Inducing dendrittiske Veksten i dyrkede sympatiske Neurons

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver en protokoll for å bruke Benmorfogenetiske protein-7 (BMP-7) eller Matrigel å selektivt indusere dendrittiske vekst i primærnæringene sympatiske nevroner dissosiert fra overordnet cervical ganglier (SCG) av perinatale rotter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P. J. Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons. J. Vis. Exp. (61), e3546, doi:10.3791/3546 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Formen på dendrittiske arbor avgjør det totale synaptiske inngang et nevron kan motta 1-3, og påvirker hvilke typer og fordeling av disse inngangene 4-6. Endrede mønstre av dendrittiske vekst og plastisitet er assosiert med nedsatt neurobehavioral funksjon i eksperimentelle modeller 7, og er tenkt å bidra til kliniske symptomer observert i begge nevrologisk lidelser 8-10 og nevrodegenerative sykdommer 11-13. Slike observasjoner understreker den funksjonelle betydningen av nettopp å regulere dendrittiske morfologi, og foreslår at identifisering mekanismene som styrer dendrittiske veksten ikke bare vil fremme forståelse for hvordan neuronal tilkobling er regulert under normal utvikling, men kan også gi innsikt om nye terapeutiske strategier for ulike nevrologiske sykdommer.

Mekanistiske studier av dendrittiske veksten ville bli mye lettere å tilgjengeligheten ofa modell system som lar nerveceller kan eksperimentelt gått over fra en tilstand der de ikke strekker dendritter til en der de utarbeide en dendrittiske arbor sammenlignbar med deres in vivo kolleger. Primære kulturer av sympatiske nerveceller dissosiert fra overordnet cervical ganglier (SCG) av perinatale gnagere gi en slik modell. Når dyrket i definert medium i fravær av serum og ganglionic gliacellene, sympatiske nevroner forlenge en enkelt prosess som er aksonal, og dette unipolar tilstanden vedvarer i uker til måneder i kultur 14,15. Imidlertid utløser tillegg av enten Benmorfogenetiske protein-7 (BMP-7) 16,17 eller Matrigel 18 til kulturen medium disse nevronene å utvide flere prosesser som oppfyller de morfologiske, biokjemiske og funksjonelle kriterier for dendritter. Sympatiske nevronene dissosiert fra SCG av perinatale gnagere og voksne under definerte betingelser er en homogen befolkning av nevroner 19som reagerer likt for den dendrite-fremme aktivitet Matrigel, BMP-7 og andre fil fra BMP av decapentaplegic (DPP) og 60A underfamilier 17,18,20,21. Viktigere, oppstår Matrigel-og BMP-indusert dendrite formasjon i fravær av endringer i celle overlevelse eller aksonal vekst 17,18.

Her beskriver vi hvordan du setter opp dissosiert kulturer sympatiske nerveceller avledet fra SCG av perinatale rotter slik at de er lydhøre for den selektive dendrite-fremme aktiviteten Matrigel eller fil fra BMP.

Protocol

1. Utarbeidelse av Kultur Medium (C2 medium)

  1. Legg til følgende, i den rekkefølgen, til en steril, disponibel 500 ml erlenmeyerkolbe:
    Beløp Component Endelig konsentrasjon
    190 ml DMEM (lav glukose) N / A
    10 ml fettsyre gratis BSA (20mg/ml i DMEM) 50 mikrogram / ml
    2,8 ml L-Glutamin 1,4 mM
    4 ml insulin / transferrin / selen (100x) 10 mikrogram / ml insulin 5,5 mikrogram / ml transferrin 38,7 nM selen
    0,4 ml NGF (125 mikrogram / ml) 100 ng / ml
    200 ml Ham F-12 N / A
  2. Swirl forsiktig to mix og delmengde 10 ml per rør i 17 x 100 sterile snapp cap rør.
  3. Oppbevar ved -80 ° C
  4. Viktige merknader:
    • Tin NGF umiddelbart før bruk.
    • Før aliquoting den NGF stamløsning, precoat de innvendige veggene i vevskultur plast serologisk pipette med protein for å minimalisere stikke av NGF til plast. Enkleste metode er å Pipetter den DMEM blanding som inneholder BSA flere ganger. Skyll NGF røret flere ganger med DMEM blandingen.
    • Legg F-12 sist fordi gratis cystein kan destabilisere disulfide obligasjoner i insulin.
    • Må ikke fryses i volumer større enn 10 ml fordi Capo 4 krystaller kan danne
    • Ikke frys og tin C2 medium mer enn 2 ganger.

