İzolasyon ve Meyve cuticles biyofiziksel Çalışması

Biology
 

Summary

Hava bitki organlarının kütikül, bir supramoleküler biopolyester-balmumu meclisi tarafından korunmaktadır. Biz katı hal NMR ve atomik kuvvet mikroskobu ile moleküler ve mikro ölçeklerde domates meyve tırnak etlerini gelen seçici olarak çıkarılmasına epi-ve intracuticular mumlar, sırasıyla izlemek ve mühendislik cuticular biopolyesters çapraz-bağlantı kapasitesi değerlendirmek için protokolleri sunuyoruz.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chatterjee, S., Sarkar, S., Oktawiec, J., Mao, Z., Niitsoo, O., Stark, R. E. Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles. J. Vis. Exp. (61), e3529, doi:10.3791/3529 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Manikür, karasal bitkilerin üstü kısımları bir hidrofobik koruyucu tabaka, çeşitli biyotik ve abiyotik streslere karşı çok yönlü bir savunma bariyeri gibi fonksiyonlar ve ayrıca dış ortamdan su akışını düzenler. 1 A biopolyester (kütin) ve uzun zincirli yağ asitleri ( mumlar) kütikül başlıca yapısal çerçeve oluştururlar;. cuticular tabakasının işlevsel bütünlüğü kütin biyopolimer ve 'intracuticular' mumlar 2 Burada oluşan karışımı, biz kapsamlı bir protokol tarif dış 'epikütikülar' katmanın yanı sıra bağlıdır ticari domates (Solanum lycopersicum) meyve tırnak etlerini etraflıca mumları çıkarmak için ya da kütikül kompozit arasında kademeli ve seçici epikütikülar ve intracuticular mumları çıkarmak için. Ve uygun su jetleri Schäffer (2001) yönteminin meyve kütikulasının gelen epikütikülar ve intracuticular mumların aşamalı çıkarılması için adapte edilmiştir. 3,4 izlemek içinsıralı balmumu çıkarılması, solid-state çapraz polarizasyon sihirli açı-eğirme süreci (CPMAS) 13 C NMR hakkında bilgi tamamlanmaktadır dökme malzemelerin moleküler düzeyde yapısal profiller sağlayan, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile paralel olarak kullanılmıştır mikro topografya ve cuticular yüzeylerin pürüzlülüğü. Ekilmiş vahşi tip ve tek-geni mutant domates meyveler mumu alınmış cuticles bir çapraz bağlama yeteneği değerlendirmek için, MAS 13C NMR oksijenli alifatik (CHO ve CH2 O) kimyasal yarımların nispi oranları karşılaştırmak için kullanıldı.

Kütin biopolyester kimyasal yapısı korurken polariteyi değişen çözücü, bir panel ile aşamalı Soxhlet ekstraksiyon ayrıntılı Mum eritme, bunların alifatik ve aromatik bileşenlerin hidrofobik özelliklerine göre balmumu yarımlar izole etmek için etkili bir yol sağlar. Epikütikülar mumlar ve sele mekanik ekstraksiyontamamlayıcı fiziksel yöntemler ile takip intracuticular mumların ctive kaldırılması, manikür montaj araştırmak için eşi benzeri görülmemiş bir araç sağlar: Bu yaklaşım supramoleküler organizasyon ve mumlar çeşitli yapısal entegrasyon, kütin-balmumu matris mimarisi ve kimyasal açığa her bir bileşenin bileşimi. Buna ek olarak, katı halde 13C NMR vahşi tip ve kırmızı olgun mutant domates meyve ve CHO CH2 O kimyasal yarımların nispi numaraları farklılıklar gösterir. NMR teknikleri parmak izi, çözünmeyen amorf ve kimyasal heterojen cuticular malzemelerin moleküler yapısı için olağanüstü araçlar sunuyoruz. Noninvaziv bir yüzey seçkin bir görüntüleme tekniği olarak, AFM nm-mikron uzunluğunda ölçekte cuticular montaj yapısal organizasyonu araştırmak için etkin ve doğrudan vasıta vermektedir.

