dass der schmale Siphon Arm (Teile 6 und 7 in Abb. 1) sehr empfindlich und anfällig für Brüche ist, der vorsichtig behandelt werden.
  2. Setzen 0,5-1 g Tomate Haut (erhalten inSchritt 1.) in einem Mörser und mahlen die Probe zu einem groben Pulver mit einem Stößel, es sei denn die Proben für AFM-Messungen (Abschnitt 5) verwendet werden sollen. Füllen Sie ein Sinterglas-oder Einweg-Fingerhut etwa auf halber Strecke mit der Probe und mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig Platz an der Basis der Extraktionskolonne.
  3. Dann wird der Kühler und wickeln ihn in Alufolie. Erhitzen Methanol-Lösungsmittel (ACS-Qualität) in Gegenwart von einigen Antiprellsensor Chips bis zum Kochen unter Rückfluss gekocht und leicht an den Wänden des Kolbens. Decken Sie die Lösungsmittel-Reservoir sowohl mit Glaswolle und Alufolie. Überprüfen Sie den Prozess für eine Stunde, tritt Einstellung der Variac Spannung, so dass das Reservoir sammelt etwa einem Tropfen pro Sekunde und Absaugen im Soxhlet-Apparat, wenn der Fingerhut voll ist.
  4. Fahren Sie mit der Extraktion für 12 h, dann senken Sie den Heizmantel und lassen Sie das Gerät abkühlen. Entfernen der Haube und dem Reservoir als eine einzige Einheit, um das Lösungsmittel zu entsorgen. Verwenden Sie tweezeRS zu erhöhen Fingerhut bis knapp unter den Hals der Extraktionskolonne, abtropfen überschüssige Lösemittel aus, und platzieren Sie den Fingerhut auf einer sauberen Fläche. Kippen Sie die Extraktionskolonne zu ermöglichen Siphon in den Kolben unten. Ziehen Sie den Kolben und gießen Sie den Abfall in einen beschrifteten Abfallbehälter Lösungsmittel Behälter.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4 für aufeinanderfolgende Lösungsmittel von immer mehr abnahm Polarität, zB Chloroform und Hexan für 12 h in jedem Fall.
  6. Lassen Sie die Tomaten Cutin Probe im Inneren der Fingerhut, entweder durch Blasen eines Stickstoffgasstrom darüber oder indem man ihn in einem Vakuumofen bei Raumtemperatur trocknen. Schließlich messen die Masse der trockenen Probe und bewahren Sie sie bei Raumtemperatur in einem Schraubdeckel-Glas mit Parafilm verschlossen.

3. Selektive Isolierung von epikutikulären und Intracuticular Wachse 3,4

  1. Zuerst waschen ganze Tomaten (eine separate Charge von Tomaten von den in 1 beschrieben.) Mit destilliertem Wasser. Trocknen Sie sie mit papER Handtücher und Kimwipes und legen sie stammen nach unten auf ein Stück Alufolie.
  2. Malen Sie die ganze Tomaten mit 120% (w / w, Massenverhältnis) Gummiarabikum wässrigen Lösung in einer Top-Down-Mode und damit etwa eine Stunde für die Gummi Arabicum, um auf den Früchten die Haut trocknen, so dass ein dünner Film. Ziehen Sie diese Folie mit einer Pinzette vorsichtig ab, ohne Durchstechen der Haut Tomate. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal.
  3. Fügen Sie die Filme auf Fläschchen mit 1:1 (v / v) Chloroform-Wasser zugeben und 3 Minuten. Nach kräftigem Schütteln und Phasentrennung Pipette aus der Chloroform-Fraktionen und verdunsten sie in separaten Fläschchen aufgedeckt, so dass epikutikulären Wachs. Die Tomaten bleiben körperlich unversehrt. Man taucht sie in Chloroform für zwei Minuten bei Raumtemperatur und sammelt das intracuticular Wachs nach Verdampfen des Lösungsmittels. Nun, schälen Sie die Tomaten und behandeln sie enzymatisch (mit Cellulase und Pektinase in Natriumacetatpuffer) zu Cellulose und Pektin zu entfernen, bzw. (wie beschrieben in
  4. Wenn gewünscht, führen erschöpfend Entparaffinierung auf diesen enzymatisch isolierte Kutikeln durch Soxhlet-Extraktion (siehe Schritt 2), mit drei Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität (Methanol, Chloroform, bzw. Hexan).