2. Utarbeidelse av Glass Dekkglass

  1. Vi har funnet at bare fine tyske glass Dekkglass arbeide konsekvent i denne protokollen (se tabell 1 for anbefalte kilde end katalognummer).
  2. Legg 75-100 ml 70% salpetersyre til 300 ml glass prøven flasker med polytetrafluoretylen (PTFE eller Teflon) lokk liners (Fisher katalog # 09-911-765).
  3. Iført hansker, Dekkglass dråpe en etter en inn i salpetersyre løsningen. Legg nok Dekkglass å lage et lag ikke mer enn 2-3 Dekkglass tykk i bunnen av glasset.
  4. Rist beholderne med Dekkglass i 6-8 timer ved romtemperatur på en orbital shaker sett for ikke mer enn 185 rpm.
  5. Arbeide i en avtrekkshette, forsiktig dekanter syre og kast henhold til lokale bestemmelser. Skyll Dekkglass gang med ultrarent vevskultur-grade vann, legg deretter til 75-100 ml vann til beholderen. Dekkglass kan skylles flere ganger hvis vannet blir overskyet. Rist ved romtemperatur over natten på en orbital shaker sett for ikke mer enn 185 rpm.
  6. Gjenta ovenstående sekvens av salpetersyre / vevskultur-grade vann daglig for totalt 3 dager.
  7. Dekanter denne aceton og kast riktig.
  8. Overfør Dekkglass til en 150 mm glass petriskål. Legg nok aceton til knapt dekke Dekkglass. Sørg for at Dekkglass er i et enkelt lag i fatet.
  9. La aceton å fordampe over natten i en avtrekkshette.
  10. Bake Dekkglass i en tørking ovn på 180 ° C i 1,5 timer for å sterilisere.

3. Utarbeidelse av Dekkglass for Kultur

  1. Dagen før disseksjonen, tilsett 1 glass dekkglass (tilberedt som beskrevet ovenfor) til hver brønn av en 24 brønn vevskultur plate ved hjelp av steril teknikk. Tilsett 200 mL sterilt poly-D-lysin løsning (100 mg / ml i 0,5 M Tris-buffer, pH 8) til hver brønn og lagre platen ved 4 ° C over natten.
  2. Den dagen av disseksjon, og helst før du starter disseksjon, aspirer det poly-D-lysin løsning fra hver brønn og vaske eAch vel 5 ganger med sterilt vev-kulturen grade vann.
  3. Tilsett 200 mL lav-glukose DMEM til hver plate og butikk i 37 ° C inkubator. Omtrent en time før plating celler, fjerner lav-glukose DMEM og legge 250 mL C2 medium per brønn. Oppbevar plater ved 37 ° C under 5% CO 2 til cellene er klar til å være belagt.

4. Disseksjon og Isolasjon av Superior Cervical Ganglion

  1. Dissosiert kulturer av sympatiske nevroner er vanligvis utarbeidet av dissosiasjon av overlegen cervical ganglier (SCG) høstet fra prenatal (embryonale dager 19-21) rotteunger fordi det er færre gliacellene. Men dette kan samme protokollen brukes med hell med tidlige postnatale (1 til 3 dager gammel) rotteunger eller perinatale mus valper.
  2. Avlive drektige rotter via CO 2 innånding. Barbere magen og vask huden med 70% etanol. Fjern livmor hornene under sterile forhold og plassere livmor horn i en steril 150 mmPetriskål. Unngå skade tarmen eller andre interne organer i dammen under disseksjonen.
  3. Plasser petriskål med valpene inn på en kjele med is til anesthetize de embryonale valpene. Dissekere embryoene uten livmor horn og amniotic membraner. Skjær ryggmargen på hver valp langs midtlinjen under skulderen til avlive valpene. Dette kutter også vena cava, som reduserer blødning fra halspulsåren under disseksjon av SCG. Når dissekert fri for livmor horn, sted embryo i en steril Leibovitz i L-15 medium (eller luft-bufret medium) supplert med penicillin og streptomycin.
  4. Plasser embryoene på ryggen på en 150 mm petriskål halvfylt med Sylgard. Bruke sterile 20 gauge nåler, pin thorax og hodet, forsiktig hyperextending halsen, noe som letter disseksjonen av SCG.
  5. Lag en midtlinjen snitt langs halsen på nivå med de clavicles å avsløre kjevemusklene kjertler. Fjern kjertlene using fin pinsett (nr. 4 eller ingen. 5 Dumont) å utsette muskelen laget.
  6. Bruk den fine tang for å klippe sternocleidomastoideus muskelen nær krageben. Så forsiktig løft og Incise det omohyoid muskelen ved siden av luftrøret. Denne muskelen er veldig tynn, så unngå å kutte for dypt for å unngå å rive den underliggende halspulsåren og SCG. Når disse muskelgruppene lagene er fjernet, bør halspulsåren og nervus vagus være godt synlig.
  7. Den SCG ligger like under bifurkasjon av halspulsåren. Bruke fin pinsett (nr. 4 eller no. 5), sløve dissekere vev fra begge sider av halspulsåren å eksponere ganglion. Bruke 2 fine tang, tar du tak i halspulsåren like over og under rostral og kaudale endene av SCG, henholdsvis for å fjerne den delen av halspulsåren liggende over SCG samt SCG selv. Det er sannsynlig at den nodose ganglion, som ligger langs SCG på dette stadiet av utviklingen, vil også bli fjernet på dette trinnet. Den nodose ganglierkan identifiseres med sin runde form og den store vagal nerve projiserer fra det. Dette ligger langs en av de grenene av halspulsåren. I kontrast er SCG mandelformede og ligger direkte under bifurkasjon av halspulsåren. Plasser dissekert vevet inn i et sterilt 35 mm kultur fatet inneholder L-15 medium og antibiotika. Fjern SCG fra alle valpene før du går videre til de neste trinnene.
  8. Ved hjelp av gode tang, forsiktig skille SCG fra halspulsåren og eventuelle andre vev fjernes i løpet av disseksjon (spesielt vagus nerve og nodose ganglion). Bruk fin pinsett til å fjerne kapselen fra ryggmargen. Dette reduserer antallet nonneuronal celler i kultur. Overfør ganglia til en annen steril 35 mm fatet inneholder L-15 medium.
  9. For å distansere den SCG, fjerne L-15 medium og erstatte med 2 ml collagenase (endelig konsentrasjon 1 mg / ml) / Dispase (endelig konsentrasjon 5 mg / ml) i kalsium og magnesium-free Hank balanserte saltløsning. Inkuber ved 37 ° C i 40 minutter.
  10. Overfør SCG til en steril 15 ml konisk sentrifugerør og bringe volumet opp til 10 ml med L-15 supplert med BSA (endelig konsentrasjon 1-2 mg / ml). Sentrifuger ved 200 X g ved romtemperatur i 5 minutter. Kast supernatanten og vask igjen med L-15 supplert med BSA.
  11. Etter andre vask, fjerne all L-15 og resuspender det ganglier i ~ 2 ml C2 medium. Triturate cellene ved hjelp av en brann-polert bøyd-tip pipette, pass på at pipetten er belagt med BSA/L15 før trituration å minimere stikke av celler til glasset. Triturate forsiktig 3-4 ganger. La de store klumper bosette i ca 1 minutt og overføre cellesuspensjon til en 15 ml konisk rør. Legg til flere C2 media til den gjenværende SCG og triturate. Etter å la klumper bosette, overføre cellesuspensjon fra andre trituration til at samlet etter første trituration. Gjenta denne prosessen flere ganger til ganglier er mestly dissosiert. Kast eventuelle gjenværende klumper etter fjerde trituration.
  12. For celler skilt fra ett kull av rotteunger (typisk 12-16 unger), bringe det totale volumet av medium i cellesuspensjonen til 8-10 ml ved å tilsette ekstra C2 medium. Forsiktig resuspender cellene ved hjelp av en pipette og ta en liten delmengde å bestemme celle tetthet. Juster volumet på cellesuspensjon å oppnå 2X cellen tetthet ønsket i kulturen, og deretter, være sikker på å opprettholde cellene i suspensjon, delmengde 250 ml cellesuspensjon per brønn. For morfometriske studier av dendrittiske vekst, vi vanligvis plate cellene ved lav tetthet (~ 5 x 10 4 celler per brønn) i 24 og plater.
  13. Vårt laboratorium incubates SCG kulturer i glass Desiccators snarere enn direkte i en CO 2 inkubator. Vi gjør dette fordi sympatiske nevroner dyrket i serum-free medium yter bedre med en litt høyere CO 2-konsentrasjonen (cirka 6,5%). I tillegg bruker vi ikkeantibiotika i våre medier siden det hemmer neurite utvekst og vedlikehold av kulturer i Desiccators synes å minimere spredning av forurensning hvis det utvikler seg i en undergruppe av kulturer. Ved hjelp av dette systemet, vi rutinemessig vedlikeholde SCG kulturer i opptil 8 uker. Når belagt, SCG kulturer er plassert på porselen eksikkator plate i glass Desiccators inneholder sterilt vann i bunnen. Omtrent 120 ml av CO 2 injiseres i eksikkator før tetting stengt og plassere hele eksikkator inn en inkubator sett for 35,5 ° C.

5. Fôring og vedlikehold av kulturer

  1. Kulturer er generelt fôres 3 ganger i uken, med den første media utveksling forekommer 24 timer etter plating. Ved hjelp av en steril bøyd-tip pipette, forsiktig trekke tilbake halvparten av mediene per brønn. Bruk en ren steril bøyd-tip pipette, erstatte volumet av medium fjernet med frisk C2.
  2. For å eliminere ikke-nevronale celler fra kultur, anti-mitotisk middel cytosin-D-arabinofuranoside (ARA-C, endelig konsentrasjon 1-2 mm) er vanligvis lagt til kultur medium ved første media utveksling (f.eks 24 timer etter plating) i 48 timer. Denne konsentrasjonen av ARA-C er vanligvis tilstrekkelig å fjerne alle ikke-nevronale celler. Hvis ytterligere ARA-C behandling er nødvendig, anbefales det at disse gjøres annenhver fôring for å minimere toksiske effekter på nervecellene.

6. Inducing dendrittiske Vekst med Matrigel eller BMP-7

  1. Å indusere dendrittiske vekst, er Matrigel eller BMP-7 legges til kulturer etter ikke-nevronale celler har blitt eliminert og ARA-C nivåene i de kulturene er betydelig redusert. Vanligvis legger vi Matrigel eller BMP-7 til medium på dag 5 in vitro, men dendrittiske veksten kan bli indusert av Matrigel eller BMP-7 til når som helst punkt in vitro. Matrigel eller BMP-7 legges til K2 medium og kulturer fôres som beskrevet ovenfor.
  2. Matrigel og BMP-indusert dendritic vekst er tid og konsentrasjon-avhengig. For maksimal effekt, er Matrigel lagt til C2 på en endelig konsentrasjon på 50-75 mikrogram / ml; BMP-7 legges til K2 mediet på en endelig konsentrasjon på 50 ng / ml. Matrigel konsentrasjoner av mer enn 100 mikrogram / ml eller BMP-7 konsentrasjoner større enn 100 ng / ml har vært kjent forårsake neuronal toksisitet. Dendrittiske prosesser (som bestemmes av morfologiske kriterier) blir tydelig cirka 48 timer etter første eksponering for Matrigel eller BMP-7 på maksimalt effektive konsentrasjoner. Å indusere robust dendrittiske vekst, er kulturer matet med BMP-7 inneholder medium ved hver fôring. Tilsvarende resultater er oppnådd ved hjelp av to fil fra BMP, 4, 5 og 6 ved sammenlignbare konsentrasjoner 20,21.

7. Immunocytochemical Analyse av BMP-7-indusert dendrittiske Vekst

  1. Når ønsket omfanget av dendrittiske arborization er oppnådd, er kulturer fast bruker 4% paraformaldehyde i 0,1 M fosfatbuffer. Det best fiksering oppnås ved å erstatte halvparten av medium i brønnen med 4% paraformaldehyde og gjenta dette trinnet 3-5 ganger over 10-15 minutter.
  2. Skyll kulturer ved å erstatte halvparten av 4% paraformaldehyde med fosfat-bufret saltvann (PBS) og gjenta dette trinnet tre ganger over 10 - 15 minutter.
  3. Fjern all PBS og legge 200 mL 0,1% Triton X-100 i PBS til hver brønn i 5 minutter ved romtemperatur til permeabilize cellene.
  4. Fjern Triton løsning ved aspirasjon og legge 200 mL per brønn av blokkering buffer løsning (PBS supplert med 3-5% BSA og 1% geit serum). Inkuber i 20-30 minutter ved romtemperatur.
  5. Fjern blokkering buffer og legg den primære antistoff, microtubuli-assosiert protein-2 (MAP2) fortynnet i 1:2000 - 1:5000 i blokkering buffer. Inkuber kulturer for 1 time i romtemperatur, eller over natten ved 4 ° C.
  6. Fjern den primære antistoffet løsningen, vaske kulturer med PBS tre ganger over 15 minutter ved romtemperatur temperamentperatur.
  7. Inkuber kulturer med det sekundære antistoff fortynnes i PBS supplert med 1% BSA i 1-2 timer ved romtemperatur i mørket.
  8. Fjern den sekundære antistoff løsningen og vask de kulturer med PBS tre ganger over 10-15 minutter ved romtemperatur i mørket.
  9. Mount Dekkglass på glass glir celle side ned i en dråpe vandig montering medium på riktig pH for fluorokromkonjugerte knyttes til den sekundære antistoffet. Hold lysbildene i romtemperatur over natten å la montering medium tørr. Oppbevar lysbilder ved 4 ° C til bildebehandling.
  10. La lysbildene skal stabilisere seg til romtemperatur før bildebehandling. Tilegne fluorescerende bilder ved hjelp av en fase-kontrast mikroskop utstyrt for epifluorescence. Vanligvis kan hele dendrittiske arbor av en enkelt nervecelle bli tatt med en 20X objektiv og hensiktsmessige filtre.

8. Representative Resultater

Sympatiske nevronene dissosiert fra SCG av perinatale rotter og vokst i fravær av serum og ganglionic gliacellene unnlater å utvide MAP2 immunopositive prosesser (figur 1), men snarere typisk forlenge bare én aksonal prosess 14,15. Eksponering for BMP-7 (figur 1) eller Matrigel induserer dannelsen av mange prosesser som oppfyller de morfologiske, biokjemiske og funksjonelle kriterier for dendritter 17,18. Den dendrite-fremme aktivitet av enten Matrigel eller BMP-7 er konsentrasjon-og tidsavhengig 17,18,20. Maksimal dendrittiske veksten er observert ved hjelp av konsentrasjoner av Matrigel mellom 50 og 75 mikrogram / ml eller BMP-7 mellom 30 og 100 ng / ml, og halvt maksimale effektene er vanligvis observert på BMP-7 konsentrasjoner av ~ 2 ng / ml. Imidlertid kan betydelige endringer i dendrittiske vekst påvises med BMP-7 konsentrasjoner så lave som 300 pg / ml. Dendrittiske respons på enten Matrigel eller BMP-7 er relativt treg, med <50% av nervecellene danner en andre prosessinnen 24 timer etter eksponering for enten dendrite-fremme agent. Men innen 3 dager etter den første BMP-7 eksponering, praktisk talt alle nevronene reagerer på maksimalt effektiv Matrigel eller BMP-7 konsentrasjoner. Antallet dendritter per neurons fortsetter å øke med kontinuerlig eksponering til BMP-7, med det meste av endringen oppstår i løpet av de første 10 dagene av behandlingen. Etter 4 uker, BMP-7-behandlede nevroner har vanligvis 6-8 primære dendritter som utviser sekundære, universitets og selv Kvartær dendrittiske grener 17. Denne økningen i dendrittiske arbor forekommer i fravær av enhver vesentlig endring i aksonal vekst, og sammenlignbare dendrittiske responser kan utløses ved hjelp av tilsvarende konsentrasjoner av 2 fil fra BMP, 4, 5 eller 6 20,21. Dendrittiske vekst kan også utløses av co-dyrking sympatiske nevroner med endogene ganglionic gliacellene 15,22, men er den dendrittiske responsen betydelig tregere under disse forholdene.

Figur 1. BMP-7 fremmer dendrittiske vekst i dyrkede sympatiske nevroner. Ikke-nevronale celler ble eliminert fra SCG kulturer ved behandling med anti-mitotisk for 48 hr starten på dag to in vitro. Begynnelsen på dag 5 in vitro, ble kulturer behandlet med enten kontroll medium (A) eller medium suppleres med BMP-7 ved 50 ng / ml (B). På dag 11 in vitro (etter 5 dager med BMP behandling), ble kulturer immunostained med MAB mot MAP2, fant et protein hovedsakelig i dendritter og nevronale somata. Som vist i representative fluorescens photomicrographs, nerveceller dyrket under kontroll forhold mangler dendritter som gjenspeiles av mangel på MAP-2 immunopositive prosesser dendritter (A), i motsetning, neurons utsatt for BMP-7 (B) har vanligvis flere koniske MAP-2 immunopositive dendritter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fordelene med denne modellen inkluderer: (a) de kulturene består av en homogen befolkning av sympatiske nevroner blottet for andre celletyper 17,23, (b) de vekstfaktor kravene i sympatiske nevroner er godt etablert, som tillater bruk av definert medium, og en rekke definerte medier, og underlag fungerer godt for dyrking og opprettholde sympatiske nevroner 23, (c) nevroner i disse kulturene reagerer likt for den dendrite-fremme aktivitet Matrigel, BMP-7 og andre fil fra BMP av DPP og 60A underfamilier 17,18,20,21, og (d) Matrigel-eller BMP-indusert dendrite formasjonen forekommer i fravær av endringer i celle overlevelse eller aksonal vekst 17,18. Denne modellen gir eksperimentell kontroll over når dendrittiske vekst utløses, noe som gjør det mulig å få synkroniserte populasjoner av nerveceller i ulike stadier av dendrittiske vekst, f.eks umiddelbart forut for dannelsen av dendritter, under primær dendritogenesis (den første dannelsen av primære dendritter) og i senere stadier av dendrittiske modning. De viktigste begrensningene i modellen inkluderer begrensede mengder RNA og protein tilgjengelig fra en typisk disseksjon av et enkelt kull, noe som kan begrense biokjemiske studier, og noen problemer med å manipulere genuttrykk. Nylige fremskritt innen metoder for å uttrykke cDNA i primære nevronale cellekulturer er raskt overvinne denne sistnevnte ulempe. Det finnes publikasjoner rapportering vellykket bruk av lipid-baserte leveringssystemer, nucleofection og adenoviral vektorer til kultiverte sympatiske nevroner. De rapporterte transfeksjon effektivitet er relativt lav (vanligvis fra 10-20% med lipofection eller nucleofection og opp til 30-50% med viral infeksjon), som er tilstrekkelig for endepunkter basert på individuelle celle analyser, for eksempel morfologiske analyser, men kan være problematisk for mange biokjemiske endepunkter.

