Mesure translocation peptide dans de grandes vésicules unilamellaires

Biology

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Summary

Ce protocole décrit une méthode pour la mesure quantitative de la translocation de peptide dans de grandes vésicules lipidiques unilamellaires. Cette méthode fournit également des informations sur le taux de translocation membranaire et peut être utilisé pour identifier des peptides qui servent efficacement et spontanément croisée bicouches lipidiques.

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Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (59), e3571, doi:10.3791/3571 (2012).

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Abstract

Il ya un intérêt actif dans les peptides qui traversent facilement les membranes cellulaires sans l'aide de récepteurs membranaires des cellules 1. Beaucoup d'entre eux sont appelés peptides de pénétration cellulaire, qui sont souvent connus pour leur potentiel en tant que vecteurs de délivrance de médicaments 1-3. Par ailleurs, il ya un intérêt croissant dans des peptides antimicrobiens qui opèrent à travers la membrane des mécanismes non lytiques 4,5, en particulier ceux qui traversent les membranes bactériennes sans causer la lyse des cellules et tuer les cellules en interférant avec les processus intracellulaires 6,7. En fait, les auteurs ont de plus souligné la relation entre les peptides de pénétration cellulaire et antimicrobiennes 1,8. Une bonne compréhension du processus de translocation membranaire et de la relation entre la structure peptide et sa capacité à déplacer doivent être effectives, des dosages reproductibles pour la translocation. Plusieurs groupes ont proposé des méthodes pour mesurer la translocation dans unilamel grandevésicules lipidiques LAR (LUV) 9-13. LUV servir de modèles utiles pour les membranes cellulaires des bactéries et eucaryotes et sont fréquemment utilisés dans les études peptide fluorescent 14,15. Ici, nous décrivons notre application de la première méthode développée par Matsuzaki et collègues à considérer les peptides antimicrobiens, tels que magainine et buforin II 16,17. En plus d'offrir notre protocole pour cette méthode, nous présentons également une approche simple pour l'analyse de données qui quantifie la capacité de translocation par ce test. Les avantages de ce test de translocation par rapport aux autres est qu'il a le potentiel de fournir des informations sur le taux de translocation membranaire et ne nécessite pas l'ajout d'un marqueur fluorescent, ce qui peut modifier les propriétés de peptides 18, peptides contenant du tryptophane. En bref, la capacité de translocation dans les vésicules lipidiques est mesurée en fonction du transfert Foster Resonance Energy (FRET) entre les résidus tryptophane natif et dansyl phosphatidyléthanolamine lorsque les protéines sont associées à la membrane externe LUV (figure 1). Pénétration cellulaire des peptides sont clivés en tant qu'ils rencontrent trypsine désinhibée encapsulé avec le GVU, conduisant à la dissociation de la membrane LUV et une baisse de signal de FRET. La baisse du signal de FRET observé pour un peptide translocation est significativement supérieure à celle observée pour la même peptide lorsque la LUV contiennent à la fois de la trypsine et l'inhibiteur de trypsine, ou quand un peptide qui n'apparaît pas spontanément de traverser les membranes lipidiques est exposé à la trypsine contenant LUV. Ce changement de fluorescence fournit une quantification directe de la translocation de peptide dans le temps.

Protocol

1. Préparation des grandes vésicules lipidiques unilamellaires (LUV)

  1. Préparer LUV pour servir de membrane de la cellule imite pour le dosage 19.
  2. Phosphatidylcholine Mix (POPC, 760,10 g / mol), phosphatidylglycérol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyle phosphatidyléthanolamine (DNS-PAPE, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) dissous dans du chloroforme dans un 50 : ratio de 45:5. Comme chaque dosage nécessite la préparation séparée de LUV à la fois expérimentale et de contrôle, deux flacons gâteau lipidique doit être préparé. 0,376 mg de lipides totaux (0,188 mg de POPC, 0,169 POPG mg et 0,019 mg DNS-PAPE) est généralement suffisant pour fabriquer des vésicules assez pour un essai de translocation unique.
  3. Evaporer le chloroforme en utilisant un flux de gaz N 2.
  4. Sécher le gâteau lipides 9-14 heures dans un dessiccateur à vide.
  5. Préparer un stock de 10 mM de solution tampon HEPES (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM de NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). Tampon HEPES est erored à 4 ° C.
  6. Préparer une solution stock de 0,4 mM trypsine porcine (23,3 kg / mol) dans 10 mM de tampon HEPES préparé ci-dessus. La trypsine est stocké à -20 ° C et, dans notre pratique, n'est généralement pas soumis à plus de 2 cycles gel-dégel avant utilisation.
  7. Préparer une solution stock de 4,0 mM d'inhibiteur de Bowman-Birk trypsine (8 kg / mol) dans 10 mM de tampon HEPES solution et conserver à -20 ° C. Dans notre usage, ce stock est réapprovisionné tous les mois et n'a généralement pas l'objet de plus de 3 cycles de gel / dégel, avant qu'il ne soit fait à nouveau.
  8. Reconstituer expérimentale vésicules multilamellaires (MLV) dans une solution 0,2 mM trypsine en ajoutant un volume égal de trypsine 0,4 mM d'actions et 10 mM solution de tampon HEPES au gâteau des lipides séchés. Pour un seul échantillon de 0.376 mg de lipides totaux, d'un mélange de 150 pi de solution de trypsine et 150 uL de tampon HEPES est suffisante.
  9. MLV contrôle Reconstituer dans une solution avec 0,2 mM trypsine et 2,0 mM de Bowman-Birk inhibiteur de la trypsine en ajoutant un volume égal à 0.4 mM trypsine stock et 4,0 mM d'inhibiteur de trypsine aux gâteaux secs lipides. Pour un seul échantillon de 0.376 mg de lipides totaux, d'un mélange de 150 pi de solution de trypsine et 150 uL d'inhibiteur de trypsine est suffisante.
  10. Transfert des solutions MLV partir des flacons en verre de 1,7 ml microtube.
  11. Sujet MLV solutions à 5 cycles gel / dégel dans l'azote liquide.
  12. Préparer des lipides extrudeuse (Avanti Polar Lipids) en plaçant deux supports de filtre imbibé dans du tampon HEPES sur chaque pièce en téflon extrudeuse. Placez une membrane Nuclepore piste gravé avec 0,1 um pores (Whatman, Royaume-Uni) entre les deux pièces extrudeuse téflon et placer les morceaux à l'intérieur du bidon extrudeuse extrudeuse métal. Placer l'entretoise beigne sur les morceaux extrudeuse deux avant serrage du haut de la cartouche métallique de l'extrudeuse et le placer dans le support.
  13. Remplissez le volume de vide au sein de l'extrudeuse avec 500 mM HEPES uL tampon de 10 avec une seringue en verre de 250 uL de prévenir la perte de l'échantillon vésicule. </ Li>
  14. Chargez chaque échantillon MLV dans l'extrudeuse et pousser l'échantillon à travers la membrane au moins 21 fois pour assurer l'uniformité de taille des vésicules unilamellaires. LUV sont obtenus à partir de l'extrusion MLV suivantes solution.
  15. LUV Conserver à 4 ° C et utiliser dans les 48 heures.

2. Quantifier LUV concentration

  1. LUV concentration a été quantifiée par la détermination de la teneur en phosphore total dans l'échantillon 20.
  2. Préparer 8,9 H 2 SO 4 dans l'eau nanopure et stocker à température ambiante.
  3. Préparer un 2,5% p / v d'ammonium molybdate VI (588,04 g / mol) solution dans l'eau nanopure. Préparer un acide ascorbique à 10% p / v (176,1 g / mol) solution dans l'eau nanopure. Protéger la solution d'acide ascorbique à partir exposition à la lumière en couvrant le tube de papier d'aluminium. Stocker à la fois des solutions à 4 ° C pour un maximum de 2 mois.
  4. Préparer une solution 0,65 mM de tampon phosphate (phosphate monobasique de sodium anhydre, 120 g / mol).
  5. Préparez six standards TUbes. Les normes devraient contenir 0,0 ul, 50 ul (0,0325 umol), 100 pl (0,065 umol), 175 uL (0,114 umol), 250 ul (0.163 pmol), ou 350 pi (0,228 umol) de solution de phosphore.
  6. Préparer LUV tubes d'échantillons en trois exemplaires. Chaque tube échantillon ne devrait contenir environ 0,1 micromoles de LUV. Expérimentaux et de contrôle des concentrations LUV doit être mesuré séparément.
  7. Afin de corriger tous les sels de phosphore dans la poudre séchée inhibiteur de Bowman-Birk, un contrôle LUV vierge doit être préparé. Le blanc doit contenir le même volume de la solution de 0,2 mM trypsin/2.0 mM inhibiteur de Bowman-Birk comme cela a été placée sous le contrôle LUV tube d'échantillon.
  8. Placer 450 ul de 8,9 H 2 SO 4 dans chacune des échantillons, standards et tubes vides.
  9. Échantillons de chaleur, des normes, et des flans pendant 25 minutes à 175-210 ° C dans un four.
  10. Retirez tous les tubes et les laisser refroidir. Ajouter 150 ul de 30% de H 2 O 2 à chacun des TUbes.
  11. Échantillons de chaleur, des normes et des flans pour 30 minutes à 175-210 ° C.
  12. Retirer les échantillons, les normes, et des flans de la chaleur. Si aucune des solutions ne sont pas encore incolore, ajouter 50 ul de H 2 O 2 à l'ensemble des tubes et de chaleur pour un 15 minutes supplémentaires à 175-210 ° C.
  13. Ajouter 3,9 ml nanopure H 2 O, 0,5 ml de solution de molybdate d'ammonium et 0,5 ml d'acide ascorbique solution à chaque tube.
  14. Chauffer tous les tubes pendant 5-7 minutes dans un bain d'eau bouillante.
  15. Mesurer l'absorbance de chaque standard et échantillon à 820 nm en utilisant un Agilent 8453 spectrophotomètre UV-visible. Le tube contenant 0,0 mmoles de phosphore doit être utilisé comme le blanc pour toutes les normes et expérimentales LUV échantillons. Le tube contenant le 0,2 mM trypsin/2.0 solution MM inhibiteur de Bowman-Birk devrait être utilisé comme le blanc pour le contrôle LUV échantillon.
  16. Une courbe linéaire absorbance vs le phosphore contenu standard peut être produite et utilisée pour calculer le total des phosphOrus contenu et LUV concentration des échantillons.

3. Préparation des solutions Peptide

  1. Dissoudre peptide dans nanopure H 2 O. Les peptides utilisés dans ce dosage comme décrit doit contenir un résidu tryptophane.
  2. Mesurer l'absorbance de la solution de peptide à 282 nm en trois exemplaires. Calculer la concentration de peptide en utilisant le coefficient d'extinction molaire pour le tryptophane de 5700 M -1 cm -1.
  3. Diluer peptide dans l'eau nanopure à une concentration finale de 30 uM. Conserver à -20 ° C

4. Quantification de translocation

  1. Préparer les échantillons expérimentaux et de contrôle dans 1,7 ml microtubes. Ajouter LUV suffisant pour chaque solution pour une concentration finale de 250 uM. Ajouter suffisamment de solution d'inhibiteur de Bowman-Birk sorte que l'inhibiteur est une concentration finale 10X supérieure à la concentration de trypsine. Ajouter suffisamment de tampon HEPES 10 mM pour porter le volume solution définitive à 450 pi.
  2. <li> Place 50 uL solution de peptide dans une cellule Starna micro fluorimètre quartz. Le rapport entre LUV et le peptide est suffisamment élevée pour assurer que pratiquement tous les peptides intacts sont suffisamment près d'un groupe dansyle de donner un signal de FRET, même si aucun n'a transloqué dans la vésicule. Ceci est cohérent avec le FRET similaires observés dans des conditions de contrôle pour des peptides qui font et ne translocation dans les vésicules.
  3. Ajouter l'échantillon expérimental ou de contrôle pour la solution de peptide dans la cuvette. Cela devrait amener la concentration finale de peptide à 3 uM.
  4. Commencer un 25 minutes expérimentation fluorescents cinétiques immédiatement après ajout d'expérimentation ou de contrôle LUV solution, prendre une lecture de fluorescence au moins une fois par seconde. Régler la longueur d'onde d'excitation à 280 nm, la longueur d'onde d'émission à 525 nm, et la température à 25 ° C. L'utilisation d'un spectrophotomètre Cary Eclipse de fluorescence, nous avons mis la sensibilité PMT à élevé.

5. Génération d'un ratio de translocation quantitatives

  1. Définir fluorescence initiale (F o) que la lecture de fluorescence après quinze secondes de la collecte de données. Dans notre configuration de l'appareil, nous avons constaté que les quinze premières secondes de données de fluorescence recueillie ne sont pas fiables en raison de mixage, la fermeture de la chambre d'échantillonnage, et d'autres perturbations dans le système lors de l'addition de l'échantillon. Divisez chaque lecture ultérieure par F o pour obtenir fluorescence relative (F / F 0) à chaque point de temps.
  2. Moyenne de tous les relevés relatifs de fluorescence de la dernière minute de l'expérience pour obtenir une finale de fluorescence relative moyenne [F / Fo] avg .
  3. Divisez la [F / Fo] avg pour les échantillons de contrôle par le [F / Fo] avg pour les échantillons expérimentaux pour obtenir une valeur corrigée finale de fluorescence.
Le "> 6. résultats représentatifs

La figure 2 montre les résultats de ce dosage pour un peptide représentant qui a montré une translocation robuste. Le signal dans cette expérience (noir trace) montre une baisse marquée de signal de FRET au fil du temps. Cependant, il est important de contrôler la perte potentielle de signal de FRET due à l'inhibition de trypsine incomplète ou d'autres facteurs non liés à la capacité de translocation. À cette fin, nous avons toujours aussi mesurer le signal de FRET entre le peptide et LUV contenant à la fois de la trypsine et de Bowman-Birk inhibiteur de la trypsine (gris trace, figure 2). Dans nos mains, il a été important d'effectuer ce contrôle pour chaque peptide à chaque fois une expérience est exécuté. Cela nous permet de bien correct pour tout changement de signal due à des différences entre les préparations de vésicules lipidiques ou le bruit instrument, qui peut être important pour les signaux relativement faibles fluorescents généralement observée à ces concentrations.

L'importance de l'expérience de contrôleriment avec LUV contenant l'inhibiteur de trypsine est mis en évidence par les données de la figure 3. Dans ce cas, le peptide signal diminué d'un montant similaire à celui de la figure 2 dans l'échantillon expérimental (trace noire). Toutefois, l'échantillon de contrôle montre une diminution plus rapide pour ce peptide, donc sa translocation nette est inférieure.

L'article 5 de notre protocole décrit une méthode simple pour quantifier la translocation de cette expérience. Ratios de translocation supérieur sont révélateurs de peptides qui translocation efficace; le ratio de translocation pour le peptide pénétrant la cellule de la figure 2 est de 1,16, tandis que faiblement peptides ont des ratios de translocation translocation proche de 1. Dans notre expérience, l'erreur standard pour trois expériences indépendantes réalisées avec des préparations de vésicules différents dans la gamme de 0,01 à 0,06.

Figure 1
Figure 1. Schéma du translocattest d'ions. expérimentale LUV échantillons (A) sont dopés par fluorescence PAPE dansyle (barres noires) et contiennent encapsulés trypsine (ciseaux). Inhibiteur de la trypsine (cercle rouge) est utilisée pour inhiber la trypsine en dehors de la LUV. Les LUV sont exposées au peptide (violet). Peptide association avec les membranes des rendements LUV un signal de FRET (verte) qui diminue à mesure que les peptides translocting rencontre désinhibée trypsine interne. Tant la trypsine et l'inhibiteur de trypsine sont encapsulées dans le contrôle LUV échantillons (B) pour mesurer la diminution du signal de FRET rien à voir avec la translocation.

Figure 2
Figure 2. Des données représentatives pour un peptide de pénétration cellulaire. Un représentant translocation pepide antimicrobiens montre une baisse significative de signal de FRET par rapport à son contrôle.

Figure 3
Figure3. Des données représentatives soulignant l'importance de la commande. Inhibition incomplète de la digestion tryptique d'un peptide non-translocation entraîne une baisse de signal de FRET au fil du temps dans les deux expérimentaux et de contrôle LUV solutions. Parce que la différence entre le contrôle et la trace expérimentale est relativement faible, ce mutant est caractérisé comme un peptide faiblement translocation.

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Discussion

Le protocole présenté ici peut être utilisé pour évaluer la variation relative de la concentration des peptides à l'intérieur et en dehors des vésicules lipidiques. Ces changements sont liés à la capacité de translocation. Ce protocole peut être utilisé pour identifier des peptides de pénétration cellulaire avec un potentiel en tant que vecteurs de délivrance de médicaments. Comme l'intérêt pour les peptides de pénétration cellulaire se développe, il sera intéressant de voir comment les méthodes qui mesurent directement l'événement de translocation sont développées et utilisées de manière quantitative.

Dans notre laboratoire, nous avons constaté que la cohérence de l'essai peut être améliorée en surveillant attentivement les quelques aspects particuliers de l'expérience. Tout d'abord, la quantification des vésicules à la fois expérimentaux et de contrôle améliore la cohérence des résultats obtenus en utilisant ce protocole. Ce test dépend aussi de la capacité de détecter une fluorescence initial précis avant le début de la translocation de protéines et la digestion. Par conséquent, il est essentiel pour la Fluorela collecte du signal scence de commencer dès que la protéine ou le peptide est exposée à la solution LUV. Ce dosage est également sensible à l'inhibiteur de la trypsine particulier utilisé; à ce jour, nous avons obtenu les résultats les plus cohérents avec Bowman-Birk inhibiteur de trypsine (Sigma T-9777). Surtout, le degré de dégradation observés dans les scénarios de contrôle semble varier considérablement entre les peptides (comme souligné dans les Figures 2 et 3) et, dans certains cas entre les préparations de vésicules différents pour le même peptide. Cela renforce la nécessité d'exécuter une commande à chaque réplication expérimentale. Comme contrôle supplémentaire, on pourrait aussi mesurer la réponse de FRET pour le peptide exposés à un échantillon de vésicules contenant ni trypsine ni inhibiteur de la trypsine. Toutefois, ce contrôle ne fournit aucune information supplémentaire qui est nécessaire afin d'évaluer les données pour la translocation des peptides.

Une préoccupation est que la membrane des peptides pourrait-lytique perméabiliser la membrane assez pourpermettent la trypsine ou d'inhibiteur de trypsine de voyager à travers la membrane. Les peptides utilisés pour des exemples dans ce document ont été montré pour causer perméabilisation de la membrane peu. Néanmoins, de nombreux peptides lytiques membrane sont également favorable à cette translocation et des essais similaires 9,16,21,22. C'est probablement parce que le volume est beaucoup plus extérieur que l'intérieur des vésicules. Ainsi, toute la trypsine que les fuites hors de la vésicule peut être inhibée par l'inhibiteur de trypsine excès, empêchant tout clivage du peptide en dehors de la vésicule. Ainsi, un résultat positif de ce test indique vraisemblablement un peptide qui translocation tout en causant des perturbations membrane relativement minime, empêchant l'inhibiteur de fuir dans les vésicules. Peu importe, une caractérisation approfondie des propriétés de peptides doit comporter une évaluation de perméabilisation de la membrane.

Ce test se prête à une adaptation pour une plus grande variété de conditions expérimentales. Étant donné que la translocation est mesurée comme un amusementction des signal de FRET entre la protéine et la membrane, tel que décrit ce dosage est mieux adapté aux protéines et des peptides qui se sont spontanément s'associer avec LUV anioniques, contient un résidu tryptophane et ont des sites coupés à proximité de la trypsine résidu tryptophane. La proximité de la tryptophane à un site coupé assure que le fragment contenant du tryptophane a une affinité négligeable de membrane, et donc un signal de FRET négligeables. Toutefois, on pourrait aussi utiliser des peptides contenant de la tyrosine ou d'autres conjugués chimiquement moities fluorescentes avec des vésicules contenant une appropriée FRET accepteur. De même, la trypsine pourrait être remplacée par une autre protéase qui cible les sites coupés alternative dans un peptide d'intérêt. Toutefois, en modifiant l'enzyme et l'inhibiteur peut exiger optimisation supplémentaire puisque certains trypsines disponibles dans le commerce et les inhibiteurs de trypsine conduit à l'agrégation ou l'instabilité des échantillons vésicule. En modifiant la composition lipidique de la LUV, ce test peut aussi être utilisé pour déterminer le rôleque la charge lipidique ou la structure joue dans la détermination de la translocation des peptides. De plus, ce test pourrait également être facilement adapté pour fournir à haut débit des mesures de translocation dans une approche similaire à celle de Wimley et co-travailleurs 9.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Eleanor Fleming et Jessica Chen pour des discussions utiles. Le financement a été fourni par l'Institut national des maladies allergiques et infectieuses (NIAID-NIH) et un Prix R15AI079685 Research Corporation Cottrell College Science Award. Soutien aux élèves supplémentaires ont été fournis par le Howard Hughes Medical Institute et le fonds de Staley.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16:0-18:1 PG Avanti Polar Lipid, Inc 840457C
1:18 Dansyl PE Avanti Polar Lipid, Inc 810330C
16:0-18:1 PC Avanti Polar Lipid, Inc 850457C
Porcine trypsin Sigma-Aldrich T-0303
Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor Sigma-Aldrich T-9777
Mini-extruder Avanti Polar Lipid, Inc 610000
Ammonium molybdate (para) Alfa Aesar 10811
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A1417
Hydrogen Peroxide, 30% solution Mallinckrodt Baker Inc. 5240-05
HEPES Sigma-Aldrich H-3375
NaCl Sigma-Aldrich S-9625
EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S-0751

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