Fremkalde dendritisvækst i dyrkede sympatiske neuroner

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver en protokol til anvendelse knoglemorfogenetisk protein-7 (BMP-7) eller Matrigel til selektivt at inducere dendritisk vækst i primære sympatiske neuroner adskilles fra superior cervikale ganglier (SCG) med perinatal rotter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P. J. Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons. J. Vis. Exp. (61), e3546, doi:10.3791/3546 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Formen af dendritiske savakslen bestemmer den samlede synaptiske input en neuron kan modtage 1-3, og påvirker arten og fordelingen af disse indgange 4-6. Ændrede mønstre i dendritisk vækst og plasticitet er forbundet med nedsat neurobehavioral funktion i eksperimentelle modeller 7, og menes at bidrage til de kliniske symptomer observeret hos begge nervesystemets 8-10 og neurodegenerative sygdomme 11-13. Sådanne observationer understrege funktionelle vigtigheden af ​​netop at regulere dendritisk morfologi, og tyder på, at identificere mekanismer, der styrer dendritisvækst ikke kun vil fremme forståelsen af, hvordan neuronal tilslutningsmuligheder reguleres under normal udvikling, men kan også give indsigt i nye terapeutiske strategier for forskellige neurologiske sygdomme.

Mekanistiske studier af dendritisvækst vil blive lettet betydeligt af tilgængeligheden oFA model system, der tillader neuroner kan eksperimentelt skiftet fra en tilstand, hvor de ikke strækker dendritter til én, hvor de udarbejde et dendritisk lysthus kan sammenlignes med deres in vivo modstykker. Primære kulturer af sympatiske neuroner dissocierede fra superior cervikale ganglier (SCG) med perinatal gnavere tilvejebringe en sådan model. Når de dyrkes i defineret medium i fravær af serum og ganglie gliaceller, sympatiske neuroner strækker en enkelt proces, som er axonal, og dette unipolære tilstand vedvarer i uger til måneder i kultur 14,15. Imidlertid er tilsætningen af enten knoglemorfogenetisk protein-7 (BMP-7) 16,17 eller Matrigel 18 til dyrkningsmediet udløser disse neuroner til at udvide flere processer, som opfylder de morfologiske, biokemiske og funktionelle kriterier for dendritter. Sympatiske neuroner dissocierede fra SCG af perinatale gnavere og dyrket under definerede betingelser er en homogen population af neuroner 19at reagere ensartet på dendritceller-fremmende aktivitet af Matrigel, BMP-7 og andre BMP'er i decapentaplegic (DPP) og 60A underfamilier 17,18,20,21. Vigtigt, Matrigel-og BMP-induceret dendritceller dannelse forekommer i fravær af ændringer i cellens overlevelse eller axonal vækst 17,18.

Her beskriver vi, hvordan at etablere dissocierede kulturer af sympatiske neuroner afledt fra SCG af perinatal rotter, således at de reagerer på den selektive dendritceller-fremmende aktivitet af Matrigel eller BMP'er.

Protocol

1. Udarbejdelse af Kultur Medium (C2 medium)

  1. Tilføj følgende, i den viste rækkefølge, til en steril, engangs 500 ml Erlenmeyer-kolbe:
    Beløb Component Slutkoncentration
    190 ml DMEM (lav glucose) N / A
    10 ml fedtsyrefrit BSA (20mg/ml i DMEM) 50 ug / ml
    2,8 ml L-glutamin 1,4 mM
    4 ml insulin / transferrin / selen (100x) 10 ug / ml insulin 5,5 ug / ml transferrin 38,7 nM selen
    0,4 ml NGF (125 ug / ml) 100 ng / ml
    200 ml Ham F-12 N / A
  2. Swirl forsigtigt to mix og prøve 10 ml pr rør i 17 x 100 sterile Snaplåget rør.
  3. Opbevares ved -80 ° C
  4. Vigtige bemærkninger:
    • Optø NGF umiddelbart før brug.
    • Før udportionering NGF stamopløsningen, de indvendige vægge af vævsdyrkningsplastic serologisk pipette med protein precoat at minimere klæbning af NGF til plast. Lettest fremgangsmåde er at pipettere det DMEM indeholdende BSA flere gange. Skyl NGF røret flere gange med DMEM blanding.
    • Tilføj F-12 sidste, fordi fri cystein kan destabilisere disulfidbindinger i insulin.
    • Må ikke fryses i mængder større end 10 ml, fordi Capo 4 krystaller kan danne
    • Må ikke fryses, optøs C2 medium mere end 2 gange.

2. Fremstillinq af dækglas

  1. Vi har fundet, at kun fine tyske glasdækglas arbejder konsekvent i denne protokol (se tabel 1 for anbefalet at købe end katalognummer).
  2. Tilsættes 75-100 ml 70% salpetersyre til 300 ml glas prøver flasker med polytetrafluorethylen (PTFE eller Teflon) låg foringer (Fisher katalog # 09-911-765).
  3. Iført handsker, drop dækglas én efter én ind i salpetersyre løsning. Tilsættes tilstrækkeligt dækglas at et lag ikke mere end 2-3 dækglas tykkelse på bunden af ​​glasset.
  4. Ryst forsigtigt beholderne med dækglassene i 6-8 timer ved stuetemperatur på en orbital omryster sæt til ikke mere end 185 omdrejninger pr.
  5. Arbejde i et stinkskab, omhyggeligt dekanteres syre og bortskaffes i henhold til lokale regulativer. Skylles dækglas gang med ultrarent vævskultur-grade vand, hvorefter der tilsættes 75 til 100 ml vand til beholderen. Dækglas kan skylles flere gange, hvis vandet bliver uklar. Ryst forsigtigt ved stuetemperatur natten over på en orbitalryster sæt til ikke mere end 185 omdrejninger pr.
  6. Gentage ovenstående sekvens af salpetersyre / vævskultur-grade vand dagligt i i alt 3 dage.
  7. Fradekanteres denne acetone og korrekt bortskaffelse.
  8. Overfør dækglas til et 150 mm glas petriskål. Tilsættes tilstrækkeligt acetone til knap dække dækglas. Sørg for dækglas er i et enkelt lag i fadet.
  9. Tillade acetone fordampe natten over i et stinkskab.
  10. Bag dækglas i en tørreovn ved 180 ° C i 1,5 timer for at sterilisere.

3. Udarbejdelse af Dækglas for Kultur

  1. Dagen før dissektion, tilsættes 1 dækglas (fremstillet som beskrevet ovenfor) til hver brønd af en 24-brønds vævskulturplade med steril teknik. Tilsættes 200 ul sterilt poly-D-lysin-opløsning (100 mg / ml i 0,5 M Tris-puffer, pH 8) til hver brønd, og opbevar pladen ved 4 ° C natten over.
  2. Dagen for dissektion, og ideelt før dissektion, aspireres poly-D-lysin-opløsning fra hver brønd og vask eAch og 5 gange med sterilt cellekultur kvalitetsvand.
  3. Tilsæt 200 pi lav glucose DMEM til hver plade og opbevares i 37 ° C inkubator. Cirka 1 time før udpladning af celler, fjerne lav-glucose DMEM, og der tilsættes 250 pi C2 medium per brønd. Detaljerede plader ved 37 ° C under 5% CO2, indtil cellerne er klar til at blive belagt.

4. Dissektion og isolering af det superiore cervicale ganglion

  1. Dissocierede kulturer af sympatiske neuroner fremstilles sædvanligvis ved dissociation af superior cervikal ganglie (SCG) høstes fra prænatal (embryoniske dag 19-21) rotteunger fordi der er færre glialceller. Dog kan den samme protokol som kan anvendes med succes med tidlige postnatale (1 til 3 dage gammel) rotteunger eller perinatale museunger.
  2. Afliv gravide rotter via CO 2 indånding. Barbering maven og vask af huden med 70% ethanol. Fjerne Uterushornene under sterile betingelser og placere de uterine horn i en steril 150 mmPetriskål. At undgå at beskadige tarmene eller andre indre organer i dæmningen under dissektion.
  3. Placer petriskålen med hvalpene ned på en pande med is til at bedøve de embryonale hvalpene. Dissekere de embryoner fri for livmoderhorn og fostervand membraner. Skær rygmarven af ​​hver hvalp langs midterlinjen under skulderen til at aflive hvalpene. Dette overskærer vena cava, hvilket reducerer blødning fra halspulsåren under dissektion af SCG. Når dissekeret fri af livmoderhorn, anbringes embryoner i et sterilt Leibovitzs L-15 medium (eller luft-bufret medium) suppleret med penicillin og streptomycin.
  4. Placer embryoner på ryggen på en 150 mm petriskål halvt fyldt med Sylgard. Brug sterile 20 gauge nåle, skyde brystkasse og hovedet forsigtigt hyperextending halsen, hvilket letter dissektion af SCG.
  5. Gøre en midtlinie-incision langs halsen ved niveauet for kraveben at afsløre submandibulære kirtler. Fjern kirtler using fine tænger (nr. 4 eller ingen. 5 Dumont) at eksponere muskellag.
  6. Brug de fine pincet til at skære i musculus sternocleidomastoideus, nær kravebenet. Derefter forsigtigt løfte og incise den omohyoid muskel siden af ​​trachea. Denne muskel er meget tynd, så undgå at skære for dybt for at undgå at rive den underliggende halspulsåren og SCG. Når disse muskler lag fjernes, bør carotidarterie og vagusnerven være klart synlig.
  7. Den SCG ligger lige under forgreningen af ​​halspulsåren. Ved hjælp af fine tænger (nr. 4 eller ingen. 5), stumpt dissekere væv bort fra begge sider af carotidarterien for at blotlægge ganglion. Med 2 fine tænger fat i halspulsåren lige over og under rostralt og caudalt ender af SCG henholdsvis at fjerne den del af carotisarterien ligger over SCG samt SCG selv. Det er sandsynligt, at nodøse ganglion, der ligger parallelt med SCG på dette udviklingstrin, også vil blive fjernet ved dette trin. Den nodøse ganglierkan identificeres ved sin runde form og den store vagusnerven rager ud fra det. Denne ligger langs en af ​​de grene af halspulsåren. I modsætning hertil er den SCG mandelformede og ligger direkte under forgreningen af ​​halspulsåren. Anbring det dissekerede væv i et sterilt 35 mm dyrkningsskål indeholdende L-15 medium og antibiotika. Fjern SCG fra alle unger, inden går videre til næste trin.
  8. Ved hjælp af fine tænger, adskille forsigtigt SCG fra halspulsåren, og andre fjernet væv under dissektionen (især vagusnerven og nodøse ganglion). Anvende fine tænger til fjernelse af kapslen fra ganglia. Dette reducerer antallet af ikke-neuronale celler i kultur. Overføre ganglier til en anden steril 35 mm skål indeholdende L-15 medium.
  9. At adskille den SCG, fjernes L-15 medium og erstattes med 2 ml collagenase (slutkoncentration 1 mg / ml) / dispase (slutkoncentration 5 mg / ml) i calcium-og magnesium-fri Hanks balanceret saltopløsning. Inkuber ved 37 ° C i 40 minutter.
  10. Overføre SCG til et sterilt 15 ml konisk centrifugerør og bringe volumenet op til 10 ml med L-15 suppleret med BSA (slutkoncentration 1-2 mg / ml). Centrifugeres ved 200 x g ved stuetemperatur i 5 minutter. Supernatanten kasseres, og vaskes en gang mere med L-15 suppleret med BSA.
  11. Efter den anden vask fjerne alle L-15 og resuspender ganglier i ~ 2 ml C2 medium. Tritureres cellerne under anvendelse af en flammepoleret bøjet-spids pipette sørge pipetten er overtrukket med BSA/L15 før triturering at minimere klæbning af celler til glasset. Tritureres forsigtigt 3-4 gange. Lade de store klumper bundfælde i 1 minut og overføre cellesuspensionen til en 15 ml konisk rør. Tilføj flere C2 medier til de resterende SCG og udriv. Efter at lade klumper sig, overfører cellesuspensionen fra det andet triturering til at opsamles efter den første triturering. Gentage denne proces flere gange, indtil ganglia er mestly dissocieret. Kassér eventuelle resterende klumper efter den fjerde triturering.
  12. For celler dissocieret fra et kuld af rotteunger (typisk 12-16 unger) bringe det totale volumen af ​​mediet i cellesuspensionen til 8-10 ml ved tilsætning af yderligere C2 medium. Forsigtigt cellerne under anvendelse af en pipette og fjerne en lille prøve for at bestemme celletætheden. Justere volumen af ​​cellesuspensionen til at opnå 2X celledensiteten ønsket i kultur, og derefter er sikker på at opretholde cellerne i suspension, alikvot 250 ml cellesuspension pr brønd. For morfometriske undersøgelser af dendritisk vækst. Vi typisk plade cellerne ved lav densitet (~ 5 x 10 4 celler per brønd) i plader med 24 brønde
  13. Vores laboratorium udrugning SCG kulturer i glas desiccators snarere end direkte i en CO2-inkubator. Vi gør dette, fordi sympatiske neuroner dyrket i serumfrit medium bedre resultater med en lidt højere CO 2 koncentration (ca. 6,5%). Derudover bruger vi ikkeantibiotika i vores medier, da det hæmmer neuritudvækst og fastholder kulturer i desiccators synes at minimere spredning af forurening, hvis det udvikler sig i en delmængde af kulturer. Ved hjælp af dette system, rutinemæssigt vi fastholder SCG kulturer i op til 8 uger. Når belagte og SCG kulturer anbringes på porcelæn ekssikkator pladen i glas desiccators indeholdende sterilt vand i bunden. Ca. 120 ml af CO 2 injiceres i ekssikkatoren før forsegling lukket og placere hele ekssikkatoren i en inkubator indstillet til 35,5 ° C.

5. Fodring og vedligeholdelse af kulturer

  1. Kulturerne normalt fyldes 3 gange om ugen, hvor den første medieudskiftningsmidlerne forekommende 24 timer efter udpladning. Ved anvendelse af en steril bøjet-spids pipette trække blidt omkring halvdelen af ​​mediet pr brønd. Brug en ren steril bøjet-spids pipette, erstatte mængden af ​​mediet fjernes med frisk C2.
  2. At fjerne ikke-neuronale celler fra kulturen, anti-mitotiske middel cytosin-D-arabinofuranosid (Ara-C, slutkoncentration 1-2 um) tilsættes typisk til dyrkningsmediet ved den første medieudskiftningsmidlerne (eksempelvis 24 timer efter udpladning) i 48 timer. Denne koncentration af Ara-C er sædvanligvis tilstrækkelig til at fjerne alle ikke-neuronale celler. Hvis yderligere ARA-C-behandling er påkrævet, anbefales det, at disse gøres hver anden fodring for at minimere toksiske virkninger på neuroner.

6. Induktion dendritisvækst med Matrigel eller BMP-7

  1. At inducere dendritisk vækst, Matrigel eller BMP-7 sættes til kulturerne efter ikke-neuronale celler er blevet elimineret og Ara-C-niveauer i kulturerne er betydeligt reduceret. Typisk tilføjer vi Matrigel eller BMP-7 i mediet på dag 5 in vitro, men dendritisk vækst kan induceres ved Matrigel eller BMP-7 tilsættes på ethvert tidspunkt in vitro. Matrigel eller BMP-7 sættes til C2 medium, og kulturer tilføres som beskrevet ovenfor.
  2. Matrigel og BMP-inducerede dendritic vækst er tids-og koncentrationsafhængig. For maksimal effekt er Matrigel tilsættes til C2 på en slutkoncentration på 50-75 ug / ml; BMP-7 sættes til C2 medium ved en slutkoncentration på 50 ng / ml. Matrigel koncentrationer større end 100 pg / ml eller BMP-7 koncentrationer større end 100 ng / ml er blevet bemærket at forårsage neuronal toksicitet. Dendritiske processer (som bestemt ved morfologiske kriterier) fremgå cirka 48 timer efter første udsættelse for Matrigel eller BMP-7 i maksimalt effektive koncentrationer. At inducere robust dendritisk vækst kulturerne tilført BMP-7 medium ved hver fodring. Ækvivalente resultater er blevet opnået under anvendelse af BMP'er 2, 4, 5 og 6 ved sammenlignelige koncentrationer 20,21.

7. Immunocytokemisk analyse af BMP-7-induceret dendritisvækst

  1. Når den ønskede udstrækning af dendritisk arborization er opnået, er kulturer fikseret med 4% paraformaldehyd i 0,1 M phosphatbuffer. Den bEST fiksering opnås ved at erstatte halvdelen af ​​mediet i brønden med 4% paraformaldehyd og gentage dette trin 3-5 gange i løbet af 10-15 minutter.
  2. Skylles kulturerne ved at erstatte halvdelen af ​​4% paraformaldehyd med phosphatbufret saltvand (PBS), og gentagelse af dette trin tre gange i løbet af 10 - 15 minutter.
  3. Fjerne alle PBS, og der tilsættes 200 pi 0,1% Triton X-100 i PBS til hver brønd i 5 minutter ved stuetemperatur for at permeabilisere cellerne.
  4. Fjerne Triton opløsning ved aspiration, og der tilsættes 200 pi pr brønd blokeringsbuffer (PBS suppleret med 3-5% BSA og 1% gedeserum). Inkuber i 20-30 minutter ved stuetemperatur.
  5. Fjerne den blokerende buffer, og der tilsættes det primære antistof, mikrotubulus-associeret protein-2 (MAP2) fortyndet 1:2000 - 1:5000 i blokeringsbuffer. Inkuber kulturer i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
  6. Fjerne det primære antistof-opløsning, vaskes kulturerne med PBS tre gange i løbet af 15 minutter ved stuetemperatur temperamentratur.
  7. Inkuber kulturerne med det sekundære antistof fortyndet i PBS suppleret med 1% BSA i 1-2 timer ved stuetemperatur i mørke.
  8. Fjerne det sekundære antistof opløsningen og vaskes kulturerne med PBS tre gange over 10-15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
  9. Mount dækglas på objektglas celle nedad i en dråbe vandig montering medium ved en passende pH-værdi for fluorokrom fæstnet det sekundære antistof. Holde gliderne ved stuetemperatur natten over for at lade monteringsmedium tørre. Detaljerede objektglas ved 4 ° C indtil billeddannelse.
  10. Lad dias afbalancere til stuetemperatur før billeddannelse. Anskaf fluorescerende billeder ved hjælp af et fase-kontrast mikroskop udstyret til epifluorescens. Typisk kan hele dendritiske akslen af ​​en enkelt neuron blive fanget ved hjælp af en 20X objektiv og egnede filtre.

8. Repræsentative resultater

Sympatiske neuroner dissocierede fra SCG perinatal rotter og dyrket i fravær af serum og ganglie gliaceller ikke strække MAP2 immunopositive processer (figur 1), men snarere, strækker sig typisk kun en enkelt axon proces 14,15. Udsættelse for BMP-7 (fig. 1) eller Matrigel inducerer dannelsen af mange forskellige processer, som opfylder de morfologiske, biokemiske og funktionelle kriterier dendritter 17,18. Den dendritceller-fremmende aktivitet af enten Matrigel eller BMP-7 er koncentrationen-og tidsafhængig 17,18,20. Maksimal dendritisk vækst observeres ved koncentrationer på Matrigel mellem 50 og 75 ug / ml eller BMP-7 mellem 30 og 100 ng / ml, og halv-maksimal effekt typisk observeres hos BMP-7 koncentrationer af ~ 2 ng / ml. Imidlertid kan signifikante ændringer i dendritisk vækst påvises med BMP-7 koncentrationer så lave som 300 pg / ml. Den dendritiske respons på enten Matrigel eller BMP-7 er relativt langsom, med <50% af neuronerne danne en anden fremgangsmådeinden for 24 timer efter udsættelse for enten dendritceller-middel. Imidlertid inden for 3 dage efter den initiale BMP-7 eksponering reagere næsten alle neuroner til maksimalt effektiv Matrigel eller BMP-7 koncentrationer. Antallet af dendritter pr neuroner fortsætter med at stige med kontinuerlig udsættelse for BMP-7, med det meste af ændring under de første 10 dage af behandlingen. Efter 4 uger typisk BMP-7-behandlede neuroner har 6-8 primære dendritter, som udviser sekundære, tertiære og endda kvaternære dendritiske forgreninger 17. Denne stigning i dendritiske lysthus forekommer i fravær af en væsentlig ændring i axon-vækst, og sammenlignelige dendritiske svar kan fremkaldes ved hjælp af tilsvarende koncentrationer af BMP'er 2, 4, 5 eller 6 20,21. Dendritisk vækst kan også fremkaldes ved co-dyrkning sympatiske neuroner med endogene ganglioniske gliaceller 15,22, men det dendritiske reaktion er meget langsommere under disse betingelser.

Figur 1. BMP-7 fremmer dendritisk vækst i dyrkede sympatiske neuroner. Ikke-neuronale celler blev fjernet fra SCG kulturer ved behandling med anti-mitotiske i 48 timer begyndende på dag 2 in vitro. Begyndende på dag 5 in vitro, blev kulturer behandlet med enten kontrol medium (A) eller medium suppleret med BMP-7 ved 50 ng / ml (B). På dag 11 in vitro (efter 5 dages BMP behandling), blev kulturer immunfarvet med mAb mod MAP2, et protein, der primært findes i dendritter og neuronal somata. Som vist i repræsentativt fluorescens mikrofotografier neuroner dyrket under kontrolbetingelser mangler dendritter som påvist ved mangel på MAP-2 immunopositive processer dendritter (A), i modsætning til udsat neuroner for BMP-7 (B) har typisk flere tilspidsede MAP-2 immunopositive dendritter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fordelene ved denne model omfatter: (a) kulturer består af en homogen population af sympatiske neuroner fri for andre celletyper 17,23 (b) de vækstfaktorreceptorer krav sympatiske neuroner er veletableret, som tillader anvendelse af defineret medium, og en række definerede medier og substrater fungere godt til dyrkning og opretholdelse sympatiske neuroner 23 (c) neuroner i disse kulturer reagere ensartet på dendritceller-fremmende aktivitet af Matrigel, BMP-7 og andre BMP'er af DPP og 60A underfamilierne 17,18,20,21 og (d) Matrigel-eller BMP-induceret dendritceller dannelse forekommer i fravær af ændringer i cellens overlevelse eller axonal vækst 17,18. Denne model tillader eksperimentel styring af, hvornår dendritisk vækst udløses, som gør det muligt at opnå synkroniserede populationer af neuroner i forskellige stadier af dendritisk vækst, fx umiddelbart før dannelsen af ​​dendritter, under primær dendritogenesis (den indledende dannelse af primære dendritter) og i senere stadier af dendritisk modning. De væsentligste begrænsninger model omfatter de begrænsede mængder af RNA og protein kan fås fra en typisk dissektion af en enkelt kuld, hvilket kan begrænse biokemiske undersøgelser, og en vis vanskelighed med at manipulere genekspression. Nylige fremskridt inden for teknikker til ekspression af cDNA i primære neuronale cellekulturer hurtigt at overvinde denne sidstnævnte ulempe. Der er publikationer rapporterer den vellykkede anvendelse af lipid-baserede afgivelsessystemer og nucleofection og adenovirale vektorer til dyrkede sympatiske neuroner. De rapporterede transfektionseffektiviteter er relativt lav (typisk i området fra 10-20% med lipofektion eller nucleofection og op til 30-50% med virusinfektion), der er passende for slutpunkter baseret på individuelle celle analyser, såsom morfologiske analyser, men kan være problematisk for mange biokemiske endepunkter.

Faktorer THAt kan interferere med BMP-induceret dendritisk vækst i dyrkede sympatiske neuroner omfatter dyrkning af neuronerne i en meget høj celledensitet og med serum i dyrkningsmediet. Mens den grund, at høj celledensitet dæmper dendritceller-fremmende aktivitet af BMP'er er ikke kendt, er det sandsynligt, at serum dæmper aktivitet som følge BMP'er binder ivrigt til serumproteiner. Interessant serum selv har ringe dendritceller-fremmende aktivitet i dyrkede sympatiske neuroner 24, og vore foreløbige data antyder, at denne aktivitet medieres af BMP'er, som er til stede i de fleste hvis ikke alle kommercielt sera. BMP'er er også til stede i Matrigel, og sandsynligvis medierer dens dendritceller-fremmende aktivitet. En tredje faktor, der kan påvirke dendritceller-fremmende aktivitet af BMP'er er forkert håndtering og opbevaring af BMP'er. Må ikke opbevares BMP stamopløsninger i en koncentration på mindre end 0,1 mg / ml. Det er vigtigt ikke at lade BMP lager eller arbejder løsninger til at blive meget grundlæggende og vi anbefaler, at BUFførsler anvendes til at fortynde stamopløsninger har en pH på 4,5 ± 0,05. Bland alle løsninger kraftigt før udportionering, men ikke så kraftigt, at løsninger skum, og kun bruge polypropylen-rør, fordi BMP tendens til at holde sig til andre plasttyper. Ikke opbevares aliquots i frysere, der har en automatisk afrimning funktion, fordi den cykliske temperaturer er tilstrækkelig til at ødelægge aktiviteten af ​​BMP-7. Det anbefales, at BMP opløsninger opbevares ved -80 ° C, og frysning-optøning kan minimeres (vi ikke nedfrysnings-optøningsstabil mere end 2-3 gange). Lignende forholdsregler bør anvendes i håndtering af Matrigel. Også anbefales det, at Matrigel langsomt optøs ved 4 ° C. Matrigel vil ikke fremkalde dendritisk vækst, når de anvendes til forbelægning substrater før udpladning neuroner, er det kun effektivt, når de tilsættes til dyrkningsmediet af etablerede neuronale cellekulturer 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet med midler fra National Institutes of Health (tilskud R21 NS45037 og R01 ES014901).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips Bellco Glass 1943-10012 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass
Bent tip pipets Bellco Glass 1273-50003
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899-100MG Stock solution 1 mg/ml
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 15230
Fine forceps Dumont no. 4 and 5 Fine Science Tools 11252-30 11241-30
20-gauge needles BD Biosciences 305176
Leibovitz’s L-15 medium Invitrogen 11415
Collagenase Worthington Biochemical 4176 1 mg/ml
Dispase Roche Group 04942078001 5 mg/ml
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) Invitrogen 14185-052
DMEM Low glucose Invitrogen 11885
L-Glutamine Invitrogen 25030 20 mM
Insulin/Transferrin/ Selenium Invitrogen 51500-056 100X
Fatty-acid free BSA Calbiochem 126609
NGF Harlan Laboratories 5017
Ham F-12 nutrient medium (F-12) Invitrogen 11765
Cytosine arabinoside Sigma-Aldrich C1768
Matrigel BD Biosciences 356234 Avoid repeated freeze-thaw cycles
BMP-7 R&D Systems 345-BP BMP7-07H BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Mouse anti-rat MAP2 antibody Sternberger Monoclonals Inc. SMI52 1/5000
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse Invitrogen A11003 1/10000
Mounting media Molecular Probes, Life Technologies P7481

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purpura, D. P. The Neurosciences: A Study Program. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. Rockefeller University Press. 372-393 (1967).
  2. Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
  3. Purves, D. A Trophic Theory of Neural Connections. Harvard University Press. (1988).
  4. Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
  5. Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
  6. Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
  7. Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
  8. Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
  9. Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
  10. Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
  11. de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
  12. Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
  13. Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
  14. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
  15. Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
  16. Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
  17. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
  18. Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
  19. Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. The MIT Press. 177-295 (1991).
  20. Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
  21. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
  22. Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
  23. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 177-205 (1991).
  24. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics