قياس إزفاء الببتيد في الحويصلات الكبيرة Unilamellar

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

تفاصيل هذا البروتوكول طريقة لقياس كمية كبيرة إزفاء الببتيد في الحويصلات unilamellar الدهون. هذا الأسلوب يوفر أيضا معلومات حول معدل إزفاء الغشاء ، ويمكن استخدامها لتحديد الببتيدات التي بكفاءة وبشكل عفوي عبر طبقات ثنائية الدهون.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (59), e3571, doi:10.3791/3571 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

هناك اهتمام فعلي في الببتيدات التي عبر أغشية الخلايا بسهولة دون مساعدة من مستقبلات غشاء الخلية 1. ويشار إلى أن العديد من هذه الخلايا واختراق الببتيدات ، والتي كثيرا ما لاحظت لإمكاناتهم وناقلات تسليم المخدرات 1-3. وعلاوة على ذلك ، هناك اهتمام متزايد في الببتيدات المضادة للجراثيم التي تعمل عبر آليات غير غشاء lytic 4،5 ، ولا سيما تلك التي تعبر الأغشية الجرثومي دون أن تسبب تحلل الخلايا وتقتل الخلايا عن طريق التدخل في العمليات داخل الخلايا 6،7. في الواقع ، لقد أشار الكتاب على نحو متزايد إلى العلاقة بين الخلية الببتيدات المضادة للميكروبات واختراق 1،8. الفهم الراسخ لعملية إزفاء الغشاء ، والعلاقة بين هيكل الببتيد وقدرتها على نقل من مكان لآخر يتطلب فعالة ، لإزفاء المقايسات استنساخه. وقد اقترحت عدة مجموعات أساليب لقياس إزفاء في unilamel كبيرةحويصلات الدهنية لار (LUVs) 9-13. LUVs بمثابة نماذج مفيدة لأغشية الخلايا البكتيرية وحقيقية النواة ، وكثيرا ما تستخدم في الدراسات الفلورية الببتيد 14،15. هنا ، ونحن طلبنا من وصف الطريقة التي وضعت في بادئ ماتسوزاكي وزملاء العمل للنظر في الببتيدات المضادة للجراثيم ، مثل magainin buforin والثاني 16،17. بالإضافة إلى توفير بروتوكول لدينا لهذا الأسلوب ، فإننا نقدم أيضا مقاربة مباشرة لتحليل البيانات التي الكمي قدرة إزفاء باستخدام هذا الاختبار. مزايا هذا الاختبار إزفاء بالمقارنة مع الآخرين هي أنه لديه القدرة على تقديم معلومات حول معدل إزفاء غشاء ولا تتطلب إضافة تسمية فلوري ، الذي يمكن أن يغير خصائص الببتيد 18 ، لالتربتوفان التي تحتوي على الببتيدات. لفترة وجيزة ، يتم قياس قدرة إزفاء في الحويصلات الدهون بوصفها وظيفة من طاقة نقل الرنين فوستر (الحنق) بين الأم ومخلفات التربتوفان دansyl فسفاتيديل إيثانولامين عندما ترتبط مع بروتينات الغشاء الخارجي LUV (الشكل 1). والمشقوق اختراق الخلية والببتيدات التي يواجهونها التربسين يحتاطون مغلفة مع LUVs ، مما أدى إلى disassociation من غشاء LUV وانخفاضا في إشارة الحنق. انخفاض الحنق لاحظ إشارة الببتيد translocating أكبر بكثير من تلك التي لوحظت في نفس الببتيد عندما LUVs تحتوي على كل ومثبط التربسين التربسين ، أو عندما يتعرض الببتيد الذي لا يعبر بشكل عفوي الأغشية الدهنية المحتوية على التربسين LUVs. هذا التغيير في مضان يوفر الكمي المباشر لإزفاء الببتيد مع مرور الوقت.

Protocol

1. اعداد كبيرة الحويصلات الدهن Unilamellar (LUVs)

  1. إعداد LUVs لتكون بمثابة غشاء الخلية يحاكي للمقايسة 19.
  2. فسفاتيديل كولين مزيج (POPC ، 760.10 جم / مول) ، phosphatidylglycerol (POPG. 770.99 جم / مول) ، 5 - 1 - dimethylaminonaphthalene السلفونيل فسفاتيديل إيثانولامين (DNS - البابا 994.350 جم / مول) (الدهون أفانتي القطبية) يذوب في الكلوروفورم في 50 : نسبة 45:5. كما في كل مقايسة يتطلب إعداد منفصلة من كلا LUVs التجريبية والسيطرة ، يجب أعد اثنان قارورة كعكة الدهون. 0،376 ملغ من الدهون الكلية (0.188 ملغ POPC ، 0،169 ملغ POPG و0.019 ملغ DNS - البابا) هو عادة ما تكون كافية لجعل الحويصلات كافية لإجراء محاكمة إزفاء واحد.
  3. تتبخر قبالة كلوروفورم باستخدام تيار غاز N 2.
  4. تجفيف الكعكة الدهون 9-14 ساعات في مجفف فراغ.
  5. إعداد المخزون 10 العازلة HEPES حل ملم (HEPES 10 مم ، 238.3 غرام / مول ، 45 مم كلوريد الصوديوم ، 58.44 جم / مول ، 1 ملم EDTA ، 372.24 جم / مول درجة الحموضة 7.4). هو الحادي HEPES العازلةored في 4 درجة مئوية.
  6. إعداد محلول المخزون بنسبة 0.4 ملي الخنزيري التربسين (23.3 كجم / مول) في 10 ملي العازلة HEPES أعد أعلاه. يتم تخزين التربسين في -20 درجة مئوية ، وممارستنا ، وعادة لا تخضع لأكثر من 2 تجميد أذاب دورات قبل الاستخدام.
  7. إعداد محلول المخزون من 4.0 ملي مثبط التربسين - Birk بومان (8 كغ / مول) في 10 ملي حل العازلة HEPES وتخزينها في -20 درجة مئوية. في استخدامنا ، يتم تجديد هذا المخزون الشهري وعادة لا تخضع لتجميد أكثر من 3 / دورات ذوبان الجليد قبل أن يتم ذلك مرة أخرى.
  8. إعادة حويصلات الصفاحات التجريبية (MLVs) في محلول 0.2 ملي التربسين بإضافة حجم مساو من 0.4 ملي التربسين الأسهم و 10 ملي العازلة HEPES حل للكعكة الدهون المجففة. لعينة واحدة من الدهن الكلي 0.376 ملغ ، وهي مزيج من 150 ميكروليتر من محلول التربسين و 150 ميكرولتر من العازلة HEPES كافية.
  9. MLVs إعادة السيطرة في التوصل إلى حل مع التربسين ملي 0.2 و 2.0 مم مثبط التربسين بومان ، Birk بإضافة حجم مساو من 0.4 الأسهم التربسين ملي و 4.0 ملي مثبط التربسين إلى الدهون الكعك المجفف. لعينة واحدة من الدهن الكلي 0.376 ملغ ، وهي مزيج من 150 ميكروليتر من محلول التربسين و 150 ميكرولتر من مثبط التربسين كافية.
  10. نقل الحلول MLV من قوارير الزجاج إلى 1.7 مل أنبوب microcentrifuge.
  11. موضوع MLV حلول لدورات تجميد / الذوبان 5 في النيتروجين السائل.
  12. إعداد الطارد الدهون (الدهون أفانتي القطبية) التي تؤيد مرشح وضعت اثنين مبلل في HEPES العازلة على كل قطعة تفلون الطارد. مكان غشاء المسار nuclepore محفورا بنسبة 0.1 مسام ميكرون (Whatman ، المملكة المتحدة) في فترة ما بين قطعتين الطارد تفلون ، ووضع قطعة معدنية الطارد داخل علبة الطارد. هل وضع على قطعة دونات الطارد اثنين قبل تشديد أعلى من علبة معدنية الطارد ووضعه في حامل.
  13. ملء حجم الفراغ داخل الطارد مع 500 ميكرولتر 10 ملي HEPES العازلة باستخدام محقنة 250 ميكرولتر الزجاج لمنع فقدان عينة حويصلة </ لى>
  14. تحميل كل عينة MLV في الطارد ، ودفع من خلال عينة من الغشاء لا يقل عن 21 مرات لضمان موحدة حجم الحويصلة unilamellar. ويتم الحصول على LUVs التالية من قذف MLV الحل.
  15. LUVs تخزين عند 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون 48 ساعة.

2. قياس تركيز LUV

  1. وكان تركيز LUV كميا عن طريق تحديد محتوى الفوسفور الكلي في العينة 20.
  2. إعداد 8.9 NH 2 SO 4 في المياه وتخزينها nanopure في درجة حرارة الغرفة.
  3. يعد 2.5 ٪ ث / ت موليبدات الأمونيوم السادس (588.04 جم / مول) حل في الماء nanopure. يعد حمض الاسكوربيك 10 ٪ ث / ت (176.1 غرام / مول) حل في الماء nanopure. حماية حل حمض الاسكوربيك من التعرض للضوء من خلال تغطية أنبوب مع احباط. تخزين كل الحلول في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  4. إعداد 0.65 العازلة الفوسفات حل ملم (أحادي القاعدة فوسفات الصوديوم اللامائية ، و 120 غرام / مول).
  5. إعداد ست القياسية توبيز. وينبغي أن تتضمن معايير 0.0 ميكرولتر ، 50 ميكرولتر (0.0325 μmoles) ، و 100 ميكرولتر (0،065 μmoles) ، و 175 ميكرولتر (0،114 μmoles) ، و 250 ميكرولتر (0،163 μmoles) ، أو 350 ميكروليتر (0،228 μmoles) من حل الفوسفور.
  6. إعداد LUV أنابيب العينات في ثلاث نسخ. يجب على كل أنبوب عينة تحتوي على ما يقرب من 0.1 μmoles من LUVs. التجريبية والسيطرة LUV يجب أن تقاس تركيزات بشكل منفصل.
  7. لتصحيح أي أملاح الفسفور المجففة في مسحوق مثبط - Birk بومان ، وهو السيطرة LUV يجب أن يكون مستعدا فارغة. يجب أن فارغة تحتوي على نفس الحجم من 0.2 ملي ملي حل trypsin/2.0 مثبط بومان ، Birk كما وضعت في السيطرة LUV أنبوب العينة.
  8. مكان 450 ميكرولتر من 8.9 NH 2 SO 4 في كل من العينة ، ومعيار ، وأنابيب فارغة.
  9. عينات من الحرارة ، والمعايير ، والفراغات لمدة 25 دقيقة في 175-210 درجة مئوية في فرن.
  10. إزالة جميع الأنابيب والسماح لهم لتبرد. إضافة 150 ميكرولتر من 30 ٪ H 2 O 2 إلى كل من توبيز.
  11. عينات من الحرارة ، والمعايير ، والفراغات لمدة 30 دقيقة في 175-210 درجة مئوية.
  12. إزالة عينات ، والمعايير ، والفراغات من الحرارة. إذا كان أي من الحلول ليست بعد عديم اللون ، وإضافة 50 ميكرولتر H 2 O 2 إلى أنابيب جميع والحرارة لمدة 15 دقيقة إضافية على 175-210 درجة مئوية.
  13. إضافة 3.9 مل nanopure H 2 O ، و 0.5 مل من محلول النشادر موليبدات و 0.5 مل من محلول حامض الاسكوربيك في كل أنبوب.
  14. جميع أنابيب الحرارة لمدة 5-7 دقائق في حمام ماء يغلي.
  15. قياس امتصاص كل معيار وعينة في 820 نانومتر باستخدام 8453 اجيلنت الكروماتوجراف الأيوني. ينبغي استخدام أنبوب يحتوي على 0.0 mmoles الفسفور كما فارغة لجميع المعايير والتجريبية LUV العينات. وينبغي استخدام الأنبوب الذي يحتوي على 0.2 ملي ملي trypsin/2.0 حل المانع بومان ، كما Birk فارغة لمراقبة LUV العينة.
  16. يمكن أن تنتج محتوى الفوسفور الامتصاصية مقابل منحنى خطي القياسية والمستخدمة لحساب مجموع phosphorus LUV المحتوى وتركيز العينات.

3. إعداد حلول الببتيد

  1. حل الببتيد في 2 nanopure O. H يجب أن الببتيدات المستخدمة في هذا الاختبار كما هو موضح تحتوي على واحد بقايا التربتوفان.
  2. قياس الامتصاصية من الحل الببتيد بمبلغ 282 نانومتر في ثلاث نسخ. حساب تركيز الببتيد باستخدام معامل الانقراض المولي لالتربتوفان من 5700 سم -1 م -1.
  3. تمييع الببتيد في الماء nanopure إلى التركيز النهائي 30 ميكرومتر. المحل في -20 درجة مئوية

4. إزفاء الكمي

  1. إعداد نماذج تجريبية والتحكم في أنابيب 1.7 مل microcentrifuge. إضافة إلى ما يكفي من LUVs كل حل نهائي للتركيز من 250 ميكرون. إضافة يكفي بومان ، Birk حل المانع المانع بحيث يتم التركيز النهائي 10X أكبر من تركيز التربسين. إضافة يكفي العازلة HEPES 10 ملم إلى تحقيق حجم الحل النهائي إلى 450 ميكروليتر.
  2. <لى> حل مكان الببتيد 50 ميكرولتر في خلية صغيرة Starna مقياس التألق الكوارتز. النسبة بين LUVs والببتيد مرتفعة بما يكفي لضمان أن جميع الببتيدات سليمة في القرب قريبة بما فيه الكفاية لمجموعة دانسيل لإعطاء إشارة الحنق حتى لو أن أحدا translocated في الحويصلة. وهذا يتفق مع الحنق لاحظت في ظروف مماثلة لمراقبة الببتيدات التي لا تفعل ذلك نقل من مكان لآخر داخل الحويصلات.
  3. إضافة العينة التجريبية أو التحكم إلى حل الببتيد في كفيت. هذا يجب اعادة تركيز الببتيد النهائي إلى 3 ميكرومتر.
  4. بدء تجربة حركية 25 دقيقة الفلورسنت فور إضافة التجريبية أو السيطرة LUV الحل ، مع قراءة مضان على الأقل مرة في الثانية الواحدة. تعيين الطول الموجي الإثارة عند 280 نانومتر ، والطول الموجي 525 نانومتر في الانبعاثات ، ودرجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية. استخدام الطيف كاري الإسفار الكسوف ، وضعنا PMT لحساسية عالية.

5. توليد نسبة الكمية إزفاء

  1. تعريف مضان الأولية (F س) والقراءة مضان بعد خمس عشرة ثانية لجمع البيانات. في الإعداد أداتنا ، وجدنا أن أول خمس عشرة ثانية من البيانات التي تم جمعها مضان لا يعول عليها بسبب الاختلاط ، وإغلاق غرفة العينة ، وغير ذلك من الاضطرابات في النظام بالإضافة إلى عينة. تقسيم كل قراءة لاحقة بواسطة فهرنهايت للحصول على مضان النسبي (F / F 0) في كل نقطة زمنية.
  2. متوسط ​​جميع القراءات النسبية مضان من الدقيقة الأخيرة من التجربة النهائية للحصول على مضان النسبي المتوسط [F / FO] التقييم .
  3. تقسيم [F / FO] التقييم لعينات سيطرة [F / FO] التقييم لنماذج تجريبية للحصول على تصحيح قيمة مضان النهائي.
لو "> 6. النتائج الممثل

الشكل 2 يبين نتائج هذا الفحص عن ممثل الببتيد التي أظهرت إزفاء قوية. إشارة في هذه التجربة (أسود التتبع) يظهر انخفاضا ملحوظا في إشارة الحنق على مر الزمن. ومع ذلك ، فمن المهم للتحكم عن الخسارة المحتملة للإشارة الحنق بسبب تثبيط التربسين ناقصة أو عوامل أخرى لا علاقة لها القدرة إزفاء. تحقيقا لهذه الغاية ، ونحن دائما أيضا قياس إشارة الحنق بين الببتيد وتحتوي على كل LUVs التربسين وبومان ، Birk التربسين المانع (رمادي التتبع ، الشكل 2). في أيدينا ، فقد كان من المهم أن تؤدي هذه السيطرة على كل الببتيد في كل مرة يتم تشغيل التجربة. وهذا يسمح لنا لتصحيح بوضوح عن أية تغييرات في إشارة إلى أي نتيجة الاختلافات بين الاستعدادات حويصلة الدهون أو ضوضاء الصك ، والتي يمكن أن تكون كبيرة بالنسبة للإشارات ضعيفة نسبيا الفلورسنت احظ عادة في هذه التركيزات.

أهمية السيطرة بةومن ابرز riment باستخدام LUVs تحتوي التربسين المانع من البيانات الواردة في الشكل 3. في هذه الحالة ، فقد انخفض إشارة الببتيد كمية مماثلة لتلك التي في الشكل 2 في العينة التجريبية (تتبع السوداء). ومع ذلك ، فإن نموذج التحكم أكثر انخفاضا سريعا لهذا الببتيد ، لذلك إزفاء صافي أقل.

المادة 5 من بروتوكول يصف لنا طريقة واضحة لقياس إزفاء من هذه التجربة. نسب أعلى إزفاء تدل على الببتيدات التي نقل من مكان لآخر بكفاءة ، ونسبة إزفاء لالببتيد اختراق الخلية هو مبين في الشكل 2 هو 1.16 ، في حين أن الببتيدات ضعيفة translocating وقد نسب إزفاء أقرب إلى 1. في تجربتنا ، والخطأ المعياري لأداء ثلاث تجارب مستقلة مع الاستعدادات الحويصلة المختلفة في مجموعة من 0،01-0،06.

الشكل 1
الشكل 1. التخطيطي لtranslocatايون مقايسة. LUV عينات تجريبية (A) هي مخدر مع البابا دانسيل الفلورسنت (القضبان السوداء) وتحتوي على مغلفة التربسين (المقص). يستخدم مثبط التربسين (دائرة حمراء) لكبح التربسين خارج LUVs. يتعرض لLUVs الببتيد (اللون الأرجواني). الببتيد بالتعاون مع LUV الأغشية تعطي إشارة الحنق (الأخضر) الذي يتناقص مع الببتيدات translocting قاء التربسين الداخلية غير مأهولة. يتم تغليف كل من التربسين ومثبط التربسين في السيطرة LUV عينات (B) لقياس الانخفاضات في إشارة الحنق لا علاقة لها إزفاء.

الشكل 2
الشكل 2. بيانات تمثيلية للالببتيد اختراق الخلية. ممثل translocating pepide مضادات الميكروبات تظهر انخفاضا كبيرا في إشارة الحنق مقارنة سيطرتها.

الشكل 3
شخصية3. بيانات تمثيلية تسليط الضوء على أهمية السيطرة. تثبيط غير كاملة الهضم زيتية من الببتيد غير translocating يؤدي إلى انخفاض في إشارة الحنق على مر الزمن في كل من التجريبية والسيطرة LUV الحلول. لأن الفرق بين المراقبة والتعقب تجريبية صغيرة نسبيا ، ويتميز هذا المسخ والببتيد translocating ضعيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويمكن استخدام بروتوكول المعروضة هنا لتقييم التغير النسبي في تركيز الببتيد داخل وخارج حويصلات الدهنية. وترتبط هذه التغييرات القدرة إزفاء. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد الخلايا اختراق الببتيدات مع إمكانات وناقلات تسليم المخدرات. كما مصلحة في اختراق الخلية الببتيدات ينمو ، فإنه سيكون من المثير رؤية كيف يتم تطوير أساليب لقياس الحدث مباشرة إزفاء واستخدامها بطريقة كمية.

في مختبرنا وجدنا أنه يمكن تحسين اتساق مقايسة من خلال مراقبة بعناية بضعة جوانب معينة من التجربة. أولا ، على حد سواء الكمي للحويصلات التجريبية والسيطرة على تحسين الاتساق في النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول. هذا الاختبار يعتمد أيضا على القدرة على الكشف عن مضان دقيقة الأولي قبل بداية إزفاء البروتين والهضم. لذا ، فمن الضروري للfluoreيتعرض scence جمع إشارة البدء في أقرب وقت للبروتين أو ببتيد إلى حل LUV. هذا الاختبار هو أيضا حساسة للمثبط التربسين سيما المستخدمة حتى الآن ، لقد حصلنا على نتائج أكثر اتساقا مع مثبط التربسين - Birk بومان (سيغما T - 9777). الأهم من ذلك ، على درجة من التدهور الملحوظ في سيناريوهات السيطرة يبدو أن تتفاوت تفاوتا كبيرا بين الببتيدات (كما هو مبين في الشكلين 2 و 3) وفي بعض الحالات بين مختلف الأعمال التحضيرية للحويصلة الببتيد نفسه. هذا تشدد كذلك على الحاجة إلى تشغيل التحكم مع كل النسخ التجريبية. كعنصر تحكم إضافية ، يمكن للمرء أيضا قياس استجابة لالحنق الببتيد تتعرض لعينة لا تحتوي حويصلة مثبط التربسين ولا التربسين. ومع ذلك ، هذه السيطرة لا توفر أي معلومات إضافية ما هو ضروري من أجل تقييم البيانات لإزفاء الببتيد.

واحد قلق هو أن غشاء lytic الببتيدات يمكن permeabilize الغشاء بما فيه الكفاية لأو تسمح التربسين التربسين المانع للسفر عبر الغشاء. لقد تبين أن الببتيدات المستخدمة في الأمثلة في هذه الورقة أن تسبب القليل permeabilization الغشاء. ومع ذلك ، فإن العديد من الأغشية lytic الببتيدات هي أيضا قابلة لهذا والمقايسات إزفاء مماثلة 9،16،21،22. وهذا هو الأرجح لأن الصوت هو أكبر بكثير من خارج داخل الحويصلات. وبالتالي ، فإن أي التربسين التي يمكن التسرب من حويصلة تثبطها مثبط التربسين الزائدة ، ومنع أي انشقاق من الببتيد خارج الحويصلة. وهكذا ، نتيجة ايجابية من هذا الاختبار يدل على الأرجح أن الببتيد translocates بينما تسبب اضطراب الغشاء ضئيلة نسبيا ، ومنع المانع من تسرب إلى الحويصلات. بغض النظر ، يجب أن توصيف دقيق لخصائص الببتيد تتضمن تقييما للpermeabilization الغشاء.

هذا الاختبار هو قابل للتكيف لطائفة متنوعة من الظروف التجريبية. بالنظر إلى أن يقاس إزفاء بوصفها متعةction من الحنق إشارة بين البروتين والأغشية ، كما هو موضح هذا الاختبار هو أفضل مناسبة لالبروتينات والببتيدات التي ترتبط بها تلقائيا ، مع LUVs أنيوني ، تحتوي على واحد والتربتوفان وبقايا قطع التربسين مواقع بالقرب من بقايا التربتوفان. القرب من التريبتوفان إلى موقع قطع يضمن أن تحتوي على جزء التربتوفان لها قابلية غشاء ضئيلة ، وبالتالي لا تذكر الحنق الإشارة. ومع ذلك ، يمكن للمرء أيضا استخدام الببتيدات تحتوي على التيروزين أو غيرها moities الفلورسنت كيميائيا مترافق مع الحويصلات التي تحتوي على الحنق المناسبة المتقبلة. وبالمثل ، يمكن استبدالها بأخرى التربسين البروتيني الذي يستهدف مواقع بديلة في خفض الببتيد من الفائدة. ومع ذلك ، قد تغيير ومثبط الإنزيم تتطلب التحسين إضافية منذ بعض trypsins المتاحة تجاريا ومثبطات التربسين أدى إلى عدم الاستقرار أو تجميع عينات من الحويصلة. عن طريق تغيير تركيبة الدهون لLUVs ، يمكن أيضا أن يستخدم هذا الاختبار لتحديد دورهذا الاتهام أو الدهون يلعب في تحديد هيكل إزفاء الببتيد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا أن يكون هذا الاختبار تكييفه بسهولة لتوفير سرعة عالية قياسات إزفاء في نهج مماثل لWimley وزملاء العمل 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر اليانور فليمينغ وتشن جيسيكا لإجراء مناقشات مفيدة. تم توفير التمويل من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIH - NIAID) جائزة R15AI079685 ومؤسسة البحوث كلية العلوم جائزة كوتريل. وقدمت دعما إضافيا من الطلاب من معهد هوارد هيوز الطبي وصندوق ستالي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16:0-18:1 PG Avanti Polar Lipid, Inc 840457C
1:18 Dansyl PE Avanti Polar Lipid, Inc 810330C
16:0-18:1 PC Avanti Polar Lipid, Inc 850457C
Porcine trypsin Sigma-Aldrich T-0303
Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor Sigma-Aldrich T-9777
Mini-extruder Avanti Polar Lipid, Inc 610000
Ammonium molybdate (para) Alfa Aesar 10811
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A1417
Hydrogen Peroxide, 30% solution Mallinckrodt Baker Inc. 5240-05
HEPES Sigma-Aldrich H-3375
NaCl Sigma-Aldrich S-9625
EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S-0751

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they? Biochem. J. 399, (1), 1-1 (2006).
  2. Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58, (2), 209-209 (2004).
  3. Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9, (23), 1012-1012 (2004).
  4. Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5, (6), 951-951 (2007).
  5. Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276, (22), 6464-6464 (2009).
  6. Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61, (7), 2978-2978 (1993).
  7. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244, (1), 253-253 (1998).
  8. Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17, (5), 335-335 (2011).
  9. Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. (2011).
  10. Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345, (2), 387-387 (2005).
  11. Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89, (4), 2513-2513 (2005).
  12. Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochemistry. 44, (30), 10189-10189 (2005).
  13. Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788, (7), 1523-1523 (2009).
  14. Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother? Anal. Biochem. 285, (2), 235-235 (2000).
  15. Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
  16. Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. Biochemistry. 39, (29), 8648-8648 (2000).
  17. Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. Biochemistry. 34, (19), 6521-6521 (1995).
  18. Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579, (20), 4498-4498 (2005).
  19. Torchilin, V. P., Weissig, V. Liposomes. Oxford University Press. New York. (2003).
  20. Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. Biochemistry. 1686, (34), 8083-8083 (2009).
  21. Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry. 43, (49), 15610-15610 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics