Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques

Neuroscience

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Summary

Nous décrivons un protocole pour l'utilisation de protéines morphogénétiques osseuses-7 (BMP-7) ou Matrigel pour induire sélectivement la croissance dendritique dans les neurones sympathiques dissociés primaires des ganglions cervicaux supérieurs (SCG) de rats périnatales.

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Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P. J. Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons. J. Vis. Exp. (61), e3546, doi:10.3791/3546 (2012).

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Abstract

La forme de la dendritique arbre détermine l'apport total synaptique d'un neurone peut recevoir 1-3, et influe sur les types et la distribution de ces intrants 4-6. Modification des modes de croissance dendritique et la plasticité sont associés à la fonction neurocomportementale avec facultés affaiblies dans les modèles expérimentaux 7, et sont pensés pour contribuer à des symptômes cliniques observés dans les deux troubles neurodéveloppementaux 8-10 et les maladies neurodégénératives 11-13. Ces observations soulignent l'importance fonctionnelle de la régulation précisément la morphologie dendritique, et suggèrent que l'identification des mécanismes qui contrôlent la croissance dendritique ne sera pas seulement faire progresser la compréhension de la façon dont la connectivité neuronale est régulée au cours du développement normal, mais peut également donner un aperçu sur les nouvelles stratégies thérapeutiques pour diverses maladies neurologiques.

Des études mécanistiques de la croissance dendritique serait grandement facilitée par la disponibilité osystème modèle FA qui permet aux neurones à titre expérimental est passé d'un état ​​dans lequel ils ne s'étendent pas aux dendrites celui dans lequel ils élaborent un arbre dendritique comparable à celle de leur homologues dans les in vivo. Les cultures primaires de neurones sympathiques dissociés de ganglions cervicaux supérieurs (SCG) de rongeurs périnatales fournir un tel modèle. Lorsqu'elle est cultivée dans un milieu défini en l'absence de sérum et les cellules gliales ganglionnaire, les neurones sympathiques d'étendre un processus unique qui est axonale, et cet état ​​persiste pendant unipolaire semaines à plusieurs mois dans la culture 14,15. Cependant, l'ajout de protéines soit morphogénétique osseuse-7 (BMP-7) 16,17 ou 18 à Matrigel le milieu de culture déclenche ces neurones d'étendre les processus multiples qui répondent aux critères morphologiques, biochimiques et fonctionnelles pour les dendrites. Neurones sympathiques dissociés de la CTB de rongeurs périnatales et cultivés dans des conditions définies sont une population homogène de neurones 19qui répondent de manière uniforme à l'activité dendrite-promotion de Matrigel, BMP-7 et autres PGB de la decapentaplegic (DPP) et 60A sous-familles 17,18,20,21. Important, le Matrigel-et BMP-induite dendrite formation se produit en l'absence de changements de la survie des cellules ou la croissance des axones 17,18.

Ici, nous décrivons comment mettre en place des cultures dissociées de neurones sympathiques provenant de la CTB de rats périnatales afin qu'ils soient adaptés à l'sélective dendrite-promotion de l'activité de Matrigel ou MPG.

Protocol

1. Préparation du milieu de culture (milieu C2)

  1. Ajoutez les lignes suivantes, dans l'ordre indiqué, à un stérile, flacon de 500 ml à usage unique Erlenmeyer:
    Montant Composant Concentration finale
    190 ml DMEM (faible taux de glucose) N / A
    10 ml acides gras libres BSA (20mg/ml dans du DMEM) 50 pg / ml
    2,8 ml L-glutamine 1,4 mM
    4 ml l'insuline / transferrine / sélénium (100x) 10 pg / ml d'insuline 5,5 ug / ml de transferrine 38,7 nM sélénium
    0,4 ml NGF (125 pg / ml) 100 ng / ml
    200 ml Ham F-12 N / A
  2. Agiter doucement to mélange et aliquote de 10 ml par tube en 17 x 100 tubes stériles Snap Cap.
  3. Conserver à -80 ° C
  4. Notes importantes:
    • Décongeler NGF immédiatement avant utilisation.
    • Avant aliquotage la solution mère NGF, précouche les parois intérieures de la culture tissulaire pipette sérologique plastique avec une protéine de minimiser le collage de NGF au plastique. Approche la plus simple est de pipette le mélange DMEM contenant les temps BSA plusieurs. Rincer le tube du NGF à plusieurs reprises avec le mélange DMEM.
    • Ajouter F-12 dernier parce que la cystéine libre peut déstabiliser des ponts disulfures de l'insuline.
    • Ne pas congeler des volumes supérieure à 10 ml parce CAPO 4 cristaux peuvent se former
    • Ne pas congeler et décongeler à moyen C2 plus de 2 fois.

2. Préparation de Lamelles de verre

  1. Nous avons constaté que seulement fines lamelles de verre allemands travaillent constamment dans le présent protocole (voir le tableau 1 pour la source recommandée et le numéro de catalogue).
  2. Ajouter de 75 à 100 ml d'acide nitrique de 70% à 300 ml bouteilles en verre spécimen avec polytétrafluoroéthylène (PTFE doublures couvercle ou du Téflon) (catalogue Fisher # 09-911-765).
  3. Le port de gants, baisse Lamelles un par un dans la solution d'acide nitrique. Ajouter les lamelles de quoi faire une couche de pas plus de 2-3 lamelles d'épaisseur sur le fond du pot.
  4. Secouez doucement les contenants avec les lamelles de 6-8 heures à température ambiante sur un ensemble agitateur orbital pendant pas plus de 185 tours par minute.
  5. Travailler dans une hotte, décanter avec précaution l'acide et éliminer conformément aux réglementations locales. Rincer une fois avec des lamelles ultra-pur de culture de tissu de qualité de l'eau, puis ajouter de 75 à 100 ml d'eau au récipient. Lamelles peut être rincé à plusieurs reprises si l'eau devient trouble. Agitez doucement à température ambiante pendant une nuit sur un ensemble agitateur orbital sans rpm plus de 185.
  6. Répétez la séquence ci-dessus de l'acide nitrique / la culture de tissus de qualité de l'eau tous les jours pour un total de 3 jours.
  7. Décanter la finaleculture de tissus de qualité de l'eau et ajouter l'acétone suffisante pour couvrir à peine les lamelles.
  8. Décanter ce acétone et éliminer correctement.
  9. Transfert des lamelles dans un plat en verre de Petri de 150 mm. Ajouter l'acétone suffisante pour couvrir à peine les lamelles. S'assurer que les lamelles sont en une seule couche dans le plat.
  10. Permettre à l'acétone de s'évaporer du jour au lendemain dans une hotte.
  11. Lamelles Faire cuire dans un four de séchage à 180 ° C pendant 1,5 heures à stériliser.

3. Préparation des lamelles de la Culture

  1. La veille de la dissection, ajoutez 1 verre (préparé comme décrit ci-dessus) lamelle dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire 24 puits en utilisant une technique stérile. Ajouter 200 ul de solution stérile de poly-D-lysine solution (100 mg / ml dans 0,5 M de tampon Tris, pH 8) à chaque puits et de stocker la plaque à 4 ° C pendant la nuit.
  2. Le jour de la dissection, et, idéalement, avant de commencer la dissection, aspirer la solution de poly-D-lysine de chaque puits et laver chaque puits 5 foisavec de l'eau de qualité stérile de culture de tissus.
  3. Ajouter 200 ul bas-glucose DMEM à chaque plaque et un magasin à 37 ° C incubateur. Environ 1 heure avant étalement des cellules, enlever faible du glucose DMEM et ajouter 250 ul moyennes C2 par puits. Plaques doivent être stockées à 37 ° C sous 5% de CO 2 jusqu'à ce que les cellules sont prêtes à être plaquée.

4. Dissection et isolement du ganglion cervical supérieur

  1. Cultures dissociées de neurones sympathiques sont généralement préparés par dissociation de ganglions cervicaux supérieurs (SCG) a récolté depuis la période prénatale (jours embryonnaires 19-21) chez le jeune rat parce qu'il ya moins de cellules gliales. Toutefois, ce même protocole peut être utilisé avec succès avec des petits postnatale précoce chez le rat (1 à 3 jours) ou souriceaux périnatales.
  2. Euthanasier rate gestante via inhalation de CO 2. Rasage de l'abdomen et laver la peau avec de l'éthanol 70%. Retirez les cornes utérines dans des conditions stériles et placer les cornes utérines dans un récipient stérile de 150 mm de Petri. Éviterendommager les intestins ou d'autres organes internes du barrage au cours de la dissection.
  3. Placez la boîte de Pétri avec les chiots dans un bac de glace pour anesthésier les chiots embryonnaires. Disséquer les embryons indemnes de la corne utérine et les membranes amniotiques. Couper la moelle épinière de chaque chiot le long de la ligne médiane sous l'épaule pour euthanasier les chiots. Cette rompt aussi la veine cave, ce qui réduit les saignements de l'artère carotide lors de la dissection de la CTB. Une fois disséqué de la corne utérine, les embryons les placer dans un stérile Leibovitz milieu L-15 (ou tout autre moyen de l'air-buffered) complété avec de la pénicilline et la streptomycine.
  4. Placer les embryons sur le dos sur un plat de Pétri de 150 mm à moitié rempli d'Sylgard. En utilisant des aiguilles de calibre 20 stériles, épingler le thorax et la tête, doucement hyperextension du cou, ce qui facilite la dissection de la CTB.
  5. Faire une incision médiane le long du cou au niveau des clavicules pour révéler les glandes sous-maxillaires. Retirer les glandes à l'aide de pinces fines (no. 4 ou pas. 5 Dumont) pour exposer la couche musculaire.
  6. Utilisez les pinces fines pour couper le muscle sterno près de la clavicule. Puis soulevez doucement et inciser le muscle omo-hyoïdien à côté de la trachée. Ce muscle est très mince, de sorte d'éviter de couper trop profondément pour éviter de déchirer l'artère carotide et sous-jacente CTB. Une fois ces couches musculaires sont enlevés, l'artère carotide et le nerf vague doit être clairement visible.
  7. La CTB est juste en dessous de la bifurcation de l'artère carotide. En utilisant des pinces fines (n ° 4 ou pas. 5), émousser disséquer les tissus loin des deux côtés de l'artère carotide pour exposer le ganglion. Utilisation de 2 pinces fines, saisir l'artère carotide juste au-dessus et en dessous des extrémités rostrale et caudale de la CTB, respectivement, de supprimer la section de l'artère carotide située au-dessus de la CTB ainsi que la CTB lui-même. Il est probable que le ganglion nodulaire, qui se trouve à côté de la CTB, à ce stade de développement, sera également supprimé à cette étape. Les ganglions noueux peut être IDENTIFIÉd par sa forme ronde et le nerf vagal grande saillie. Cela se trouve le long d'une des branches de l'artère carotide. En revanche, la CTB est en forme d'amande et se trouve directement sous la bifurcation de l'artère carotide. Placez le tissu disséqué dans un stérile boîte de 35 mm contenant la culture milieu L-15 et des antibiotiques. Retirez la CTB de tous les chiots avant de passer aux prochaines étapes.
  8. En utilisant des pinces fines, séparer délicatement la CTB de l'artère carotide et les autres tissus enlevés lors de la dissection (en particulier le nerf vague et le ganglion noueux). Utilisez une pince fine pour retirer la capsule des ganglions. Ceci réduit considérablement le nombre de cellules non neuronales en culture. Transfert des ganglions à l'autre stérile boîte de 35 mm contenant milieu L-15.
  9. Pour dissocier la CTB, retirez le milieu L-15 et les remplacer par 2 collagénase ml (concentration finale de 1 mg / ml) / dispase (concentration finale de 5 mg / ml) en calcium et en magnésium sans solution saline équilibrée de Hank. Incubationte à 37 ° C pendant 40 minutes.
  10. Transférer la CTB à un stérile tube de 15 ml conique centrifugeuse et porter le volume à 10 ml avec L-15 complété avec de la BSA (concentration finale de 1-2 mg / ml). Centrifuger à 200 g X à température ambiante pendant 5 minutes. Jeter le surnageant et laver une fois de plus avec de la L-15 complété avec de la BSA.
  11. Après le second lavage, enlever tous les L-15 et remettre en suspension les ganglions dans ~ 2 ml de milieu C2. Triturer les cellules en utilisant un incendie poli-plié pointe de la pipette, assurez-vous de la pipette est revêtu d'BSA/L15 avant trituration pour minimiser le collage de cellules sur le verre. Triturer fois doucement 3-4. Que les grosses touffes de régler pendant environ 1 minute et transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 ml conique. Ajouter plus de médias C2 à la CTB reste et triturent. Après avoir laissé les bouquets de régler, de transférer la suspension cellulaire à partir de la trituration deuxième qui a recueilli après la première trituration. Répétez ce processus plusieurs fois jusqu'à ce que les ganglions sont pour la plupart dissocié. Discard les grumeaux restants après la trituration quatrième.
  12. Pour les cellules dissociées d'une portée de chiots de rat (typiquement 12-16 chiots), porter le volume total du fluide dans la suspension cellulaire à 8-10 ml par addition supplémentaire à moyen C2. Resuspendre doucement les cellules à l'aide d'une pipette et enlever une petite partie aliquote de déterminer la densité cellulaire. Réglez le volume de la suspension cellulaire pour atteindre 2 fois la densité cellulaire souhaitée dans la culture, puis, en étant sûr de maintenir les cellules en suspension, partie aliquote de 250 ml de suspension cellulaire par puits. Pour les études morphométriques de la croissance dendritique, nous cellules de la plaque généralement à faible densité (~ 5 x 10 4 cellules par puits) dans des plaques à 24 puits.
  13. Notre laboratoire couve cultures CTB dans dessiccateurs en verre plutôt que directement dans un incubateur à CO 2. Nous faisons cela parce que les neurones sympathiques cultivés dans un milieu sans sérum de meilleurs résultats avec une concentration de CO 2 légèrement plus élevé (environ 6,5%). En outre, nous n'utilisons pas d'antibiotiques dans our des médias, car il inhibe la croissance des neurites et des cultures de maintenir dans les dessiccateurs semble réduire la propagation de la contamination, si elle se développe dans un sous-ensemble des cultures. Grâce à ce système, nous avons l'habitude de maintenir les cultures CTB pour un maximum de 8 semaines. Une fois plaqué, les cultures sont CTB placé sur la plaque de porcelaine dans des dessiccateurs dessicateur en verre contenant de l'eau stérile dans le fond. Environ 120 ml de CO 2 est injecté dans le dessiccateur avant de sceller le fermer et placer le dessiccateur entier dans un ensemble incubateur pour 35,5 ° C

5. Alimentation et entretien des cultures

  1. Les cultures sont généralement nourris 3 fois par semaine, avec le premier échange médias survenant 24 heures après le placage. L'utilisation d'un stérile recourbée pointe de la pipette, retirer délicatement la moitié environ des médias par puits. L'utilisation d'un propre et stérile recourbée pointe de la pipette, remplacer le volume du milieu enlevé avec frais C2.
  2. Pour éliminer les cellules non-neuronales de la culture, l'agent anti-mitotique cytosine-D-arabinofuranoside (ARA-C, concentration finale 1-2 uM) est généralement ajoutée au milieu de culture à la première bourse des médias (par exemple, 24 heures après le placage) pendant 48 heures. Cette concentration de l'ARA-C est généralement suffisant pour éliminer toutes les cellules non-neuronales. Si, en plus d'ARA-C un traitement est nécessaire, il est recommandé que ce soit fait tous les autre alimentation pour minimiser les effets toxiques sur les neurones.

6. Induire la croissance dendritique de Matrigel ou BMP-7

  1. Pour induire la croissance dendritique, Matrigel ou BMP-7 est ajouté aux cultures après cellules non-neuronales ont été éliminés et d'ARA-C les niveaux dans les cultures sont considérablement réduits. En règle générale, nous ajoutons Matrigel ou BMP-7 à la moyenne sur 5 jours in vitro, mais la croissance dendritique peut être induite par Matrigel ou BMP-7 ajoute à tout point dans le temps in vitro. Matrigel ou BMP-7 est ajouté au milieu C2 et les cultures sont alimentés comme décrit ci-dessus.
  2. La croissance Matrigel et BMP-induite dendritique est tempset dépendant de la concentration. Pour l'effet maximal, le Matrigel est ajouté à C2 à une concentration finale de 50-75 mg / ml; BMP-7 est ajouté au milieu C2 à une concentration finale de 50 ng / ml. Concentrations Matrigel de plus de 100 pg / ml ou BMP-7 des concentrations supérieures à 100 ng / ml ont été constatés à provoquer une toxicité neuronale. Processus dendritiques (tel que déterminé par des critères morphologiques) est apparu environ 48 heures après l'exposition initiale à Matrigel ou BMP-7, à des concentrations maximum efficaces. Pour induire la croissance dendritique robuste, les cultures sont nourris avec des BMP-7 contenant un milieu à chaque repas. Des résultats équivalents ont été obtenus en utilisant les MPG 2, 4, 5 et 6 à des concentrations comparables 20,21.

7. Analyse immunocytochimique de la croissance dendritique BMP-7-induite

  1. Lorsque le degré souhaité de arborisation dendritique qui a été réalisé, en utilisant les cultures sont fixés paraformaldéhyde 4% dans un tampon phosphate 0,1 M. La meilleure fixation est unchieved par substitution, la moitié de la moyenne dans le puits avec du paraformaldéhyde 4% et en répétant cette étape 3-5 fois plus 10-15 minutes.
  2. Rincer les cultures en remplaçant la moitié de la paraformaldéhyde à 4% avec un tampon phosphate salin (PBS) et en répétant cette étape trois fois plus de 10 - 15 minutes.
  3. Retirez tout le PBS et ajouter 200 ul 0,1% de Triton X-100 dans du PBS dans chaque puits pendant 5 minutes à température ambiante pour perméabiliser les cellules.
  4. Retirer solution Triton par aspiration et ajouter 200 ul par puits d'une solution tampon de blocage (PBS additionné de BSA 3-5% et du sérum de chèvre 1%). Incuber pendant 20-30 minutes à température ambiante.
  5. Retirez le tampon de blocage et d'ajouter l'anticorps primaire, microtubule-associated protein-2 (MAP2) dilué à 1:2000 - 1:5000 dans le tampon de blocage. Incuber les cultures pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
  6. Retirez la solution d'anticorps primaire, se laver les cultures avec du PBS trois fois plus de 15 minutes à température ambiante.
  7. Incuber les cultures avec l'anticorps secondaire dilué dans du PBS additionné de 1% de BSA pendant 1-2 heures à température ambiante dans l'obscurité.
  8. Retirer la solution d'anticorps secondaire et laver les cultures avec du PBS trois fois plus de 10-15 minutes à température ambiante dans l'obscurité.
  9. Lamelles de montage sur lames de verre côté cellule vers le bas dans une goutte de milieu de montage aqueux au pH approprié pour le fluorochrome marqué à l'anticorps secondaire. Gardez les lames à température ambiante pendant la nuit pour laisser le milieu de montage à sec. Stocker les lames à 4 ° C jusqu'à ce que l'imagerie.
  10. Autoriser les diapositives à s'équilibrer à la température ambiante avant de l'imagerie. Acquérir les images fluorescentes à l'aide d'un microscope à contraste de phase équipé pour épifluorescence. En règle générale, la tonnelle dendritique entière d'un seul neurone peut être capturée à l'aide d'un objectif 20X et des filtres appropriés.

8. Les résultats représentatifs

Neurones sympathiques dissociés de la CTB de transmission périnatale du rats et a grandi en l'absence de sérum et les cellules gliales ganglionnaire ne parviennent pas à étendre MAP2 processus immunopositives (Figure 1), mais plutôt, s'étendent habituellement un seul processus axonale 14,15. L'exposition à BMP-7 (Figure 1) ou Matrigel induit la formation de nombreux processus qui répondent aux critères morphologiques, biochimiques et fonctionnelles des dendrites 17,18. L'activité de promotion de la dendrite soit Matrigel ou BMP-7 est la concentration et temps-dépendante 17,18,20. La croissance dendritique maximale est observée à partir des concentrations de Matrigel entre 50 et 75 pg / ml ou BMP-7 entre 30 et 100 ng / ml, et la moitié du maximum des effets sont généralement observés à des concentrations de BMP-7 de ~ 2 ng / ml. Cependant, des changements importants dans la croissance dendritique peuvent être détectés avec la BMP-7 concentrations aussi faibles que 300 pg / ml. La réponse dendritique soit Matrigel ou BMP-7 est relativement lente, avec <50% des neurones formant un deuxième processus dans les 24 heures après l'exposition soit dendrite-p romouvoir l'agent. Toutefois, dans les 3 jours après le premier BMP-7 l'exposition, pratiquement tous les neurones répondent à un maximum d'efficacité Matrigel ou BMP-7 concentrations. Le nombre de dendrites par les neurones continue d'augmenter avec une exposition continue à BMP-7, avec la plupart des changements qui se produisent au cours des 10 premiers jours de traitement. Après 4 semaines, BMP-7-traités neurones ont généralement 6-8 dendrites primaires qui présentent secondaires, tertiaires et même quaternaires branches dendritiques 17. Cette augmentation de la tonnelle dendritique se produit en l'absence de tout changement significatif dans la croissance axonale, et les réponses dendritiques comparables peut être déclenché à partir des concentrations similaires de PGB 2, 4, 5 ou 6 20,21. La croissance dendritique peut également être obtenue par co-culture de neurones sympathiques avec endogènes ganglionnaires cellules gliales 15,22; cependant, la réponse dendritique est nettement plus lent dans ces conditions.

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Figure 1. BMP-7 favorise la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques. Cellules non-neuronales ont été éliminés de la CTB cultures par un traitement par anti-mitotique pour 48 h le jour du début 2 in vitro. À compter du jour 5 in vitro, les cultures ont été traitées avec un milieu de contrôle (A) ou un milieu supplémenté avec BMP-7 à 50 ng / ml (B). Au jour 11 in vitro (après 5 jours de traitement BMP), les cultures ont été immunomarquées avec mAb contre MAP2, une protéine présente principalement dans les dendrites et les corps cellulaires des neurones. Comme le montre la représentation des microphotographies de fluorescence, les neurones cultivés dans des conditions de contrôle n'ont pas dendrites, comme en témoigne l'absence de MAP-2 dendrites processus immunopositives (A), en revanche, les neurones exposés à BMP-7 (B) ont généralement plusieurs conique MAP-2 immunopositif dendrites.

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Discussion

Les avantages de ce modèle comprennent: (a) les cultures sont composées d'une population homogène de neurones sympathiques dépourvus d'autres types cellulaires 17,23; (b) les exigences du facteur de croissance des neurones sympathiques sont bien établies, ce qui permet l'utilisation de milieu défini, et une variété de milieux définis, et les substrats fonctionnent bien pour la croissance et le maintien de neurones sympathiques 23; (c) les neurones dans ces cultures de répondre uniformément à l'activité dendrite-promotion de Matrigel, BMP-7 et autres PGB du DPP et 60A sous-familles 17,18,20,21; et (d) Matrigel-ou BMP-induite dendrite formation se produit en l'absence de changements de la survie des cellules ou la croissance des axones 17,18. Ce modèle permet un contrôle expérimental du moment où la croissance dendritique est déclenchée, ce qui rend possible d'obtenir des populations de neurones synchronisés à des stades distincts de la croissance dendritique, par exemple, qui précède immédiatement la formation de dendrites, au cours dendr primaireitogenesis (la formation initiale des dendrites primaires) et durant les derniers stades de la maturation dendritique. Les limitations les plus importantes du modèle comprennent les quantités limitées de l'ARN et de protéines disponibles à partir d'une dissection typique d'une seule portée, ce qui peut limiter les études biochimiques, et une certaine difficulté à manipuler l'expression des gènes. Les progrès récents dans les techniques pour exprimer l'ADNc dans des cultures primaires de cellules neuronales sont rapidement remédier à cet inconvénient-ci. Il ya des publications de rapports de l'application réussie des systèmes de prestation à base de lipides, de nucléofection et de vecteurs adénoviraux à des cultures de neurones sympathiques. Les efficacités de transfection signalés sont relativement faibles (allant généralement de 10-20% avec lipofection ou nucléofection et jusqu'à 30-50% à une infection virale), ce qui est suffisant pour les terminaux basés sur des analyses de cellules individuelles, telles que des analyses morphologiques, mais peut-être problématique pour de nombreux paramètres biochimiques.

Facteurs that peut interférer avec la croissance induite par BMP-dendritique dans des cultures de neurones sympathiques incluent la culture des neurones à une densité cellulaire très élevée et dont le sérum dans les milieux de culture. Bien que la raison pour laquelle la densité des cellules de haute atténue l'activité dendrite-promotion des PGB n'est pas connu, il est probable que le sérum atténue cette activité parce que MPG lier avec avidité aux protéines sériques. Fait intéressant, le sérum lui-même a faible dendrite-promotion de l'activité dans les cultures de neurones sympathiques 24, et nos données préliminaires suggèrent que cette activité est médiée par MPG, qui sont présents dans la plupart sinon tous les sérums commerciale. PGB sont également présents dans le Matrigel, et probablement la médiation de son dendrite-promotion de l'activité. Un troisième facteur qui peut avoir un impact de l'activité dendrite-promotion des PGB est une mauvaise manipulation et le stockage des PGB. Ne pas conserver les solutions d'achat d'actions BMP à une concentration inférieure à 0,1 mg / ml. Il est important de ne pas laisser de stock BMP ou des solutions de travail à devenir très basique et nous recommandons que buffers utilisés pour diluer les solutions mères ont un pH de 4,5 ± 0,05. Mélanger toutes les solutions vigoureusement avant aliquotage mais pas si vigoureusement que la mousse de solutions, et de n'utiliser que des tubes en polypropylène, car PGB ont tendance à coller à d'autres plastiques. Ne pas entreposer des portions dans des congélateurs qui ont un dispositif de dégivrage automatique, car le cycle des températures est suffisante pour détruire l'activité de la BMP-7. Il est fortement conseillé que les solutions BMP être stockés à -80 ° C et que le gel-dégel être réduites au minimum (nous ne sommes pas congeler et décongeler plus de 2-3 fois). Des précautions similaires doivent être utilisés dans le traitement de Matrigel. En outre, il est recommandé que Matrigel être décongelé lentement à 4 ° C. Matrigel ne sera pas induire la croissance dendritique lorsqu'il est utilisé à des substrats précouche avant neurones de placage, il n'est efficace que lorsqu'il est ajouté au milieu de culture des cultures de cellules neuronales établies 18.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le financement de la National Institutes of Health (subventions R21 et R01 NS45037 ES014901).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips Bellco Glass 1943-10012 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass
Bent tip pipets Bellco Glass 1273-50003
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899-100MG Stock solution 1 mg/ml
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 15230
Fine forceps Dumont no. 4 and 5 Fine Science Tools 11252-30 11241-30
20-gauge needles BD Biosciences 305176
Leibovitz’s L-15 medium Invitrogen 11415
Collagenase Worthington Biochemical 4176 1 mg/ml
Dispase Roche Group 04942078001 5 mg/ml
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) Invitrogen 14185-052
DMEM Low glucose Invitrogen 11885
L-Glutamine Invitrogen 25030 20 mM
Insulin/Transferrin/ Selenium Invitrogen 51500-056 100X
Fatty-acid free BSA Calbiochem 126609
NGF Harlan Laboratories 5017
Ham F-12 nutrient medium (F-12) Invitrogen 11765
Cytosine arabinoside Sigma-Aldrich C1768
Matrigel BD Biosciences 356234 Avoid repeated freeze-thaw cycles
BMP-7 R&D Systems 345-BP BMP7-07H BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Mouse anti-rat MAP2 antibody Sternberger Monoclonals Inc. SMI52 1/5000
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse Invitrogen A11003 1/10000
Mounting media Molecular Probes, Life Technologies P7481

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References

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