Protocol

1. Domates Enzimatik İzolasyon 5 cuticles

  1. Bir kabın içinde birkaç ticari veya ekili domates yerleştirin. Büyük bölümlerde meyvelerden cilt soyma; iç perikarp doku atın. Deiyonize su ile domates derileri yıkayın ve bir bardak su altında onları korumak.
  2. 200 ml ekleyerek, sodyum asetat trihidrat, 1.22 g (M r. 136,08 g / mol) ve bir cam kapta 2,34 ml glasiye asetik asit (17,485 M) koyarak, bir 50 mM pH 4.0 sodyum asetat tampon (31 ° C de) hazırlanması 31 de 4.0 ila pH ayarlama sonra deiyonize su ve ° C. , Ve 13 mg NaN 3;, selülaz ve 0,2 g (1,3 birim / mg katı, Sigma Aldrich EC 232.734.4); pektinaz (10 U ml -1, TCI Amerika EC 3.2.1.15) 4 ml ihtiva eden bir karışım hazırlamak ve daha sonra nihai enzim kokteyli ile 200 ml elde etmek için enzim karışımına sodyum asetat tampon 196 ml ilave edilir. 5 tamamen enzim kokteyli içinde soyulmuş domates cilt batırmak ve inkübe31 ° sabit tokalaşma (G24 Çevre İnkübatör Çalkalayıcı; New Brunswick Scientific Co) ile 24 saat C.
  3. Bir mutfak süzgeç veya Büchner hunisi ve deiyonize su ile yıkayın kullanarak domates derileri toplayın. Bundan sonra, bir saat boyunca oda sıcaklığında bir vakumlu fırın içinde yerleştirin. Sonraki Mum eritme işlemleri için etiketli ve kapağı kapatılmış şişe içinde kurutulmuş domates derileri koruyun.

2. Soxhlet Ekstraksiyon 6 tarafından ayrıntılı Mum eritme

  1. Ayrıntılı Mum eritme için kullanılan ekipmanlar bir ısı kaynağı (ısıtma manto ve Varyak Kontrolü), bir çözücü rezervuar için yuvarlak dipli bir şişe, Soxhlet çıkarıcı, sinterlenmiş cam yüksük veya tek kullanımlık ekstraksiyon yüksük, anti-darbeleme cips ve bir kondansatör (bkz. Şekil oluşur. 1). Dar sifon kolu (parça Şekil 6 ve 7. 1) dikkatli kullanım gerektiren, çok hassas ve kırılmaya eğilimli olduğunu unutmayın.
  2. (Elde edilen domates cilt 0.5-1 gr koyun, bir havan içinde adım 1). ve numuneler AFM ölçümleri (Bölüm 5) kullanılmak üzere, bir sürece havaneli ile bir kaba toz öğütülmesine. Numune ile yaklaşık yarım bir sinterlenmiş cam veya tek yüksük doldurun ve ekstraksiyon sütunun dibinde dikkatlice yerleştirmek için cımbız kullanın.
  3. Kondansatör takın ve alüminyum folyo ile sarın. Birkaç anti-çarpma yongaları mevcudiyetinde metanol solvent (ACS derecesi) ısıtmak şişenin duvarları üzerine nazikçe kaynar ve reflü kadar. Cam yünü ve alüminyum folyo ile hem solvent rezervuar örtün. Yüksük dolduğunda Soxhlet aygıtı içinde rezervuar saniyede yaklaşık bir damla birikir, böylece Varyak gerilimi ayarlayarak ve sifon, bir saat süreci oluşur kontrol edin.
  4. , 12 saat çıkarma işlemi devam sonra ısıtma manto düşürüp aparat soğumasını bekleyin. Solvent kurtulmak için tek bir birim olarak aspiratör ve rezervuar çıkarın. Cımbız kullanınrs, sadece ekstraksiyon sütunun boyun altından yüksük yükseltmek ondan çözücü aşırı drenaj ve temiz bir yüzey üzerine yüksük yerleştirmek. Aşağıdaki balona sifon izin ekstraksiyon sütun eğin. Matara çıkarın ve etiketli bir atık solvent yuvasına atık dökün.
  5. Giderek azalan kutup, her durumda 12 saat örneğin, kloroform ve heksan arda çözücüler için adımları 2.3 ve 2.4 tekrarlayın.
  6. Domates kütin Örnek yüksük içinde, ya da bunun içinde azot gazı akımı üfleme ile veya oda sıcaklığında bir vakumlu fırın içinde yerleştirerek kurumasına izin verir. Son olarak, kuru numune kütlesinin ölçmek ve parafilm ile sızdırmaz bir vida-top kavanoz oda sıcaklığında depolamak.

3. Epikütikülar ve Intracuticular Mumlar 3,4 Seçici İzolasyon

  1. İlk olarak, distile su ile bütün domates (1 açıklananlardan domates ayrı bir toplu iş.) Yıkayın. Pap ile kurulayıner havlu ve Kimwipes, yer ve bunların alüminyum folyo parçasının üzerine aşağı kaynaklanıyor.
  2. % 120 (w / w, kütle oranı) moda yukarıdan aşağı gum arabic sulu çözeltisi ile bütün domates Boya ve ince bir film tabakası bırakarak Meyvelerin üzerinde kurumaya arap zamkı, için yaklaşık bir saat bekleyin. Delmeyiniz domates cilt için dikkatli olmak, cımbız kullanarak bu filmi çıkarın. Bir kez daha aynı işlemi tekrarlayın.
  3. Üç dakika süreyle 01:01 (v / v) kloroform-su ve karışım ihtiva eden şişeler için film ekleyin. Kuvvetli çalkalama ve faz ayrılması sonra, kloroform kesirler dışarı Pipeti ve epikütikülar mum bırakarak, ayrı açığa flakonlarda onları buharlaşır. Domates fiziksel kalacaktır. , Oda sıcaklığında iki dakika süreyle kloroform içine daldırma ve çözücü buharlaştırılır sonra intracuticular balmumu toplamak. Şimdi, domates kabuğu ve (olarak açıklanan sırasıyla, selüloz ve pektin kaldırmak için (sodyum asetat tamponunda selülaz ve pektinaz ile) enzimatik muamele
  4. Eğer istenirse, değişen polariteyi üç çözücüler (sırasıyla, metanol, kloroform, ve heksan) kullanılarak, (adım 2'ye bakınız) Soxhlet ekstraksiyonu ile bu enzimatik olarak izole cuticles üzerine ayrıntılı Mum eritme gerçekleştirmek.

4. Çapraz polarizasyon tarafından Domates Meyve Kütin Moleküler Karakterizasyonu Magic açılı İplik Solid state Nükleer Manyetik Rezonans (CPMAS SSNMR) 6

  1. Satıcı tarafından sağlanan ambalaj aracını kullanarak bir 1.6 mm fastMAS zirkonyum rotor tam mumu alınmış domates tırnak etlerini (cutins) Yeri 4-6 mg. (Yer mumu alınmış domates tırnak etlerini ya da kısmen mumu alınmış tırnak etlerini çok küçük parçalara Ya uygundur.) Rotor, çok sıkı olmayacak örnek eşit dolu olduğundan emin olun, ama. Üst kapağı üzerine konulduktan sonra, spin oranı ölçümleri kolaylaştırmak için siyah mürekkep marker kalem ile kap yarısını boyayın.
  2. Yarım yükseklikte minimum spektral çizgi genişliği için NMR spektrometresinin layneri ayarlayınnd proton (1 H) kalibre ve karbon (13 C) 90 gibi adamantan gibi standart bir bileşik kullanılarak ° puls genişliklerinin.
  3. Modeli bileşikler olarak glisin veya glutamin kullanarak, (Hartmann-Hahn eşleşen güç seviyeleri, 1 H - 13 C temas süresi, heteronükleer 1 H dekuplaj gücü) tüm parametreleri optimize ederek maksimum sinyal yoğunluğu elde çapraz polarizasyon sihirli açı eğirme (CPMAS) deney. , 600 MHz 1 H frekansta elde spektrası için tavsiye edilen koşullarda 10 kHz veya 15 kHz iplik frekansı, satın alma arasında bir 3-sec gecikmesi ve 185 kHz arasında bir frekans eşdeğer bir manyetik alan kuvveti azından 7 ayırımı SPİNAL heteronükleer proton içerir.
  4. Prob içine kütin dolu rotor yerleştirin. Sonra, mıknatıs içine prob yerleştirin. Yavaş yavaş iyi bir örnek ambalaj ve rotor stabilite kontrol etmek için 10 kHz iplik hızını arttırın. Rotor nihai eğirme istikrar içinde doğrulayın± 20 Hz.
  5. Ayar ayarlayın ve probu kapasitörler eşleşen iteratif 1 H ve 13 C NMR frekansları hem de minimum güç yansıma elde etmek. 25 ila deney sıcaklığı ayarlanır ° C (veya oda sıcaklığı).
  6. 10 kHz iplik frekansta tespit Hartmann-Hahn eşleşen koşuluna karşılık gelen önceden optimize CPMAS deneyi başlar.
  7. Üstel (Lorentz) hattı 50-100 Hz genişletilmesi ile 4096 geçici, durumu spektrum edinebilir ve bir Fourier sinyal yoğunluğu vs kimyasal koruyucu (ppm) bir NMR spektrumu oluşturmak için dönüşüm yapmak.
  8. Standart olarak 8 - 13 C kimyasal dışarıdan 38,4 ppm (-CH grup 2) adamantandır seti kullanarak kaymaları Başvuru.
  9. 15 kHz open end iplik sıklığını artırmak ve bu ikinci iplik sıklığı tespit Hartmann-Hahn eşleşen koşuluna karşılık gelen CPMAS ölçümü (adımları 4,6-4,8) tekrarlayın.
  10. Repedoğal (balmumu) ve kısmen mumu alınmış meyve kütikül örnekleri ile CPMAS deneyler (adım 4,1-4,9) at.

5.. Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Domates Tırnak Yüzey sondalama (Dijital Aletler NanoScope IIIa; prosedürleri mikroskoplar arasında biraz değişir) 6

  1. Taramalı prob mikroskobu (SPM) açın (Şekil 2) ve mikroskop moduna geçiş anahtarı kontak Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) moduna ayarlı olduğundan emin olun.
  2. Elle iki kullanıcı-ayarlanabilir ön düğmeleri çevirerek SPM başını yükseltmek. Başın arka kısmındaki sıkma vidasını SPM başından AFM tipholder ayırın.
  3. Tipholder varolan AFM konsol kaldırmak için cımbız kullanın, sonra dikkatlice ambalajından yeni bir silisyum nitrür konsol (AFM prob) yakala ve eski konsol yerine takın. Yeni yüklenen AFM konsol bozuk olmadığını doğrulamak için bir ışık mikroskobu kullanın.
  4. Inci takıne domates kütikül örnek çift taraflı bant ile bir paslanmaz çelik disk (örnek puck) ile (kısmen mumu alınmış domates kütikül bir bölümü ~ 10 mm x 10 mm). Kütikül yüzeyi düz ve cin üzerindeki numunenin yerleştirilmesinden sonra pürüzsüz kalır doğrulamak için bir ışık mikroskobu kullanın.
  5. SPM tarayıcının üstündeki manyetik bölgenin üzerine domates kütikül numune ile disk yerleştirin.
  6. Düğmeleri çevirerek yüksek tarayıcının ön iki manuel ayar vidası ayarlayın; diğer iki ön vida yaklaşık aynı seviyeye motorlu arka ayar vidası ayarlanır. Her üç vida SPM kafasına tipholder yerleştirirken AFM ucu bozulmaması için yeterince yüksek ayarlandığından emin olun.
  7. SPM kafasına tipholder tekrar takın ve başın arka kısmındaki sıkma vidasını sıkarak sabitleyin.
  8. Lazer açtıktan sonra, kafasının üstüne merkezi (y) ve sağ (x) lazer ayar dügmesini kullanarak AFM konsol üzerinde lazer nokta hizalayın.Tam AFM konsol sonunda lazer nokta konumlandırmak için bir kağıt parçası üzerine yansıtılan lazer ışını izleyin.
  9. Hareketli ayna iteratif Böylece yansıyan lazer ışını Fotodedektör dört kadranda tarafından eşit alınmadığını sağlayarak, maksimum sinyal (SUM sinyali) ulaşmak için fotodetektör ayar dügmesini kullanarak pozisyonunu ayarlayın.
  10. Görsel bir inverted mikroskop ile örnek yüzeyine doğru AFM ucunun yaklaşım izlenmesi, geri çekme manuel ayar ön vida ile AFM ucu ve SPM tarayıcının motorlu arka ayar vidası indirin. Her üç vida görüntüleme eğik bir örnek eserler önlemek için aynı seviyede olduğundan emin olun. Örnek doğru ucu getir, ama çok yakın değil ki ucu dokunuyor veya numune yüzeyi boyunca tatili.
  11. Bu noktada, lazer ışığı AFM konsol fotodetektör için hareketli ayna sıçrama olacak yansıyan. Bir silikonlu yağla temas AFM modu içincon nitrür AFM ucu, bir 0 V istenen ve DIFF Sinyal (yatay / dikey fark), ayna konumunu ayarlayarak 0 V için -2 V ÇIKIŞ sinyali (Dikey Saptırma) gerilimini ayarlayabilirsiniz.
  12. NanoScope yazılımı kullanarak, mikroskop ikonuna tıklayın ve uygun profili (İletişim modu AFM) seçin.
  13. "Tarama Kontrolleri Ayarlar" panelini kullanarak, tarama hızı ve tarama boyutu örneğin, 10 mikron tarama boyutu ve 2 Hz tarama hızı ayarlayın.
  14. AFM ucu meşgul ucu simgesini tıklatarak numune yüzeyi yapmaya izin verin. Bu numune yüzeyine kavrayana kadar SPM baz motorlu arka vida kontrol ederek, programı artık ucu düşürecektir. Ucu başarıyla yapan sonra tarama işlemi otomatik olarak başlayacaktır.
  15. Iteratif en yüksek ulaşmak için bu set, integral kazanç, oransal kazanç, tarama boyutu, tarama hızı, çizgiler ve örnekler / hat gibi parametreleri ayarlayarak, yazılım görüntü ve kapsamı modları kullanarak tarama sürecini izlemekçözünürlüklü görüntüler. Büyük bir z ekseni aralığı (veri ölçek) ile tarama işlemini başlatın, sonra dikkatlice görüntü üzerinde yüzey özelliklerinden en iyi kontrast gözlemlemek için veri ölçek değerini düşürün. Yüzey özellikleri yüksekliği kullanılabilir z-ekseni aralığı aşan göstermektedir taranmış görüntü, beyaz alanların oluşumunu en aza indirmek.
  16. Veri dosyasını kaydetmek için görüntü yakalamak, sonra tarama çizgileri arasındaki ofset düşey (Z) tarayıcı sürüklenme, görüntü fiyonklar ve dikey nedeniyle resim gölgeleri kaldırmak için düzleşme fonksiyonlarını kullanarak verileri işlemek; 9 nihayet ortalama pürüzlülüğü hesaplayabilirsiniz. Verilerin kaydedilmesi sonra, angaje için kullanılan, bilgisayar kontrollü motor vida işlemin geri tarafından AFM ucu geri. Görüntü işleme isimli görüntü analiz modu ve / yapılan veya farklı bir bilgisayar kullanıyor olabilirsiniz.
  17. Tarama alanının x ve y pozisyonlarını değiştirmek için ucu sahibinin ön alt gri metal düğmeler kullanın; sonra beş numune loca az ölçümü tekrarlayınızsınırların dışına görüntü kalitesi bozulur eğer AFM konsol yerine, tekrarlanabilirlik kontrol etmek.

6. Temsilcisi Sonuçlar

CPMAS 13 C NMR kimyasal kayma analizi (Şekil 3) etraflıca mumu alınmış domates kütikül (kütin) bulunan temel fonksiyonel gruplar belirlendi. Kütin biopolyester kilit karbon yarımlar uzun zincirli alifatik (0-45 ppm), oksijenli alifatik (45-110 ppm), çarpma-yapıştırılmış ve aromatik (110-160 ppm) ve karboniller (160-220 bulunmuştur ppm). Oksijenli alkil yarımları (CHO + CH2 O) böylece kütin matrisin moleküler mimarisini oluşturan, kütin biopolimer arasında monomer birimleri arasında kovalan bağlantı kuran önemli bir rol oynamaktadır. 45 ve 100 ppm arasında spektral bölgede gözlenen göreli pik alanları farklılıklar mutant kütin çapraz bağ oluşturan CHO structura nispeten büyük oranda sahip olduğunu düşündürmektedir l kısımlara göre yabani tip kütin; doğrudan polarizasyon (DPMAS) NMR 5 yöntemlerini kullanırken dikkatli ölçümlerle bu çıkarsama destekleyen (veriler gösterilmemiştir).

CPMAS 13C NMR spektrası, aynı zamanda kütin biopolimer başlıca kimyasal mimarisini koruyarak kütin-balmumu kompozit gelen epi-ve intracuticular mumların sıralı çıkarılması gösteren, 31 ppm (Şekil 4) aşamalı olarak azalan bir balmumu tepe değeri göstermiştir. Paralel AFM görüntü analizi (Şekil 5) cuticular montaj organizasyonunda değişiklikler gösteren, meyve kütikül gelen epi-ve intracuticular mumların kademeli ekstraksiyon nedeniyle yüzey düzensizliklerini tespit edildi.

Şekil 1
. Şekil 1 Soxhlet çıkartma (görüntü kaynak: Wikipedia).

"/>
Şekil 2. A) Tarama prob mikroskop. B) SPM kafa (Dijital Instruments tarafından sağlanan AFM eğitim el kitabı uyarlanmıştır).

Şekil 3
Şekil 3. Yaban-tip (M82) ve mutan etraflıca mumu alınmış kırmızı olgun domates meyve cuticles (cutins), 150 MHz CPMAS 13C NMR spektrumu (CM15) kimyasal rezonans gösteren bir çapraz bağlı hydroxyfatty asitin işlevsel gruplara karşılık gelen kaydırır -polyester bazlı ve ayrıca bazı çarpma gümrüklü kısımları. Tüm spektrumları 10 kHz frekans ile iplik elde edildi.

Şekil 4
Şekil 4. Ticari kırmızı olgun domates meyve tırnak etlerini 150 MHz 13 CCPMAS NMR sıralı Arap zamkı mekanik ekstraksiyon epikütikülar ve intracuticular mumlar çıkarılması ve bir tw üzerine kompozisyon değişikliklere rastlanabiliro dakika kloroform daldırma, sırasıyla. Tüm spektrumları 15 kHz frekans iplik ile elde edildi.

Şekil 5,
Şekil 5. AFM görüntüleri ve kısmen mumu alınmış ticari domates pürüzlülüğü tahminleri epikütikülar (solda) ve intracuticular (sağda) mumların aşamalı çıkarılmasından sonra Şekil 4'te açıklanan cuticles.

Discussion

Protokoller Burada yıkıcı kimyasal dökümü için gerek kalmadan karmaşık dirençli bitki materyali ayrıntılı moleküler ve mikro karakterizasyonu için izin nitelendirdi. Biz heterojen cuticular karışımından epikütikülar ve intracuticular mumların seçici çıkarılması için prosedürler yürütülen ve izlenen cuticular montaj yapısal organizasyon, 10 kontrol, çeşitli lipidler (balmumu) ile kütin biopolyester harmanlama araştırmak. Solid-state 13 C NMR ekili wild-tip ve tek-gen cutins arasında çapraz bağlantı yeteneklerini karşılaştırmak için balmumu moleküler bileşenleri çıkarıldığı ölçmek için kullanılan, ve atomik kuvvet mikroskobu yüzey pürüzlülüğü eş zamanlı değişiklikleri incelemek için görev yaptı. 6,11 oldu mutant domates meyveleri, katı hal 13C NMR da CHO ve CH2 O kimyasal yarımların nispi numaraları tahmin etmek için kullanıldı.

Tasarım özelliği bir diziBu protokol s dikkat çekicidir. Balmumu malzemeleri farklı kutuplar sahip solventler bir dizi meyve kütikül tedavisinde, lipidler geniş bir kapsayacak şekilde ayrıntılı Mum eritme elde etmek esastır. Buna ek olarak, Mum eritme süresi 8 saat arasında kütikula örnekleri doğasına bağlı olarak, 24 saate kadar değişmektedir. Sağlam meyve kütikül gelen sürekli epikütikülar mumlar ayıklamak için, yüzeye eşit yapışkan kaplama uygulamak şarttır.

Solid-state CPMAS 13 C NMR 12 kendi doğal fiziksel özelliklerini koruyarak oldukça heterojen ve çözünmez bitki biyopolimerlerin çeşitli yapısal bileşenlerinin belirlenmesi için hızlı bir kalitatif yöntemdir; 13 geleneksel çözüm-devlet NMR da ayıklanan balmumu karışımları karakterize etmek için kullanılabilir. Fonksiyonel grupların nicel tahmin bozulmamış bitki polimerler, 5 yüksek kaliteli doğrudan polarizasyon sihirli açı iplik (D isteniyorsaPMAS) 13C NMR 5,14 tamamlayıcı bir yöntem olarak kullanılabilir. Fonksiyonel grupların doğru kantitatif geri dönüşüm süreleri, uyarma darbe uzunlukları ve heteronükleer çözülmenin gücü dikkatli optimizasyonu gerektirir. 15 heteronükleer dekuplaj TPPM 16 veya 50 kHz ile 185 kHz arasında değişen 1 H alan şiddeti için ayarlanabilir SPİNAL 7 metodolojileri. Bu parametrelere ek olarak, CPMAS ölçümlerin hassasiyeti spin-kilit zaman ve Hartmann-Hahn eşleşen durumuna bağlıdır. Geleneksel CPMAS yerine 15, rampalı bir amplitüdlü CP (RAMPA-CP) tekniği çapraz üst düzeye çıkarmak için uygulanabilir spin-kilit süresi (veya tersi) sırasında sabit 13 C alan gücü genliği tutarken lineer 1 H genliği değişen (~% 20-50) veya teğet by-polarizasyon verimliliği. az CPMAS ölçümleri yapılması 17,18 İki farklı ro minimumtor-iplik frekansları ana spektral tepelerinden iplik sidebands ayırt etmek şarttır.

Temas şeklinde yapılan eşzamanlı AFM ölçümleri mumsu bileşenlerinin sıralı çıkarılması sırasında, örneğin yüksek tarama hızı ve yüksek çözünürlüklü, 19 ile kütikül yüzey durumunun doğrudan görüntüleme sağlar. Her iki durumda da (temassız) modu yanal (kesme) kuvvetleri nedeniyle olası hasar kaçınarak ve numune yüzey kazıma, narin "yumuşak" Bitki materyallerinin yüzey karakterizasyonu için bir alternatif olarak kullanılabilir. 5,20 dokunarak yılında AFM İşletim , yüzey üzerinde aynı noktada birden fazla görüntü sıralı satın AFM ölçümlerde "prob-yüzey etkileşimleri" nedeniyle herhangi bir yüzey hasarı belirlemek için hizmet vermektedir. 6,21 iyi tekrarlanabilirlik için, yumuşak cuticular yüzeyler için uygun yay sabitleri ile AFM probları olmalıdır sıcaklık ve nem kullanılan ve süreklilik sağlanmalıdır. 6,15,20 22,23 sağlar. 1,2

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma, ABD Ulusal Bilim Vakfı hibe # MCB-0741914 ve MCB-0843627 tarafından desteklenmiştir; ek altyapı desteği 2 Ulusal Sağlık Enstitüleri Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi'nden G12 RR03060-26 tarafından New York City College sağlanmıştır. Biz minnetle JKC M82 (yabani tip) ve CM15 (mutant) domates tırnak etlerini sağlamak için Cornell Üniversitesi Bitki Biyolojisi Bölümü grup Rose kabul ediyorsunuz. Biz AFM deneyler yaptığı cömert yardım için Prof Alexander Couzis arasında CCNY Kimya Mühendisliği grubundan Dr Spyros Monastiriotis teşekkür ederim. Biz grafik tasarım desteği için Bayan Lauren Gohara teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S8625-500G
Pectinase TCI America P0026 EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator
Cellulase Sigma-Aldrich C1184-100KU EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator
Glacial Acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-100G Extremely hazardous
Incubator/shaker New Brunswick Scientific Model No.G24 MFG No.M1036-000G
Vacuum Oven Precision Scientific 31566
Variac Controller
Sintered glass thimble (85 mm/25mm) VWR international 89056
Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) VWR international 28320
Methanol VWR international EMD-MX0485-7
Glass wool VWR international RK20789
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100
Tweezers VWR international 82027-452
Chloroform VWR international EM-CX1050-1
Hexane Fisher Scientific H302-4
Nitrogen gas
Parafilm VWR international 52858
Paper towels VWR international 89002-984
Kim wipes VWR international 21905-026
Gum arabic Sigma-Aldrich G9752
1.6 mm fastMAS zirconia rotor Varian Inc., Agilent
NMR spectrometer Varian Inc., Agilent standard bore magnet
Glycine Sigma-Aldrich 50046 Model compound for CPMAS
Glutamine Sigma-Aldrich 49419 Model compound for CPMAS
Adamantane Sigma-Aldrich 100277 To calibrate 90° pulse in NMR
Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) Digital Instruments
Nanoscope software Digital Instruments Version 5.30r3sr3 (2005)
AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) Veeco Instruments, Inc. Model NP-20
Light microscope Digital Instruments
Magnetic puck Digital Instruments
Double sided tape VWR international
Fruit Peeler
Büchner funnel VWR international 89038

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. The biophysical design of plant cuticles: an overview. New Phytologist. 189, 938-949 (2011).
  2. Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes - a smart material? Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).
  3. Jetter, R., Schäffer, S. Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development. Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).
  4. Vogg, G. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid β-ketoacyl-CoA synthase. J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).
  5. Isaacson, T. Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss. Plant J. 60, 363-377 (2009).
  6. Round, A. N. The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR. Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).
  7. Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids. J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).
  8. Morcombe, C. R., Zilm, K. W. Chemical shift referencing in MAS solid state NMR. J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).
  9. Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods. J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).
  10. Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).
  11. Stark, R. E. NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters. Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).
  12. Schaefer, J., Stejskal, E. O. Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle. J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).
  13. Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions. Envir. Sci. & Tech. 38, 4369-4376 (2004).
  14. Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester. Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).
  15. Stark, R. E., Garbow, J. R. Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall. Macromolecules. 25, 149-154 (1992).
  16. Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G. Heteronuclear Decoupling in Rotating Solids. J. Chem. Phys. 103, 6951-6958 (1995).
  17. Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O. Ramped-Amplitude Cross-Polarization in Magic-Angle-Spinning NMR. J. Magn. Reson. Ser. A. 110, 219-227 (1994).
  18. Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization - Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields. J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).
  19. lessandrini, A., Facci, P. AFM: a versatile tool in biophysics. Measurement Sci. & Tech. 16, 10-1088 (2005).
  20. Benítez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques. J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).
  21. Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM). J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).
  22. Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).
  23. Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics