Indurre crescita dendritica in colture di neuroni simpatici

Neuroscience

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Summary

Noi descriviamo un protocollo per l'utilizzo di proteine ​​morfogenetiche dell'osso-7 (BMP-7) o Matrigel per indurre selettivamente la crescita dendritica in primarie neuroni simpatici dissociate dai gangli cervicale superiore (SCG) di ratti perinatali.

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Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P. J. Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons. J. Vis. Exp. (61), e3546, doi:10.3791/3546 (2012).

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Abstract

La forma del dendritico pergolato determina l'ingresso totale sinaptica un neurone può ricevere 1-3, e influenza i tipi e la distribuzione di questi ingressi 4-6. Modelli alterati di crescita dendritica e plasticità sono associate con una compromissione della funzione neuro-comportamentale in modelli sperimentali 7, e si pensa di contribuire a sintomi clinici osservati in entrambi i 8-10 disturbi dello sviluppo neurologico e malattie neurodegenerative 11-13. Queste osservazioni sottolineano l'importanza funzionale di regolare con precisione la morfologia dendritica, e suggeriscono che l'individuazione di meccanismi che controllano la crescita dendritica non solo promuovere la comprensione di come è regolata la connettività neuronale durante lo sviluppo normale, ma possono anche fornire indicazioni sulle nuove strategie terapeutiche per diverse patologie neurologiche.

Studi meccanicistici di crescita dendritica sarebbe molto facilitato dalla disponibilità ofa modello di sistema che permette ai neuroni di essere sperimentalmente passa da uno stato in cui non si estendono ai dendriti quello in cui elaborare un pergolato dendritico paragonabile a quella del loro controparti in vivo. Colture primarie di neuroni simpatici dissociate dai gangli cervicale superiore (SCG) di roditori perinatali fornire tale modello. Quando coltivate in mezzo definito in assenza di cellule gliali e siero gangliare, neuroni simpatici estendere un unico processo che è assonale, e questo stato unipolare persiste per settimane a mesi in coltura 14,15. Tuttavia, l'aggiunta di una proteina morfogenetica ossea-7 (BMP-7) 16,17 o Matrigel 18 al mezzo di coltura innesca questi neuroni di estendere i processi multipli che soddisfano i criteri morfologici, biochimici e funzionali di dendriti. Neuroni simpatici dissociati dal SCG di roditori perinatali e coltivate in condizioni definite sono una popolazione omogenea di 19 neuroniche rispondono in modo uniforme al dendrite-promuovere l'attività di Matrigel, BMP-7 e BMP altri decapentaplegic (DPP) e 60A sottofamiglie 17,18,20,21. È importante, Matrigel e BMP-indotta la formazione di dendrite si verifica in assenza di variazioni nella sopravvivenza cellulare o crescita assonale 17,18.

Qui, descriviamo come impostare dissociate culture di neuroni simpatici derivati ​​dalla SCG di ratti perinatali in modo che siano rispondenti alle selettivo dendrite-promuovere attività di Matrigel o BMP.

Protocol

1. Preparazione del terreno di coltura (media C2)

  1. Aggiungere la seguente, nell'ordine elencato, ad una sterile, monouso beuta da 500 ml Erlenmeyer:
    Quantità Componente Concentrazione finale
    190 ml DMEM (glucosio basso) N / A
    10 ml acidi grassi liberi BSA (20mg/ml in DMEM) 50 ug / ml
    2,8 ml L-Glutammina 1,4 mm
    4 ml insulina / transferrina / selenio (100x) 10 pg / ml di insulina 5,5 ug / ml di transferrina 38,7 nM selenio
    0,4 ml NGF (125 ug / ml) 100 ng / ml
    200 ml Ham F-12 N / A
  2. Agitare delicatamente to mix e aliquota 10 ml per tubo in 17 x 100 provette sterili tappo a scatto.
  3. Conservare a -80 ° C
  4. Note importanti:
    • Scongelare NGF immediatamente prima dell'uso.
    • Prima aliquotando la soluzione NGF stock, prerivestimento le pareti interne della pipetta coltura dei tessuti in plastica sierologico con proteine ​​per ridurre l'appiccicosità del NGF alla plastica. Approccio più semplice è Pipettare la miscela DMEM contenente i tempi di BSA diverse. Risciacquare il tubo NGF più volte con la miscela DMEM.
    • Aggiungi F-12 scorso a causa cisteina libera può destabilizzare i legami disolfuro nel insulina.
    • Non congelare in volumi superiore a 10 ml, perché Capo 4 possono formarsi dei cristalli
    • Non congelare e scongelare mezzo di C2 più di 2 volte.

2. Preparazione di vetrini

  1. Abbiamo trovato che solo belle vetrini tedeschi funziona in modo coerente in questo protocollo (vedi Tabella 1 per l'origine raccomandata e numero di catalogo).
  2. Aggiungere 75-100 ml di acido nitrico 70% di bottiglie di vetro 300 ml campione con politetrafluoroetilene (PTFE o Teflon) rivestimenti coperchio (Catalogo Fisher # 09-911-765).
  3. Indossare guanti, goccia coprioggetto uno ad uno nella soluzione di acido nitrico. Aggiungi coprioggetti abbastanza per fare uno strato non più di 2-3 coprioggetto di spessore sul fondo del vaso.
  4. Scuotere i contenitori con i coprioggetti per 6-8 ore a temperatura ambiente su un set agitatore orbitale per non più di 185 rpm.
  5. Lavorare in una cappa aspirante, con attenzione decantare l'acido e smaltire secondo le normative locali. Sciacquare coprioggetti una volta con ultra-pura coltura di tessuti-grade acqua, poi aggiungere 75-100 ml di acqua nel contenitore. Vetrini coprioggetto può essere sciacquato più volte se l'acqua diventa torbida. Scuotere a temperatura ambiente per una notte su un set agitatore orbitale per non più di 185 giri al minuto.
  6. Ripetere la sequenza sopra di acido nitrico / coltura tissutale acqua di grado al giorno per un totale di 3 giorni.
  7. Decantare la finaledi coltura di tessuti-grade acqua e aggiungere acetone sufficiente a coprire a malapena i coprioggetti.
  8. Decantare questa acetone e smaltire correttamente.
  9. Trasferimento coprioggetti ad un piatto di vetro 150 millimetri Petri. Aggiungi acetone sufficiente a coprire a malapena i coprioggetti. Assicurarsi che i coprioggetti sono in un unico strato nel piatto.
  10. Lasciare evaporare l'acetone durante la notte in una cappa aspirante.
  11. Coprioggetti Cuocere in forno a 180 ° C per 1,5 ore per sterilizzare.

3. Preparazione di Coprivetrini per la Cultura

  1. Il giorno prima della dissezione, aggiungere 1 vetrino coprioggetto (preparato come descritto sopra) a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti coltura tissutale utilizzando una tecnica sterile. Aggiungere 200 pl di sterile poli-D-lisina soluzione (100 mg / ml in 0,5 M tampone Tris, pH 8) a ciascun pozzetto e conservare la piastra a 4 ° C per una notte.
  2. Il giorno della dissezione, e idealmente prima di iniziare la dissezione, aspirare il poli-D-lisina soluzione da ciascun pozzetto e lavare i pozzetti 5 voltecon tessuto sterile cultura dell'acqua grado.
  3. Aggiungere 200 ul low-glucosio DMEM ad ogni piatto e conservare nel 37 ° C incubatore. Circa 1 ora prima della placcatura cellule, rimuovere DMEM low-glucosio e aggiungere 250 microlitri medie C2 per bene. Conservare le piastre a 37 ° C inferiore al 5% di CO 2 fino a quando le cellule sono pronte per essere placcato.

4. Dissezione e isolamento del ganglio cervicale superiore

  1. Dissociate culture di neuroni simpatici sono di solito preparate dissociazione di gangli cervicali superiore (SCG) raccolti da prenatale (giorni embrionali 19-21) cuccioli di ratto perché ci sono meno cellule gliali. Tuttavia, questo stesso protocollo può essere utilizzato con successo con i primi post-natale (da 1 a 3 giorni) cuccioli di ratto o di cuccioli di topo perinatali.
  2. Euthanize ratti femmina in gravidanza tramite CO 2 per inalazione. Shave l'addome e lavare la pelle con il 70% di etanolo. Rimuovere le corna uterine in condizioni sterili e mettere le corna uterine in uno sterile 150 millimetri capsula Petri. Evitaredanneggiare l'intestino o altri organi interni della diga durante la dissezione.
  3. Porre la capsula Petri con i cuccioli su un pan di ghiaccio per anestetizzare i cuccioli embrionali. Staccare gli embrioni liberi della tromba uterina e delle membrane amniotiche. Tagliare il midollo spinale di ogni cucciolo lungo la linea mediana sotto la spalla per l'eutanasia dei cuccioli. Questo taglia anche la vena cava, che riduce sanguinamento dalla carotide durante la dissezione del SCG. Una volta sezionato libera del corno uterino, embrioni posto in una sterile Leibovitz L-15 (o qualsiasi mezzo tamponato aria) addizionato con penicillina e streptomicina.
  4. Mettere gli embrioni sulla schiena su un piatto da 150 millimetri Petri piena a metà di Sylgard. Utilizzando sterili aghi calibro 20, pin il torace e la testa, con delicatezza iperestensione del collo, che facilita la dissezione del SCG.
  5. Effettuare una incisione mediana lungo il collo a livello delle clavicole per rivelare le ghiandole sottomandibolari. Rimuovere le ghiandole con pinza sottile (no. 4 o no. 5 Dumont) per esporre lo strato muscolare.
  6. Utilizzare le pinze sottili per tagliare il muscolo sternocleidomastoideo vicino alla clavicola. Poi sollevare delicatamente e incidere il muscolo omo-ioideo accanto alla trachea. Questo muscolo è molto sottile, in modo da evitare di tagliare troppo in profondità per evitare di strappare l'arteria carotide sottostante e SCG. Una volta che questi strati muscolari vengono rimossi, l'arteria carotide e il nervo vago deve essere chiaramente visibile.
  7. Il SCG si trova appena sotto la biforcazione della carotide. Uso pinza sottile (n. 4 o no. 5), smussare sezionare il tessuto lontano da entrambi i lati della carotide per esporre il ganglio. Utilizzo di 2 pinza sottile, afferrare la carotide appena sopra e sotto le estremità rostrale e caudale di SCG, rispettivamente, per rimuovere la sezione della carotide sovrastante il SCG così come la stessa SCG. È probabile che il ganglio nodoso, che si trova a fianco della SCG in questa fase di sviluppo, verrà rimosso anche in questa fase. I gangli nodoso può essere identified per la sua forma rotonda e il nervo vago grande sporgente da esso. Questo si trova lungo uno dei rami della carotide. Al contrario, il SCG è a mandorla e si trova direttamente sotto la biforcazione della carotide. Posizionare il tessuto sezionato in una piastra da 35 mm sterile coltura contenente L-15 e antibiotici. Rimuovere il SCG da tutti i cuccioli prima di passare alle fasi successive.
  8. Utilizzando una pinza sottile per separare delicatamente il SCG dalla carotide e gli eventuali altri tessuti rimossi durante la dissezione (in particolare il nervo vago e ganglio nodoso). Utilizzare una pinza sottile per rimuovere la capsula dal gangli. Questo riduce notevolmente il numero di cellule non neuronali in coltura. Trasferire la gangli all'altro sterile piastra da 35 mm contenente L-15.
  9. Per dissociare il SCG, rimuovere il mezzo L-15 e sostituirlo con 2 Collagenasi ml (concentrazione finale 1 mg / ml) / dispasi (concentrazione finale 5 mg / ml) di calcio e magnesio privo di Hank soluzione salina bilanciata. IncubaTE a 37 ° C per 40 minuti.
  10. Trasferire il SCG ad un tubo da centrifuga sterile 15 ml e portare il volume fino a 10 ml con L-15 integrato con BSA (concentrazione finale 1-2 mg / ml). Centrifugare a 200 X g a temperatura ambiente per 5 minuti. Eliminare il surnatante e lavare ancora una volta con L-15 integrato con BSA.
  11. Dopo il secondo lavaggio, rimuovere tutti L-15 e risospendere il gangli in ~ 2 ml di terreno C2. Triturare le cellule utilizzando un incendio lucidato piegato punta della pipetta, assicurarsi che la pipetta è rivestita con BSA/L15 prima di triturazione per ridurre al minimo delle cellule attaccare al vetro. Triturare 3-4 volte delicatamente. Lasciate che i grandi ciuffi decantare per circa 1 minuto e trasferire la sospensione di cellule in una provetta da 15 ml. Aggiungere altri supporti C2 alla SCG rimanente e triturare. Dopo aver lasciato le macchie risolvere, trasferire la sospensione cellulare dalla triturazione secondo che ha raccolto dopo la prima triturazione. Ripetere questa operazione più volte fino a quando i gangli sono per lo più dissociati. Discard eventuali grumi rimasti dopo la triturazione quarto.
  12. Per cellule dissociate da un disordine dei cuccioli di ratto (tipicamente 12-16 cuccioli), portare il volume totale del mezzo in sospensione cellulare di 8-10 ml aggiungendo ulteriore mezzo C2. Risospendere delicatamente le cellule usando una pipetta e rimuovere una piccola aliquota per determinare la densità cellulare. Regolare il volume della sospensione cellulare per ottenere 2X la densità cellulare desiderata nella coltura, e quindi, avendo cura di mantenere le cellule in sospensione, aliquota 250 ml di sospensione cellulare per pozzetto. Per gli studi morfometrici della crescita dendritica, di solito le cellule della piastra a bassa densità (~ 5 x 10 4 cellule per pozzetto) in piastre da 24 pozzetti.
  13. Il nostro laboratorio incuba culture SCG in essiccatori di vetro piuttosto che direttamente in un incubatore CO 2. Lo facciamo perché neuroni simpatici coltivate in terreno privo di siero prestazioni migliori con un po 'più alta concentrazione di CO 2 (circa il 6,5%). Inoltre non usare gli antibiotici in omezzi ur quanto inibisce la crescita dei neuriti e le culture mantenendo nelle essiccatori sembra ridurre al minimo la diffusione della contaminazione se si sviluppa in un sottoinsieme di culture. Utilizzando questo sistema, si mantengono normalmente culture SCG per un massimo di 8 settimane. Una volta dorati, culture SCG sono immessi sul piatto di porcellana in essiccatore essiccatori di vetro contenenti acqua sterile sul fondo. Circa 120 ml di CO 2 viene iniettato nel essiccatore prima di sigillare la chiuse e ponendo l'essiccatore intero in un incubatore di 35,5 ° C.

5. Alimentazione e manutenzione delle Culture

  1. Le culture sono generalmente alimentate 3 volte a settimana, con il primo cambio dei media si verificano 24 ore dopo la placcatura. Utilizzando una sterile piegato punta della pipetta, estrarre delicatamente circa la metà dei mezzi di comunicazione per pozzetto. Utilizzando un pulito sterile piegate punta della pipetta, sostituire il volume di terreno fresco rimosso con C2.
  2. Per eliminare le cellule non neuronali dalla cultura, l'anti-mitotico agente cytosine-D-arabinofuranoside (ARA-C, concentrazione finale di 1-2 pM) è tipicamente aggiunto al mezzo di coltura al primo supporto di scambio (ad esempio, 24 ore dopo placcatura) per 48 ore. Questa concentrazione di ARA-C è generalmente sufficiente per eliminare tutte le cellule non neuronali. Se, oltre ARA-C è necessario un trattamento, si raccomanda che questi essere fatto ogni poppata altra per minimizzare gli effetti tossici sui neuroni.

6. Induzione della crescita dendritica con Matrigel o BMP-7

  1. Per indurre crescita dendritica, Matrigel o BMP-7 è aggiunta a colture dopo cellule non neuronali sono stati eliminati e ARA-C livelli le colture sono significativamente ridotte. Tipicamente, si aggiunge Matrigel o BMP-7 al mezzo giorno 5 in vitro, ma crescita dendritica può essere indotta da Matrigel o BMP-7 aggiunto in qualsiasi punto temporale in vitro. Matrigel o BMP-7 è aggiunto al mezzo C2 e colture sono alimentati come descritto sopra.
  2. La crescita Matrigel e BMP-indotta dendritica è il tempoe concentrazione-dipendente. Per effetti massimi, Matrigel è aggiunto a C2 ad una concentrazione finale di 50-75 pg / ml; BMP-7 è aggiunto al mezzo C2 ad una concentrazione finale di 50 ng / ml. Matrigel concentrazioni superiori a 100 pg / ml o BMP-7 concentrazioni superiori a 100 ng / ml sono stati notati per causare tossicità neuronale. Processi dendritiche (come determinato da criteri morfologici) risulteranno approssimativamente 48 ore dopo l'esposizione iniziale di Matrigel o BMP-7 a concentrazioni di massima efficacia. Per indurre una robusta crescita dendritica, le culture sono alimentati con BMP-7 contenente il mezzo ad ogni poppata. Risultati equivalenti sono stati ottenuti utilizzando BMP 2, 4, 5 e 6 a concentrazioni paragonabili 20,21.

7. Analisi immunocitochimica di BMP-7-indotta Growth Dendritic

  1. Quando il grado desiderato di arborizzazione dendritica è stato raggiunto, colture vengono fissati con paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M. La migliore fissaggio è unchieved mezzo sostituendo il mezzo in pozzo con 4% paraformaldeide e ripetere questo passo 3-5 volte 10-15 minuti.
  2. Risciacquare culture sostituendo il mezzo paraformaldeide al 4% con tampone fosfato isotonico (PBS) e ripetere questo passo tre volte più di 10 - 15 minuti.
  3. Rimuovere il PBS e aggiungere 200 pl 0,1% Triton X-100 in PBS ad ogni pozzetto per 5 minuti a temperatura ambiente per permeabile alle cellule.
  4. Rimuovere soluzione Triton tramite aspirazione e aggiungere 200 pl per pozzetto di soluzione tampone di bloccaggio (PBS supplementato con 3-5% BSA e siero di capra 1%). Incubare per 20-30 minuti a temperatura ambiente.
  5. Rimuovere il tampone bloccante e aggiungere l'anticorpo primario, proteina associata ai microtubuli-2 (MAP2) diluito 1:2000 - 1:5000 in tampone di bloccaggio. Incubare colture per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
  6. Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi, lavare le culture con PBS per tre volte nell'arco di 15 minuti a temperatura ambiente.
  7. Incubare le colture con l'anticorpo secondario diluito in PBS integrato con 1% BSA per 1-2 ore a temperatura ambiente al buio.
  8. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e lavare le culture con PBS tre volte più di 10-15 minuti a temperatura ambiente al buio.
  9. Coprioggetti Mount su vetro scivola lato della cella verso il basso in una goccia di mezzo di montaggio acquoso a pH appropriato per il fluorocromo tag per l'anticorpo secondario. Mantenere i vetrini a temperatura ambiente per una notte per permettere al mezzo di montaggio secco. Conservare i vetrini a 4 ° C fino imaging.
  10. Lasciare i vetrini raggiungano la temperatura ambiente prima di imaging. Acquisire immagini fluorescenti utilizzando un microscopio a contrasto di fase dotato di epifluorescenza. In genere, il pergolato dendritica completo di un singolo neurone può essere catturata usando un obiettivo 20X e di appositi filtri.

8. Risultati rappresentativi

Neuroni simpatici dissociati dal SCG di perinatale rats e coltivate in assenza di cellule gliali e siero gangliare non estendere MAP2 processi immunopositive (figura 1), ma piuttosto, in genere si estendono solo un singolo processo assonale 14,15. L'esposizione a BMP-7 (Figura 1) o Matrigel induce la formazione di numerosi processi che soddisfano i criteri morfologici, biochimici e funzionali di dendriti 17,18. Il dendrite-promuovere l'attività di una Matrigel o BMP-7 è la concentrazione e tempo-dipendente 17,18,20. Crescita dendritica massima è osservata usando concentrazioni di Matrigel tra 50 e 75 pg / ml o BMP-7 tra 30 e 100 ng / ml, e metà massimali effetti sono tipicamente osservati a BMP-7 concentrazioni di circa 2 ng / ml. Tuttavia, cambiamenti significativi nella crescita dendritica possono essere rilevate con BMP-7 concentrazioni basse come 300 pg / ml. La risposta a uno dendritico Matrigel o BMP-7 è relativamente lento, con <50% dei neuroni formare un secondo processo entro 24 ore dopo l'esposizione ai dendriti-p ROMUOVERE agente. Tuttavia, entro 3 giorni dopo l'iniziale BMP-7 di esposizione, quasi tutti i neuroni rispondono ad un massimo di efficacia Matrigel o BMP-7 concentrazioni. Il numero di dendriti per neuroni continua ad aumentare con l'esposizione continua a BMP-7, con la maggior parte dei cambiamenti che si verificano durante i primi 10 giorni di trattamento. Dopo 4 settimane, BMP-7-neuroni hanno tipicamente trattati con 6-8 dendriti primari che presentano rami secondari, terziari e anche quaternaria dendritiche 17. Questo aumento arbor dendritica avviene in assenza di qualsiasi variazione significativa crescita assonale, e risposte dendritiche analoghe possono essere provocato usando concentrazioni simili di BMP 2, 4, 5 o 6 20,21. Crescita dendritica può anche essere indotta da co-coltura con neuroni simpatici endogene cellule gliali gangliari 15,22, tuttavia, la risposta dendritica è significativamente più lento in queste condizioni.

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Figura 1. BMP-7 promuove la crescita dendritica in colture di neuroni simpatici. Cellule non neuronali sono stati eliminati dal SCG colture mediante trattamento con anti-mitotico per 48 ore dall'inizio il giorno 2 in vitro. A partire dal giorno 5 in vitro, colture sono stati trattati con mezzo di controllo (A) o medio integrato con BMP-7 a 50 ng / ml (B). Il giorno 11 in vitro (dopo 5 giorni di trattamento BMP), le colture sono state immunomacchiate con mAb contro MAP2, una proteina che si trova principalmente nei dendriti e somata neuronale. Come mostrato in rappresentativi microfotografie fluorescenza, neuroni coltivati ​​in condizioni di controllo mancano dendriti come evidenziato dalla mancanza di MAP-2 dendriti immunopositive processi (A), al contrario, neuroni esposti a BMP-7 (B) hanno tipicamente diverse rastremato MAP-2 immunopositive dendriti.

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Discussion

I vantaggi di questo modello includono: (a) le colture sono costituiti da una popolazione omogenea di neuroni simpatici privi di altri tipi di cellule 17,23, (b) i requisiti per il fattore di crescita di neuroni simpatici sono ben stabiliti, che consente di utilizzare mezzo definito, e una varietà di supporti definiti, e substrati funzionano bene per la crescita e mantenimento neuroni simpatici 23, (c) neuroni in queste colture rispondono uniformemente alla dendrite-attività di promozione di Matrigel, BMP-7 e altre BMP del DPP e 60A sottofamiglie 17,18,20,21, e (d) Matrigel o BMP-indotta la formazione di dendrite si verifica in assenza di variazioni nella sopravvivenza cellulare o crescita assonale 17,18. Questo modello permette il controllo sperimentale di crescita dendritica quando viene attivato, che permettono di ottenere popolazioni sincronizzate di neuroni in fasi distinte di crescita dendritica, ad esempio, che precede immediatamente la formazione di dendriti, durante dendr primariaitogenesis (la formazione iniziale di dendriti primarie) e durante le fasi successive di maturazione dendritica. Le limitazioni più significativi del modello includono la limitata quantità di RNA e proteine ​​disponibile da una dissezione tipica di una cucciolata unico, che può limitare studi biochimici, e qualche difficoltà nella manipolazione genica. I recenti progressi nelle tecniche per esprimere cDNA in colture primarie di cellule neuronali si stanno rapidamente superando questo svantaggio quest'ultimo. Ci sono pubblicazioni di reporting l'applicazione di successo di lipidi sistemi basati su di consegna, nucleofection e vettori adenovirali alle colture di neuroni simpatici. Le efficienze di trasfezione riportati sono relativamente bassa (tipicamente compreso fra 10-20% con lipofezione o nucleofection e fino al 30-50% con infezione virale), che è adeguata per endpoint sulla base delle analisi di cellule individuali, come analisi morfologiche, ma può essere problematico per molti endpoint biochimici.

Fattori that può interferire con BMP-indotta crescita dendritica in colture di neuroni simpatici includono coltivando i neuroni ad una densità cellulare molto elevata e compresi siero nei terreni di coltura. Mentre la ragione che ad alta densità cellulare attenua il dendrite-attività di promozione delle BMP non è noto, è probabile che il siero attenua questa attività perché BMP avidamente legarsi alle proteine ​​del siero. È interessante notare, si ha siero debole dendrite-promuovere l'attività in colture di neuroni simpatici 24, ed i dati preliminari suggeriscono che questa attività è mediata da BMP, che sono presenti nella maggior parte se non tutti i sieri commerciale. BMP sono presenti anche in Matrigel, e probabilmente mediare il suo dendrite-promuovere l'attività. Un terzo fattore che può influire sul dendrite-promuovere l'attività delle BMP è un uso improprio e lo stoccaggio dei BMP. Non conservare soluzioni stock BMP ad una concentrazione inferiore a 0,1 mg / ml. E 'importante non lasciare magazzino BMP o soluzioni di lavoro a diventare molto di base e si consiglia di bufmenti utilizzati per diluire le soluzioni madre hanno un pH di 4,5 ± 0,05. Mescolare tutte le soluzioni energicamente prima aliquotando ma non così vigorosamente che schiuma di soluzioni, e utilizzare solo tubi di polipropilene BMP, perché tendono ad attaccarsi ad altre materie plastiche. Non conservare in freezer aliquote che hanno una funzione di sbrinamento automatico, perché il ciclismo delle temperature è sufficiente a distruggere l'attività di BMP-7. Si raccomanda vivamente che le soluzioni BMP essere conservati a -80 ° C e quella di congelamento-scongelamento essere ridotta al minimo (non congelare-scongelare più di 2-3 volte). Precauzioni simili dovrebbero essere trattati con Matrigel. Inoltre, si raccomanda di Matrigel essere scongelato lentamente a 4 ° C. Matrigel non indurre crescita dendritica quando usato per substrati prestrato prima neuroni placcatura, è efficace solo quando aggiunti al mezzo di coltura di stabiliti colture cellulari neuronali 18.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Institutes of Health (borse NS45037 R21 e R01 ES014901).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips Bellco Glass 1943-10012 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass
Bent tip pipets Bellco Glass 1273-50003
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899-100MG Stock solution 1 mg/ml
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 15230
Fine forceps Dumont no. 4 and 5 Fine Science Tools 11252-30 11241-30
20-gauge needles BD Biosciences 305176
Leibovitz’s L-15 medium Invitrogen 11415
Collagenase Worthington Biochemical 4176 1 mg/ml
Dispase Roche Group 04942078001 5 mg/ml
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) Invitrogen 14185-052
DMEM Low glucose Invitrogen 11885
L-Glutamine Invitrogen 25030 20 mM
Insulin/Transferrin/ Selenium Invitrogen 51500-056 100X
Fatty-acid free BSA Calbiochem 126609
NGF Harlan Laboratories 5017
Ham F-12 nutrient medium (F-12) Invitrogen 11765
Cytosine arabinoside Sigma-Aldrich C1768
Matrigel BD Biosciences 356234 Avoid repeated freeze-thaw cycles
BMP-7 R&D Systems 345-BP BMP7-07H BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Mouse anti-rat MAP2 antibody Sternberger Monoclonals Inc. SMI52 1/5000
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse Invitrogen A11003 1/10000
Mounting media Molecular Probes, Life Technologies P7481

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References

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