Inducir el crecimiento dendríticas en las neuronas simpáticas cultivadas

Neuroscience

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Summary

Se describe un protocolo para el uso de la proteína morfogenética ósea-7 (BMP-7) o Matrigel para inducir de manera selectiva el crecimiento dendrítico en la enseñanza primaria neuronas simpáticas disociadas de los ganglios cervical superior (SCG) de las ratas perinatales.

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Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P. J. Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons. J. Vis. Exp. (61), e3546, doi:10.3791/3546 (2012).

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Abstract

La forma de la dendrítica cenador determina el total de entrada sináptica una neurona puede recibir 1-3, e influye en los tipos y la distribución de estas entradas 4-6. Alteración de los patrones de crecimiento dendrítico y la plasticidad se asocia con alteración de la función neuroconductual en modelos experimentales, 7, y se cree que contribuyen a los síntomas clínicos observados en los dos 8-10 trastornos del desarrollo neurológico y enfermedades neurodegenerativas 11-13. Estas observaciones ponen de relieve la importancia funcional de, precisamente, la regulación de la morfología dendrítica, y sugieren que la identificación de los mecanismos que controlan el crecimiento dendrítico no sólo avanzar en la comprensión de cómo la conectividad neuronal está regulada durante el desarrollo normal, pero también puede dar una idea de nuevas estrategias terapéuticas para diversas enfermedades neurológicas.

Estudios sobre el mecanismo de crecimiento dendrítico se vería enormemente facilitada por la disponibilidad oFA modelo de sistema que permite que las neuronas de forma experimental pasó de un estado en el que no se extienden a las dendritas de aquel en el que la elaboración de un jardín dendríticas comparable a la de sus homólogos en vivo. Los cultivos primarios de neuronas simpáticas disociadas de los ganglios cervical superior (SCG) de roedores perinatales proporcionar ese modelo. Cuando se cultiva en un medio definido en la ausencia de células gliales de suero y ganglionar, las neuronas simpáticas extender un único proceso que es axonal, y este estado unipolar persiste durante semanas o meses en cultivo 14,15. Sin embargo, la adición de proteína morfogenética ósea-7 (BMP-7) o 16,17 Matrigel 18 al medio de cultivo desencadena estas neuronas para extender múltiples procesos que cumplen los criterios morfológicos y bioquímicos y funcionales para dendritas. Las neuronas simpáticas disociadas de la SCG de los roedores perinatales y cultivadas bajo condiciones definidas son una población homogénea de las neuronas 19que respondan de manera uniforme a la actividad de las dendritas se promociona de Matrigel, BMP-7 y otras BMPs de la decapentaplegic (DPP) y 60A subfamilias 17,18,20,21. Es importante destacar que Matrigel y BMP-inducida dendrita formación se produce en ausencia de cambios en la supervivencia de las células o el crecimiento axonal 17,18.

Aquí se describe cómo configurar cultivos disociados de neuronas simpáticas derivadas de la SCG perinatales de las ratas para que sean sensibles a los selectivos de la dendrita de promoción de la actividad de Matrigel o BMP.

Protocol

1. Preparación del medio de cultivo (medio C2)

  1. Añadir el siguiente, en el orden indicado, a una estéril, desechable matraz Erlenmeyer de 500 ml:
    Cantidad Componente La concentración final
    190 ml DMEM (glucosa baja) N / A
    10 ml de ácidos grasos libres de BSA (20mg/ml en DMEM) 50 g / ml
    2,8 ml L-glutamina 1,4 mM
    4 ml insulina / transferrina / selenio (100 veces) 10 ug / ml de insulina 5,5 g / ml de transferrina 38,7 nM selenio
    0,4 ml NGF (125 ug / ml) 100 ng / ml
    200 ml Ham F-12 N / A
  2. Agitar suavemente to de la mezcla y alícuota de 10 ml por tubo de 17 x 100 tubos estériles Cap Snap.
  3. Almacenar a -80 ° C
  4. Notas importantes:
    • Descongele NGF inmediatamente antes de su uso.
    • Antes de alícuotas de la solución madre de NGF, precapa las paredes interiores del cultivo de tejidos de plástico pipeta serológica con la proteína para minimizar la adherencia de NGF para el plástico. Más sencillo es Pipetear la mezcla DMEM que contenía varias veces BSA. Enjuague el tubo de NGF en varias ocasiones con la mezcla de DMEM.
    • Añadir F-12 pasado debido a cisteína libre puede desestabilizar los enlaces disulfuro de la insulina.
    • No congele en volúmenes superiores a 10 ml por CaPO4 cristales se pueden formar
    • No congelar y descongelar medio de C2 más de 2 veces.

2. Preparación de cubreobjetos de vidrio

  1. Hemos encontrado que cubreobjetos alemanes sólo finas de vidrio trabajar de forma constante en este protocolo (ver Tabla 1 para la fuente recomendada y el número de catálogo).
  2. Añadir 75-100 ml de 70% de ácido nítrico y 300 ml frascos de muestras de vidrio con revestimiento de politetrafluoroetileno (PTFE tapa o teflón) (catálogo de Fisher # 09-911-765).
  3. El uso de guantes, la caída de cubreobjetos uno por uno en la solución de ácido nítrico. Añadir cubreobjetos suficientes para hacer una capa de no más de 2-3 cubreobjetos de espesor en la parte inferior de la jarra.
  4. Agite con cuidado los recipientes con los cubreobjetos durante 6-8 horas a temperatura ambiente en un conjunto agitador orbital durante no más de 185 rpm.
  5. Trabajar en una campana extractora, cuidado decantar el ácido y disponer de acuerdo a las regulaciones locales. Enjuagar cubreobjetos una vez con ultra-pura de cultivo de tejido de grado agua, a continuación, añadir 75-100 ml de agua al recipiente. Cubreobjetos puede enjuagarse varias veces si el agua se vuelve turbia. Agite suavemente a temperatura ambiente durante la noche en un conjunto agitador orbital para no más de 185 rpm.
  6. Repetir la secuencia anterior de ácido nítrico / cultivo de tejido de grado agua diariamente para un total de 3 días.
  7. Decantar la finalde cultivo de tejidos de calidad del agua y agregar la acetona suficiente para cubrir apenas los cubreobjetos.
  8. Decantar la acetona y desechar correctamente.
  9. Transferir a un cubreobjetos de vidrio de 150 mm de placa de Petri. Añadir acetona suficiente para cubrir apenas los cubreobjetos. Asegurar los cubreobjetos están en una sola capa en el plato.
  10. Permita que la acetona se evapore durante la noche en una campana extractora.
  11. Hornee cubreobjetos en un horno de secado a 180 ° C durante 1,5 horas para esterilizar.

3. Preparación de Cubreobjetos para la Cultura

  1. El día antes de la disección, añadir 1 vaso cubreobjetos (preparado como se ha descrito anteriormente) a cada pocillo de una placa 24 de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril. Añadir 200 l de estéril poli-D-lisina solución (100 mg / ml en tampón 0,5 M Tris, pH 8) a cada pocillo y almacenar la placa a 4 ° C durante la noche.
  2. El día de la disección, e, idealmente, antes de comenzar la disección, se aspira la solución de poli-D-lisina de cada pozo y lave cada pocillo 5 vecescon agua estéril de grado de cultivo de tejidos.
  3. Añadir 200 l DMEM bajo en glucosa para cada plato y guárdelo en 37 ° C incubadora. Aproximadamente 1 hora antes de células en placas, eliminar DMEM bajo en glucosa y añadir 250 l medio C2 por pocillo. Tienda de placas a 37 ° C por debajo del 5% de CO 2 hasta que las células están listas para ser plateado.

4. La disección y aislamiento del ganglio cervical superior

  1. Cultivos disociados de neuronas simpáticas suelen ser preparados por la disociación de ganglio cervical superior (SCG) cosechado desde la etapa prenatal (días embrionarias 19-21) crías de ratas debido a que hay menos células gliales. Sin embargo, este mismo protocolo puede ser utilizado con éxito con las primeras crías de rata postnatal (1 a 3 días de edad) o de crías de ratón perinatales.
  2. La eutanasia de ratas preñadas a través de inhalación de CO 2. Afeitar el abdomen y lavar la piel con etanol al 70%. Quitar los cuernos uterinos en condiciones estériles y poner los cuernos uterinos en un recipiente estéril plato de 150 mm de Petri. Evitardaños en los intestinos u otros órganos internos de la presa durante la disección.
  3. Coloque la placa de Petri con los cachorros sobre una cacerola de hielo para anestesiar a los cachorros embrionarias. Diseccionar los embriones libres de la trompa uterina y de las membranas amnióticas. Cortar el cordón espinal de cada cachorro lo largo de la línea media por debajo del hombro a la eutanasia de los cachorros. Esto también se corta la vena cava, lo que reduce el sangrado de la arteria carótida durante la disección de la SCG. Una vez disecada libre del cuerno uterino, los embriones en un lugar estéril Leibovitz medio L-15 (o cualquier otro medio de aire-buffer), complementado con penicilina y estreptomicina.
  4. Colocar los embriones en sus espaldas en una placa de Petri de 150 mm de media llena de Sylgard. Uso de agujas de calibre 20 estériles, fijar el tórax y la cabeza, suavemente la hiperextensión del cuello, lo que facilita la disección de la SCG.
  5. Hacer una incisión a lo largo del cuello a la altura de las clavículas para revelar las glándulas submandibulares. Retire las glándulas utilizando unas pinzas finas (nO. 4 o no. 5 Dumont) para exponer la capa muscular.
  6. Utilice las pinzas finas para cortar el músculo esternocleidomastoideo, cerca de la clavícula. A continuación, levante con cuidado y la incisión en el músculo omohioideo al lado de la tráquea. Este músculo es muy fina, por lo que evitar que se corte demasiado profundo para evitar que se rompa la arteria carótida subyacente y el CGS. Una vez que estas capas musculares se eliminan, la arteria carótida y el nervio vago, debe ser claramente visible.
  7. La SCG se encuentra justo debajo de la bifurcación de la arteria carótida. Con unas pinzas finas (N ° 4 o n º 5.), Embotar disecar el tejido de distancia de ambos lados de la arteria carótida para exponer el ganglio. Usando 2 pinzas finas, sujete la arteria carótida justo por encima y por debajo de los extremos rostral y caudal de la SCG, respectivamente, para eliminar la sección de la arteria carótida se extiende por encima de la SCG, así como la propia CGS. Es probable que el ganglio nudoso, que se encuentra junto a la SCG en esta etapa de desarrollo, también se eliminará en este paso. El ganglio nudoso puede ser identifiéd por su forma redondeada y el nervio vago grande que sobresale de ella. Esta se encuentra en una de las ramas de la arteria carótida. En contraste, el SCG es almendrada y se encuentra directamente debajo de la bifurcación de la arteria carótida. Coloque el tejido diseccionado en una placa de cultivo estéril 35 mm que contiene medio L-15 y antibióticos. Retire el SCG de todos los cachorros antes de pasar a los pasos siguientes.
  8. Con unas pinzas finas, con cuidado separar el SCG de la arteria carótida y los otros tejidos extirpados durante la disección (en particular, el nervio vago y el ganglio nodoso). Use unas pinzas finas para extraer la cápsula de los ganglios. Esto reduce considerablemente el número de células no neuronales en cultivo. Transferir los ganglios a otro plato mm estéril 35 que contiene medio L-15.
  9. Para disociar el SCG, eliminar el medio L-15 y sustituir con colagenasa 2 ml (concentración final de 1 mg / ml) / dispasa (concentración final de 5 mg / ml) en calcio y magnesio libre de Hank solución salina equilibrada. IncubaTE a 37 ° C durante 40 minutos.
  10. Transferir el CGS a una estéril 15 ml tubo de centrífuga cónico y llevar el volumen hasta 10 ml con L-15 suplementado con BSA (concentración final de 1-2 mg / ml). Centrifugar a 200 xg, a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se desecha el sobrenadante y lavar una vez más con L-15 suplementado con BSA.
  11. Después del segundo lavado, retire todo el L-15 y volver a suspender los ganglios en el ~ 2 ml de medio de C2. Se tritura las células utilizando un pulido al fuego doblada punta de la pipeta, asegurarse de que la pipeta se recubre con BSA/L15 antes de trituración para reducir al mínimo la adherencia de las células al vidrio. Se tritura veces suavemente 3-4. Que los grumos grandes reposar alrededor de 1 minuto y transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml. Añade más medios a la SCG C2 restante y triturar. Después de dejar que los grupos un acuerdo, transferir la suspensión celular a partir de la trituración segundo a la recogida después de la primera trituración. Repita este proceso varias veces hasta que los ganglios son en su mayoría disociada. Discard los grumos que quedan después de la trituración cuarto.
  12. Para disociar las células de una camada de crías de rata (normalmente 12-16 crías), llevar el volumen total de medio en la suspensión celular a 8-10 ml mediante la adición de más medio de C2. Resuspender las células por medio de una pipeta y eliminar una pequeña alícuota para determinar la densidad celular. Ajustar el volumen de la suspensión celular para lograr 2X la densidad celular deseada en el cultivo y, a continuación, asegurándose de mantener las células en suspensión, alícuota de 250 ml de suspensión de células por pocillo. Para los estudios morfométricos del crecimiento dendrítico, por lo general las células de la placa a baja densidad (~ 5 x 10 4 células por pocillo) en placas de 24 pocillos.
  13. Nuestro laboratorio de incubación, las culturas SCG en desecadores de vidrio en lugar de hacerlo directamente en una incubadora de CO 2. Hacemos esto porque las neuronas simpáticas cultivadas en medio libre de suero funcionan mejor con un poco más alto de CO 2 en la concentración (aproximadamente el 6,5%). Además no utilizamos antibióticos en olos medios de comunicación ur ya que inhibe el crecimiento neurítico y las culturas que mantienen en los desecadores parece minimizar la dispersión de la contaminación si se desarrolla en un subconjunto de las culturas. El uso de este sistema, que están configurados para mantener las culturas SCG durante un máximo de 8 semanas. Una vez chapados, culturas SCG se colocan en la placa de desecador porcelana en desecadores de vidrio que contienen agua estéril en la parte inferior. Aproximadamente 120 ml de CO 2 se inyecta en el desecador antes de sellar la cerró y colocando el desecador entero en una incubadora de 35,5 ° C.

5. La alimentación y el mantenimiento de las Culturas

  1. Los cultivos se alimentan por lo general 3 veces por semana, con el primer cambio de los medios de comunicación se producen 24 horas después de placas. Usando un estéril doblada punta de la pipeta, retirar suavemente alrededor de la mitad de los medios por pocillo. Con un paño limpio estéril doblada punta de la pipeta, reemplazar el volumen de medio de eliminar con un nuevo C2.
  2. Para eliminar las células no neuronales de la cultura, el agente anti-mitótico cytosine-D-arabinofuranosido (ARA-C, la concentración final de 1-2 M) se añade típicamente al medio de cultivo en el primer intercambio de medios (por ejemplo, 24 horas después de placas) durante 48 horas. Esta concentración de ARA-C es generalmente suficiente para eliminar todas las células no neuronales. Si, además de ARA-C se requiere tratamiento, se recomienda que se hace de cada comida para minimizar los efectos tóxicos sobre las neuronas.

6. Inducir el crecimiento dendrítico con Matrigel o BMP-7

  1. Para inducir el crecimiento dendrítico, Matrigel o BMP-7 se añade a los cultivos después de las células no neuronales han sido eliminados y ARA-C en los cultivos se reducen significativamente. Típicamente, se añade Matrigel o BMP-7 para el medio en el día 5 in vitro, pero el crecimiento dendrítico puede ser inducida por Matrigel o BMP 7-añadirse en cualquier punto de tiempo in vitro. Matrigel o BMP-7 se añade al medio de C2 y cultivos se alimentan como se describió anteriormente.
  2. Matrigel crecimiento y BMP-dendríticas inducida es tiempoy dependiente de la concentración. Para los efectos máximos, Matrigel se añade a C2 a una concentración final de 50-75 g / ml; BMP-7 se añade al medio de C2 en una concentración final de 50 ng / ml. Las concentraciones de Matrigel mayor que 100 mg / ml o BMP-7 concentraciones superiores a 100 ng / ml se han observado para causar toxicidad neuronal. Procesos dendríticos (como se determina por criterios morfológicos) resultarán evidentes de aproximadamente 48 horas después de la exposición inicial a Matrigel o BMP-7 en concentraciones eficaces al máximo. Para inducir el crecimiento dendrítico robusta, las culturas se alimentan con BMP-7 que contiene el medio en cada alimentación. Resultados equivalentes se han obtenido utilizando BMP 2, 4, 5 y 6 a concentraciones comparables 20,21.

7. Análisis inmunocitoquímico de crecimiento dendrítico BMP-7-inducida

  1. Cuando el grado deseado de arborización dendrítica se ha logrado, los cultivos se fija mediante paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M. La mejor fijación es unaLOGRADOS reemplazando la mitad del medio en el pozo con paraformaldehído al 4% y repitiendo este paso 3-5 veces durante 10-15 minutos.
  2. Enjuagar cultivos mediante la sustitución de la mitad del paraformaldehído al 4% con tampón fosfato salino (PBS) y repitiendo este paso tres veces durante 10 - 15 minutos.
  3. Eliminar todo el PBS y añadir 200 l 0,1% de Triton X-100 en PBS a cada pocillo durante 5 minutos a temperatura ambiente para permeabilizar las células.
  4. Retire la solución de Triton por aspiración y añadir 200 ml por pocillo de la solución tampón de bloqueo (PBS suplementado con 5.3% de BSA y 1% de suero de cabra). Incubar durante 20-30 minutos a temperatura ambiente.
  5. Retire el amortiguador de bloqueo y añadir el anticuerpo primario, asociada a los microtúbulos de proteínas-2 (MAP2) diluido a 1:2000 - 1:5000 en tampón de bloqueo. Incubar cultivos durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
  6. Eliminar la solución de anticuerpo primario, se lavan los cultivos con PBS tres veces durante 15 minutos a temperatura ambiente.
  7. Los cultivos se incuban con el anticuerpo secundario diluido en PBS suplementado con 1% de BSA durante 1-2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.
  8. Eliminar la solución de anticuerpo secundario y lavar los cultivos con PBS tres veces durante 10-15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
  9. Cubreobjetos montaje sobre vidrio se desliza lado celda hacia abajo en una gota de medio de montaje acuoso al pH apropiado para el fluorocromo etiquetados con el anticuerpo secundario. Mantener las diapositivas a temperatura ambiente durante la noche para permitir que el medio de montaje en seco. Diapositivas se almacena a 4 º C hasta que la imagen.
  10. Deje que los portaobjetos alcancen la temperatura ambiente antes de la exploración. Adquirir imágenes fluorescentes usando un microscopio de contraste de fases equipado para epifluorescencia. Por lo general, el eje dendríticas completo de una sola neurona puede ser capturado utilizando un objetivo de 20X y filtros adecuados.

8. Los resultados representativos

Las neuronas simpáticas disociadas de la SCG de ra perinatalts y crecido en ausencia de células gliales de suero y ganglionar no se pueden extender MAP2 procesos inmunopositivas (Figura 1), sino más bien, típicamente se extienden sólo un único proceso axonal 14,15. La exposición a BMP-7 (Figura 1) o Matrigel induce la formación de numerosos procesos que cumplen los criterios morfológicos, bioquímicos y funcionales de dendritas 17,18. La actividad promotora de dendrita de cualquiera de Matrigel o BMP-7 es la concentración y 17,18,20 dependiente del tiempo. Crecimiento dendrítico máxima se observó utilizando concentraciones de Matrigel entre 50 y 75 ug / ml o BMP-7 entre 30 y 100 ng / ml, y los efectos medio-máximos se observan típicamente en BMP-7 concentraciones de ~ 2 ng / ml. Sin embargo, los cambios significativos en el crecimiento dendrítico puede ser detectado con BMP-7 concentraciones tan bajas como 300 pg / ml. La respuesta a cualquiera de Matrigel dendríticas o BMP-7 es relativamente lento, con <50% de las neuronas formando un segundo proceso dentro de las 24 horas después de la exposición a cualquiera de dendrita-p romover agente. Sin embargo, dentro de 3 días después de la inicial BMP-7 de la exposición, prácticamente todas las neuronas responden a la máxima eficacia de Matrigel o concentraciones BMP-7. El número de dendritas por neuronas continúa aumentando con la exposición continua a BMP-7, con la mayor parte del cambio que se produce durante los primeros 10 días de tratamiento. Después de 4 semanas, BMP-7-tratados con neuronas tienen típicamente 6-8 dendritas primarias que exhiben las ramas secundarias, terciarias y cuaternarias dendríticas incluso 17. Este aumento en la cenador dendríticas se produce en ausencia de cualquier cambio significativo en el crecimiento axonal, y las respuestas comparables dendríticas puede ser obtenido utilizando concentraciones similares de BMP 2, 4, 5 o 6 20,21. El crecimiento dendrítico también puede ser provocada por el cultivo de las neuronas simpáticas cooperación con endógenos células ganglionares 15,22 gliales, sin embargo, la respuesta dendríticas es significativamente más lento en estas condiciones.

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Figura 1. BMP-7 promueve el crecimiento dendrítico en cultivos de neuronas simpáticas. Las células no neuronales fueron eliminados de CGS cultivos por tratamiento con anti-mitótico de inicio de 48 horas en el día 2 in vitro. Comenzando el día 5 in vitro, los cultivos fueron tratados con medio de control (A) o medio suplementado con BMP-7 a 50 ng / ml (B). El día 11 in vitro (después de 5 días de tratamiento BMP), las culturas se immunostained con el anticuerpo monoclonal contra la MAP2, una proteína que se encuentra principalmente en las dendritas y somata neuronal. Como se muestra en representativos fotomicrografías de fluorescencia, las neuronas cultivadas bajo condiciones de control carecen de dendritas como se evidencia por la falta de MAP-2 dendritas procesos inmunopositivas (A), en contraste, las neuronas expuestas a BMP-7 (B) tienen típicamente varios cónica MAPA-2 inmunopositivos dendritas.

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Discussion

Las ventajas de este modelo incluyen: (a) los cultivos se compone de una población homogénea de las neuronas simpáticas desprovistos de otros tipos de células 17,23; (b) los requisitos del factor de crecimiento de las neuronas simpáticas son bien establecido, que permite el uso de un medio definido, y una variedad de medios definidos, y sustratos funcionan bien para el cultivo y el mantenimiento de las neuronas simpáticas 23, (c) las neuronas en estos cultivos responder de manera uniforme a la actividad dendrita-promovido de Matrigel, BMP 7-BMP y otros de la DPP y 60A subfamilias 17,18,20,21, y (d) Matrigel o BMP-inducida dendrita formación se produce en ausencia de cambios en la supervivencia de las células o el crecimiento axonal 17,18. Este modelo permite el control experimental de que el crecimiento dendrítico se activa, que hacen posible la obtención de las poblaciones de neuronas sincronizados en distintas etapas de crecimiento dendrítico, por ejemplo, inmediatamente antes de la formación de dendritas, durante dendr primariaitogenesis (la formación inicial de dendritas primarias) y durante las etapas posteriores de la maduración dendríticas. Las limitaciones más significativas del modelo incluyen las cantidades limitadas de ARN y proteína disponible a partir de una disección típica de una sola camada, que pueden restringir estudios bioquímicos, y cierta dificultad en la manipulación de la expresión génica. Los recientes avances en las técnicas para expresar ADNc en cultivos primarios de células neuronales son rápidamente superar esta desventaja último. Hay publicaciones que describen la aplicación exitosa de sistemas de entrega basados ​​en lípidos, los nucleofection y de vectores de adenovirus en cultivos de neuronas simpáticas. Las eficiencias de transfección reportados son relativamente bajos (normalmente entre un 10-20% con lipofección o nucleofection y hasta un 30-50% con una infección viral), lo cual es adecuado para los puntos finales basados ​​en el análisis de células individuales, tales como los análisis morfológicos, pero puede ser problemático para muchas variables bioquímicas.

Factores del that puede interferir con la BMP-inducida por el crecimiento dendrítico en cultivos de neuronas simpáticas incluyen el cultivo de las neuronas a una densidad celular muy alta e incluyendo suero en los medios de cultivo. Aunque la razón de que la densidad celular alta atenúa la actividad dendrita-promovido de BMP no se sabe, es probable que el suero atenúa debido a esta actividad BMP unen ávidamente a las proteínas séricas. Curiosamente, el suero en sí tiene debilidad dendrita-promoción de la actividad en cultivos de neuronas simpáticas de 24, y nuestros datos preliminares sugieren que esta actividad está mediada por BMP, que están presentes en la mayoría si no todos los sueros comerciales. BMP también están presentes en Matrigel, y es probable que mediar en la dendrita-promoción de la actividad. Un tercer factor que puede afectar a la actividad de las dendritas-promovido de las BMP es un manejo inadecuado y el almacenamiento de las BMP. No almacene soluciones BMP de stock en una concentración de menos de 0,1 mg / ml. Es importante no dejar de archivo BMP o soluciones de trabajo a ser muy básico y se recomienda que bufFERS usados ​​para diluir soluciones madre tiene un pH de 4,5 ± 0,05. Mezclar todas las soluciones de fuerza antes de alícuotas, pero no con tanta fuerza que la espuma de las soluciones, y sólo utilizan tubos de polipropileno, porque BMP tienden a adherirse a otros plásticos. No almacenar en alícuotas congeladores que tienen una función de descongelación automática debido a que el ciclo de temperaturas es suficiente para destruir la actividad de BMP-7. Se recomienda encarecidamente que las soluciones BMP se guardan a -80 ° C y que la congelación-descongelación ser minimizado (no congelar y descongelar más de 2-3 veces). Precauciones similares deben ser utilizados en el manejo de Matrigel. Además, se recomienda que Matrigel descongelarse lentamente a 4 ° C. Matrigel no inducir el crecimiento dendrítico cuando se utiliza para sustratos precapa antes de neuronas galvanoplastia, sino que sólo es eficaz cuando se añade al medio de cultivo de cultivos de células neuronales establecidas 18.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (subvenciones R21 NS45037 y ES014901 R01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips Bellco Glass 1943-10012 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass
Bent tip pipets Bellco Glass 1273-50003
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899-100MG Stock solution 1 mg/ml
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 15230
Fine forceps Dumont no. 4 and 5 Fine Science Tools 11252-30 11241-30
20-gauge needles BD Biosciences 305176
Leibovitz’s L-15 medium Invitrogen 11415
Collagenase Worthington Biochemical 4176 1 mg/ml
Dispase Roche Group 04942078001 5 mg/ml
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) Invitrogen 14185-052
DMEM Low glucose Invitrogen 11885
L-Glutamine Invitrogen 25030 20 mM
Insulin/Transferrin/ Selenium Invitrogen 51500-056 100X
Fatty-acid free BSA Calbiochem 126609
NGF Harlan Laboratories 5017
Ham F-12 nutrient medium (F-12) Invitrogen 11765
Cytosine arabinoside Sigma-Aldrich C1768
Matrigel BD Biosciences 356234 Avoid repeated freeze-thaw cycles
BMP-7 R&D Systems 345-BP BMP7-07H BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Mouse anti-rat MAP2 antibody Sternberger Monoclonals Inc. SMI52 1/5000
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse Invitrogen A11003 1/10000
Mounting media Molecular Probes, Life Technologies P7481

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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