4. Molekulare Charakterisierung von Tomatenfrucht Cutin durch Kreuzpolarisation Magic-Angle-Spinning Solid-State Nuclear Magnetic Resonance (CPMAS Festkörper-NMR) 6

  1. Platz 4-6 mg voll entwachste Tomate Nagelhaut (Zuschaltungen) in einem 1,6 mm Zirkonoxid fastMAS Rotor mit der vom Anbieter gelieferten Verpackung Werkzeug. (Entweder Boden entwachste Tomate Nagelhaut oder sehr kleine Stücke von teilweise entwachst Nagelhaut geeignet sind.) Stellen Sie sicher, dass die Probe gleichmäßig ist gepackt, aber nicht zu fest, im Rotor. Nach dem Anlegen der oberen Kappe, malen die Hälfte der Kappe mit einem schwarzen Filzstift-Tinten auf Messungen der Spin-Rate zu erleichtern.
  2. Passen Sie die Shim des NMR-Spektrometers für minimale spektrale Linienbreite auf halber Höhe einRunde Kalibrierung des Protons (1 H) und Kohlenstoff (13 C) 90 ° Impulsbreiten mit einem Standard-Verbindung, wie Adamantan.
  3. Mit Glycin oder Glutamin als Modell-Verbindungen, erhalten maximale Signalintensität durch die Optimierung aller Parameter (Hartmann-Hahn-Matching Leistungsstufen, 1 H - 13 C Kontaktzeit, heteronuklearen 1 H-Entkopplung Stärke) der Kreuzpolarisation Magic-Angle-Spinning (CPMAS) Experiment. Für Spektren bei einer 1 H-Frequenz von 600 MHz erworben empfohlenen Bedingungen sind 10 kHz oder 15 kHz dreht Frequenz, eine 3-Sekunden Verzögerung zwischen den Aufnahmen und SPINAL heteronuklearen Protonenentkopplung 7 bei einer magnetischen Feldstärke entspricht einer Frequenz von 185 kHz.
  4. Legen Sie die Cutin gepackten Rotor in die Sonde. Legen Sie dann die Sonde in den Magneten. Erhöhen Sie die Schleuderdrehzahl bis zu 10 kHz allmählich auf Probe für eine gute Verpackung und Rotor Stabilität zu überprüfen. Überprüfen Sie die Endspinnverfahren Stabilität des Rotors innerhalb± 20 Hz.
  5. Passen Sie den Tuning-und Matching-Kapazitäten der Sonde iterativ zu minimalen Leistung Reflexion sowohl 1 H und 13 C-NMR-Frequenzen zu erreichen. Stellen Sie den experimentellen Temperatur auf 25 ° C (oder Raumtemperatur).
  6. Starten Sie den voroptimierte CPMAS Experiment entsprechend der Hartmann-Hahn-Matching Zustand am 10 kHz Spinnen Frequenz bestimmt.
  7. Erwerben 4096 Transienten, Bedingung ist das Spektrum mit exponentiellen (Lorentz) Linienverbreiterung von 50-100 Hz, und führen Sie eine Fourier-Transformation, eine NMR-Spektrum von Signalintensität vs chemischen Abschirmung (ppm) zu generieren.
  8. Verweis der 13 C-chemischen Verschiebungen von außen mit Adamantan Satz bei 38,4 ppm (-CH 2 - Gruppe) 8 als Standard.
  9. Erhöhen der Rotorspinnmaschine Frequenz 15 kHz und wiederholen Sie die CPMAS (Schritte von 4,6 bis 4,8) entsprechend der Hartmann-Hahn-Anpassungsbedingung an diesem letzteren dreht Frequenz bestimmt.
  10. Repebei den Experimenten CPMAS (Schritte von 4,1 bis 4,9) mit natürlichen (wachsartige) und teilweise entwachste Obst Nagelhaut Proben.

5. Probing the Tomato Cuticle Oberfläche mit einem Rasterkraftmikroskop (Digital Instruments Nanoscope IIIa; Verfahren variiert leicht unter den Mikroskopen) 6

  1. Schalten Sie den Rastersondenmikroskop (SPM) (Abb. 2) und stellen Sie sicher, dass das Mikroskop-Modus-Schalter, um den Kontakt Atomic Force Microscopy (AFM)-Modus eingestellt ist.
  2. Manuelles erhöhen SPM Kopf durch Drehen seiner zwei frei einstellbaren vorderen Knöpfe. Nehmen Sie das AFM tipholder aus dem SPM Kopf durch Drehen der Klemmschraube an der Rückseite des Kopfes.
  3. Verwenden Sie eine Pinzette, um die vorhandene AFM-Cantilever von der tipholder zu entfernen, dann schnappen Sie sich einen neuen sorgfältig Siliziumnitrid Cantilever (AFM) aus der Verpackung, und installieren Sie sie in die Stelle der alten Ausleger. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop zu überprüfen, ob die neu installierte AFM-Cantilever nicht zerbrochen ist.
  4. Bringen the Tomaten Cuticula Probe (ein Abschnitt teilweise entwachst Tomaten Cuticula ~ 10 mm × 10 mm) auf eine Scheibe aus Edelstahl (Probe Puck) mit doppelseitigem Klebeband. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop zu überprüfen, ob die Cuticula Oberfläche eben und glatt nach der Platzierung der Probe auf den Puck bleibt.
  5. Setzen Sie den Puck mit der Tomate Nagelhaut Probe auf die magnetische Region an der Spitze des SPM-Scanner.
  6. Stellen Sie die beiden vorderen Schrauben manuelle Einstellung des Scanners hohen indem Sie die Knöpfe, stellen Sie den Motor wieder Stellschraube auf etwa dem gleichen Niveau wie die anderen beiden vorderen Schrauben. Stellen Sie sicher, dass alle drei Schrauben gesetzt sind hoch genug, um nicht zu unterbrechen die AFM-Spitze beim Aufsetzen des tipholder in das SPM Kopf.
  7. Setzen Sie die tipholder in das SPM Kopf und befestigen Sie ihn durch Anziehen der Klemmschraube an der Rückseite des Kopfes.
  8. Nach dem Einschalten des Lasers, richten Sie den Laserpunkt auf der AFM-Cantilever über die zentrale (y) und rechts (x) Laser-Einstellknöpfe auf der Oberseite des Kopfes.Überwachen des reflektierten Laserstrahls auf ein Blatt Papier, um den Laserpunkt genau am Ende des Kraftsensors positionieren.
  9. Die Position des beweglichen Spiegels iterativ unter Verwendung der Photodetektor Einstellknöpfe auf den maximalen Signalpegel (SUM-Signal) zu erreichen, damit sichergestellt wird, dass der reflektierte Laserstrahl wird gleichmäßig durch die vier Quadranten der Photodetektor empfangen.
  10. Senken Sie die AFM-Spitze durch Zurückziehen der manuellen Einstellung vorderen Schrauben und den motorisierten zurück Stellschraube des SPM Scanner, optisch überwacht das Vorgehen der AFM-Spitze in Richtung der Probenoberfläche mit einem inversen Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass alle drei Schrauben auf dem gleichen Niveau sind, um Artefakte aus Abbildung eines gekippten Probe zu vermeiden. Bringen Sie die Spitze an die Probe, aber nicht so nahe, dass die Spitze berührt oder durchbricht der Probenoberfläche.
  11. An dieser Stelle reflektiert das Laserlicht aus der AFM-Cantilever wird abprallen den beweglichen Spiegel auf den Photodetektor. Für die Kontakt-AFM-Modus mit einem Silikoncon-Nitrid-AFM-Spitze, Stellen Sie das Ausgangssignal (Vertical Deflection) Spannung bis -2 V für eine 0 V Sollwert und der DIFF-Signal (vertikal / horizontal Unterschied) auf 0 V durch Einstellen der Position des Spiegels.
  12. Mit dem Nanoscope Software, auf dem Mikroskop-Symbol klicken und wählen Sie das entsprechende Profil (Kontakt Modus AFM).
  13. Mit der "Scan-Steuerungen-Einstellungen", stellen Sie die Abtastrate und die Scan-Format z. B. 10 Mikron Scan-Format und 2 Hz Abtastrate.
  14. Lassen Sie die AFM-Spitze zur Probenoberfläche durch Klicken auf die Spitze eingreifen-Symbol zu engagieren. Durch die Steuerung der motorisierten hintere Schraube der SPM-Basis, wird das Programm jetzt zu senken, bis sie die Spitze der Probenoberfläche einrastet. Der Scan-Vorgang beginnt automatisch, sobald die Spitze erfolgreich engagiert hat.
  15. Überwachen Sie den Scan-Vorgang mit den beiden Bild-Modi und Umfang der Software, Anpassung der Parameter wie Sollwert, integralen Verstärkung, Proportionalverstärkung, Scan-Format, Abtastrate, Linien und Muster / Linie iterativ, um die höchste zu erreichenauflösende Bilder. Starten Sie den Scanvorgang mit einem großen Sortiment z-Achse (Daten-Skala); dann vorsichtig reduzieren die Daten Skalenwert zu den besten Kontrast von Oberflächenstrukturen auf das Bild zu beobachten. Minimieren des Auftretens von weißen Bereichen in dem gescannten Bild, so dass die Höhe der Oberflächenmerkmale die verfügbare Z-Achse Bereich überschreitet anzuzeigen.
  16. Nehmen Sie das Bild, um die Daten-Datei zu speichern, dann bearbeiten Sie die Daten mit Abflachung Funktionen zur Bild-Artefakte aufgrund der vertikalen (Z)-Scanner Drift-, Bild-Bögen und vertikalen Versatz zwischen Scan-Linien zu entfernen; 9 Schließlich berechnen die durchschnittliche Rauheit. Nach dem Speichern der Daten, schieben Sie der AFM-Spitze durch die Umkehr der Wirkung des Computer-gesteuerten Motor Schraube, die verwendet werden, um ihm aufzunehmen. Die Bildverarbeitung kann im Offline-Modus Bildanalyse und / oder durchgeführt werden, über einen anderen Computer.
  17. Verwenden Sie die vorderen Unterseite grau Metall-Knöpfe des Düsenstock um die x-und y-Positionen der Scan-Bereich zu ändern, dann wiederholen Sie die Messung an fünf Standorten Probegen zu prüfen, Reproduzierbarkeit und ersetzt den AFM-Cantilever, wenn die Bildqualität verschlechtert.

6. Repräsentative Ergebnisse

Chemische Verschiebung Analyse der CPMAS 13 C-NMR-Spektren (Abb. 3) identifiziert die wichtigsten funktionellen Gruppen in der erschöpfend entwachste Tomate Kutikula (Cutin). Die wichtigsten Kohlenstoff-Einheiten in der Cutin Biopolyester wurde festgestellt, dass langkettige Aliphaten (0-45 ppm), mit Sauerstoff angereichert Aliphaten (45 bis 110 ppm), mehrfach verklebt und Aromaten (110-160 ppm) und Carbonyle (160 bis 220 sein ppm). Die mit Sauerstoff angereicherten Alkylgruppen (CHO + CH 2 O) spielen eine wichtige Rolle bei der Festlegung kovalente Verbindungen zwischen den monomeren Einheiten der Cutin Biopolymer, wodurch die molekulare Architektur des Cutin Matrix. Unterschiede in der relativen Peak-Flächen im spektralen Bereich zwischen 45 und 100 ppm beobachtet nahe, dass die Mutante Cutin eine relativ große Menge der Querverbindung bildenden CHO structura hat l-Einheiten im Vergleich zu den Wildtyp-Cutin; sorgfältige quantitative Messungen durch direkte Polarisation (DPMAS) NMR-Methoden 5 unterstützen diese Folgerung (Daten nicht gezeigt).

CPMAS 13 C-NMR-Spektren zeigten auch eine schrittweise abnehmenden Wachs-Peak bei 31 ppm (Abb. 4), welche die sequenzielle Entfernung von epi-und intracuticular Wachse aus der Cutin-Wachs-Verbund unter Beibehaltung der wichtigsten chemischen Architektur der Cutin Biopolymer. Parallel AFM-Bild-Analyse (Abb. 5) ergab, Unregelmäßigkeiten der Oberfläche durch die schrittweise Gewinnung von epi-und intracuticular Wachse aus der Frucht Nagelhaut, was bedeutet, Veränderungen in der Organisation der Kutikula der Montage.

1
. Abbildung 1 Soxhlet-Apparat (Bild Quelle: Wikipedia).

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Abbildung 2. A) Rastersondenmikroskop. B) SPM Kopf (in Anlehnung an die AFM-Trainingshandbuch von Digital Instruments zur Verfügung gestellt).

Abbildung 3
Abbildung 3. 150 MHz CPMAS 13 C-NMR-Spektren von erschöpfend entwachst roten reifen Tomaten Obst Nagelhaut (Zuschaltungen) von Wildtyp-(M82) und Mutante (CM15) zeigen Resonanzen mit chemischen Verschiebungen entsprechend den funktionellen Gruppen eines vernetzten Hydroxyfettsäure Polyestermasse und auch einige mehrfach gebundenen Einheiten. Alle Spektren wurden mit einer 10 kHz-Frequenz Spinnen erworben.

Abbildung 4
Abbildung 4. 150 MHz 13 CCPMAS NMR-Spektren von kommerziellen roten reifen Tomaten Obst Nagelhaut zeigen Veränderungen der Zusammensetzung auf sequenzielle Entfernung epikutikulären intracuticular und Wachse von Gummi Arabicum mechanische Extraktion und einer two-Minuten-Chloroform-Dip, beziehungsweise. Alle Spektren wurden mit einer 15 kHz-Frequenz Spinnen erworben.

Abbildung 5
Abbildung 5. AFM-Aufnahmen und Rauheit Schätzungen für die teilweise entwachst kommerzielle Tomate Schuppenschicht in Abbildung 4 nach der stufenweise Abbau der epikutikulären (links) und intracuticular (rechts) Wachse beschrieben.

Discussion

Die hierin beschriebenen Protokollen für detaillierte molekulare und mikroskaligen Charakterisierung eines komplexen hartnäckigen Pflanzenmaterial zu ermöglichen, ohne dass destruktive chemischen Abbau. Um die Vermischung der Cutin Biopolyester mit verschiedenen Lipide (Wachse), die die Organisationsstruktur der Kutikula der Montage, 10 haben wir durchgeführt und überwacht werden Verfahren zur selektiven Entfernung von epikutikulären intracuticular und Wachse aus der heterogenen Mischung kutikularen kontrollieren zu untersuchen. Solid-State-13 C-NMR wurde zur Gewinnung von Wachs molekularen Komponenten zu messen, und Rasterkraftmikroskopie diente dazu, die gleichzeitige Veränderungen in der Oberflächenrauheit zu untersuchen. 6,11 Um die Vernetzung der Fähigkeiten Zuschaltungen aus kultivierten Wildtyp-und Single-Gen vergleichen Mutant Tomatenfrüchten wurde Solid-State-13 C-NMR auch genutzt, um die relativen Zahlen von CHO und CH 2 O chemischen Einheiten zu schätzen.

Eine Reihe von Design-Merkmals dieses Protokoll zeichnen. Als das Wachs Materialien umfassen eine Vielzahl von Lipiden, die Frucht Behandlung Kutikula mit einer Reihe von Lösungsmitteln mit unterschiedlichen Polaritäten ist wichtig, abschließend Entparaffinieren zu erreichen. Darüber hinaus können Entwachsen von 8 Stunden bis 24 Stunden, je nach der Art der Cuticula Proben variieren. Um epikutikulärer Wachse konsequent Auszug aus dem intakten Frucht Kutikula, ist es zwingend notwendig, um die Klebstoffbeschichtung gleichmäßig auf der Oberfläche.

Solid-State-CPMAS 13 C NMR-12 ist eine schnelle qualitative Methode zur Identifizierung verschiedener struktureller Komponenten des sehr heterogenen und unlöslichen pflanzlichen Biopolymeren unter Wahrung ihrer Muttersprache physikalischen Eigenschaften; 13 traditionelle Lösungs-NMR können auch verwendet werden, um die extrahierten Wachsmischungen zu charakterisieren. Wenn quantitative Abschätzung der funktionellen Gruppen ist für den intakten Pflanze Polymere, 5 High-Fidelity-Direkt-Polarisation Rotation im magischen Winkel (D gewünschtenPMAS) 13 C-NMR 5,14 ist als ergänzendes Verfahren verwendet werden. Genaue Quantifizierung der funktionellen Gruppen erfordert eine sorgfältige Optimierung der recycle mal, Anregungspuls Längen, und die Stärke der heteronuklearen Entkopplung. Der 15 heteronucleare Entkopplung für ein 1 H Feldstärke im Bereich von 50 kHz bis 185 kHz kann mit Hilfe des TPPM 16 oder eingestellt werden SPINAL 7 Methoden. Zusätzlich zu diesen Parametern, hängt die Empfindlichkeit der Messungen CPMAS auf dem Spin-Lock-Zeit und Hartmann-Hahn-Anpassungszustand. 15 In anstelle von herkömmlichen CPMAS, kann eine abgeschrägte Amplitude CP (RAMP-CP)-Technik implementiert werden, um das Kreuz zu maximieren -Polarisationseffizienz durch Variieren der Amplitude linear 1 H (~ 20-50%) oder tangential, während die Amplitude der Feldstärke 13 C konstant während der Spin-Lock-Periode (oder umgekehrt). 17,18 Durchführung der Messungen an CPMAS mindestens zwei verschiedene Rotor-Spinnerei Frequenzen ist zwingend notwendig, um Rotationsseitenbanden von den wichtigsten spektralen Spitzen zu unterscheiden.

Concurrent AFM-Messungen im Kontakt-Modus durchgeführt, ermöglichen die direkte Bildgebung der Kutikula Oberflächenbeschaffenheit mit hohen Scan-Geschwindigkeiten und eine hohe Auflösung, 19 zum Beispiel während der sequentiellen Entfernung der wachsartigen Bestandteile. Betriebssystem AFM im Tapping (berührungslos)-Modus kann als Alternative zur Charakterisierung von Oberflächen von empfindlichen "weichen" pflanzlichen Materialien verwendet werden, vermeiden mögliche Schäden durch seitliche (Scher-) Kräfte und Kratzen der Probenoberfläche. 5,20 In beiden Fällen , der Aufnahme von mehreren Bildern von der gleichen Stelle auf der Oberfläche dient dazu, jede Oberfläche Schäden durch "Probe-Oberflächen-Wechselwirkungen" im AFM-Messungen identifizieren. 6,21 Für eine optimale Reproduzierbarkeit, sollte AFM-Sonden mit Federkonstanten für weiche Oberflächen kutikularen sein verwendet, und die Konstanz der Temperatur und Luftfeuchtigkeit sollten beibehalten werden. 6,15,20 22,23 für die Verfolgung der Oberflächentopographie dieser exquisit komplexen makromolekularen Anordnungen. 1,2

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom US National Science Foundation Zuschüsse # MCB-0741914 und MCB-0843627 unterstützt; weitere infrastrukturelle Unterstützung wurde am City College von New York vom National Institutes of Health 2 G12 RR03060-26 aus dem National Center for Research Resources zur Verfügung gestellt. Wir bedanken uns für das JKC Rose Gruppe in der Cornell University Pflanzenbiologie Abteilung für die Bereitstellung von M82 (Wildtyp) und CM15 (Mutante) Tomate Nagelhaut. Wir danken Dr. Spyros Monastiriotis aus dem CCNY Chemical Engineering Gruppe von Prof. Alexander Couzis für seine großzügige Hilfe bei den AFM-Experimente. Wir danken Frau Lauren Gohara für grafische Gestaltung unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S8625-500G
Pectinase TCI America P0026 EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator
Cellulase Sigma-Aldrich C1184-100KU EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator
Glacial Acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-100G Extremely hazardous
Incubator/shaker New Brunswick Scientific Model No.G24 MFG No.M1036-000G
Vacuum Oven Precision Scientific 31566
Variac Controller
Sintered glass thimble (85 mm/25mm) VWR international 89056
Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) VWR international 28320
Methanol VWR international EMD-MX0485-7
Glass wool VWR international RK20789
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100
Tweezers VWR international 82027-452
Chloroform VWR international EM-CX1050-1
Hexane Fisher Scientific H302-4
Nitrogen gas
Parafilm VWR international 52858
Paper towels VWR international 89002-984
Kim wipes VWR international 21905-026
Gum arabic Sigma-Aldrich G9752
1.6 mm fastMAS zirconia rotor Varian Inc., Agilent
NMR spectrometer Varian Inc., Agilent standard bore magnet
Glycine Sigma-Aldrich 50046 Model compound for CPMAS
Glutamine Sigma-Aldrich 49419 Model compound for CPMAS
Adamantane Sigma-Aldrich 100277 To calibrate 90° pulse in NMR
Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) Digital Instruments
Nanoscope software Digital Instruments Version 5.30r3sr3 (2005)
AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) Veeco Instruments, Inc. Model NP-20
Light microscope Digital Instruments
Magnetic puck Digital Instruments
Double sided tape VWR international
Fruit Peeler
Büchner funnel VWR international 89038

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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