Faktorer that kan forstyrre BMP-indusert dendrittiske vekst i dyrkede sympatiske nevroner omfatter dyrking nervecellene på en meget høy celle tetthet og med serum i kulturen media. Mens årsaken til at høye celle tetthet minske dendrite-fremme aktivitet av en fil fra BMP er ikke kjent, er det sannsynlig at serum demper denne aktiviteten fordi en fil fra BMP binde ivrig til serumproteiner. Interessant, har serum seg svak dendrite-fremme aktivitet i dyrkede sympatiske nevroner 24, og våre foreløpige data tyder på at denne aktiviteten blir mediert av en fil fra BMP, som er tilstede i de fleste om ikke alle kommersielle sera. Fil fra BMP er også til stede i Matrigel, og sannsynligvis formidle sin dendrite-fremme aktivitet. En tredje faktor som kan påvirke dendrite-fremme aktivitet fil fra BMP er feilaktig håndtering og lagring av fil fra BMP. Ikke oppbevar BMP stamløsninger ved en konsentrasjon på mindre enn 0,1 mg / ml. Det er viktig å ikke la BMP lager eller jobber løsninger til å bli veldig grunnleggende, og vi anbefaler at BUFfers brukes til å fortynne stamløsninger ha en pH på 4,5 ± 0,05. Bland alle løsninger kraftig før aliquoting men ikke så kraftig at løsninger skum, og bare bruke polypropylen rør fordi en fil fra BMP tendens til å holde seg til annen plast. Ikke oppbevar alikvoter i frysere som har en automatisk avriming funksjon fordi sykling av temperaturer er tilstrekkelig til å ødelegge aktivitet av BMP-7. Det er sterkt anbefalt at BMP løsningene oppbevares ved -80 ° C og at fryse-tine være minimert (vi trenger ikke fryse-tine mer enn 2-3 ganger). Lignende forholdsregler bør brukes ved håndtering Matrigel. Dessuten anbefales det at Matrigel være langsomt tines ved 4 ° C. Matrigel vil ikke indusere dendrittiske vekst når den brukes til precoat underlag før plating nevroner, det er bare effektivt når de legges til kultur medium av etablerte nevrale cellekulturer 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Institutes of Health (tilskudd R21 NS45037 og R01 ES014901).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips Bellco Glass 1943-10012 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass
Bent tip pipets Bellco Glass 1273-50003
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899-100MG Stock solution 1 mg/ml
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 15230
Fine forceps Dumont no. 4 and 5 Fine Science Tools 11252-30 11241-30
20-gauge needles BD Biosciences 305176
Leibovitz’s L-15 medium Invitrogen 11415
Collagenase Worthington Biochemical 4176 1 mg/ml
Dispase Roche Group 04942078001 5 mg/ml
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) Invitrogen 14185-052
DMEM Low glucose Invitrogen 11885
L-Glutamine Invitrogen 25030 20 mM
Insulin/Transferrin/ Selenium Invitrogen 51500-056 100X
Fatty-acid free BSA Calbiochem 126609
NGF Harlan Laboratories 5017
Ham F-12 nutrient medium (F-12) Invitrogen 11765
Cytosine arabinoside Sigma-Aldrich C1768
Matrigel BD Biosciences 356234 Avoid repeated freeze-thaw cycles
BMP-7 R&D Systems 345-BP BMP7-07H BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Mouse anti-rat MAP2 antibody Sternberger Monoclonals Inc. SMI52 1/5000
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse Invitrogen A11003 1/10000
Mounting media Molecular Probes, Life Technologies P7481

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purpura, D. P. The Neurosciences: A Study Program. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. Rockefeller University Press. 372-393 (1967).
  2. Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
  3. Purves, D. A Trophic Theory of Neural Connections. Harvard University Press. (1988).
  4. Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
  5. Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
  6. Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
  7. Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
  8. Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
  9. Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
  10. Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
  11. de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
  12. Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
  13. Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
  14. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
  15. Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
  16. Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
  17. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
  18. Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
  19. Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. The MIT Press. 177-295 (1991).
  20. Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
  21. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
  22. Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
  23. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 177-205 (1991).
  24. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics